Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fedt kroppen organsystem kultur i Aedes Aegypti, en vektor af Zika Virus

Published: August 19, 2017 doi: 10.3791/55508
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 4, 1,5
1Department of Biology, New Mexico State University, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University, 3Department of Computer Sciences, New Mexico State University, 4Department of Epidemiology of Microbial Diseases, Yale School of Public Health, 5Institute of Applied Biosciences, New Mexico State University

Summary

Fedt kroppen er det centrale metaboliske orgel i insekter. Vi præsenterer et levende orgel kultur system, der gør det muligt for brugeren at studere isolerede fedt kropsvæv reaktioner på forskellige stimuli.

Abstract

Insekt fedt kroppen spiller en central rolle i insekt metabolisme og næringsstof opbevaring, spejling funktion af leveren og fedtvæv i hvirveldyr. Insekt fedt kropsvæv er normalt fordelt i hele insekt kroppen. Det er dog ofte koncentreret i maven og fastgjort til kroppen bugvæggen.

Myg fedt kroppen er den eneste kilde til æggeblomme proteiner, som er kritiske for ægproduktion. Derfor, i vitro kultur af myg fedt kropsvæv repræsenterer et vigtigt system til studiet af myg fysiologi, stofskifte, og i sidste ende ægproduktionen. Fedt krop kultur proces begynder med udarbejdelsen af løsninger og reagenser, herunder aminosyre stamopløsninger, Aedes fysiologisk kogsaltopløsning salt stamopløsning (APS), calcium stamopløsning og fedt kroppen næringssubstratet. Processen fortsætter med fedt kroppen dissektion, efterfulgt af en eksperimentel behandling. Efter behandling, kan en række forskellige analyser udføres, herunder RNA sekventering (RNA-FF.), qPCR, Western blotting, proteomics og metabolomics.

I vores eksempel eksperiment vise vi protokollen gennem excision og kultur af fedt organer fra gul feber myg, Aedes aegypti, en vigtigste vektor af arboviruses herunder dengue, chikungunya og Zika. RNA fra fedt organer kulturperler under en fysiologisk tilstand kendt at upregulate æggeblomme proteiner versus kontrol blev udsat for at demonstrere den potentielle nytte af denne procedure for undersøgelser af genekspression RNA-Seq analyse.

Introduction

Myg er vektorer af ødelæggende sygdomme hos mennesker, herunder malaria, dengue feber, chikungunya og Zika1,2,3. Trods intens internationale bestræbelser på at dæmme op for disse sygdomme og til at kontrollere overførsel af sygdom mosquito befolkninger, er epidemisk udbrud af myg-bårne sygdomme stadig almindelige, især i udviklingslandene. Effektive vacciner mod mange af disse sygdomme er enten ikke tilgængelige eller begrænsede effektivitet4,5. Den mest effektive måde at forebygge udbrud er at kontrollere mosquito befolkninger, primært gennem brug af insekticidbehandling. Insekticidresistens har dog udviklet sig i mange mosquito befolkninger og blive et fælles problem omkring verden6,7,8. Studiet af myg fysiologi er afgørende for udviklingen af nye redskaber og strategier til at kontrollere sygdommen.

Myg fedt kroppen spiller en central rolle i næringsstof opbevaring, metabolisk homøostase, reproduktion og xenobiotiske katabolisme9,10,11,12. Det er den vigtigste opbevaring organ for triglycerider, glykogen og aminosyrer i form af oplagring proteiner. Det fungerer også som placeringen af syntese for de fleste hemolymph proteiner og metabolitter. I myg er fedt kroppen den eneste kilde til æggeblomme protein produktion, der opstår i hunner, når de tager en blodmel13,14.

Den vigtigste celletype fedt kroppen er store, polyploide trophocyte eller adipocyt3,9,10,12. Fedt kropsvæv er organiseret i lapper eller skeder og kan findes i alle dele af kroppen af myg, med den største del ligger i maven, hvor store kamre af fedt kroppen er fastgjort til kroppen bugvæggen.

Myg fedt kroppen kultur system præsenteres her blev udviklet i 70 ' erne og er stadig et stærkt værktøj til at studere fedt kroppens fysiologi10, især i kombination med aktuelle analyse teknologi. Grundlaget for denne teknik er baseret på dyrkning af abdominal organ væggene og de tilknyttede fedt kropsvæv. Den hydrofobe karakter af abdominal neglebånd får det til at flyde på overfladen af næringssubstratet, med vedlagte lapper af abdominal fedt kroppen nedsænket. Spirakler og tracheolar struktur er vedligeholdt, sikrer iltning af kulturperler væv. Fremover, vil vi henvise til disse præparater som "fedt organer." Isolerede fedt organer forbliver levedygtige i mere end 12 timer når inkuberes i den passende medium (ikke-offentliggjorte resultater). Fedt krop kultur er et værdifuldt redskab, der har behandlet en række spørgsmål vedrørende fedt kroppen endokrinologi og fysiologi9,10,12,15,16, 17.

Kulturperler fedt organer kan blive udsat for forskellige eksperimentelle og styre behandlinger, timing som kan besluttes af investigator. I slutningen af inkubationstiden, kan fedt organer indsamles og behandles til downstream analyser, herunder qPCR16,17,18,19, Western blotting18 ,20, proteomics21eller metabolomics22. Eksperimenter kan udføres på forskellige skalaer, fra individuelle fedt organer til grupper af hundredvis, der kan dyrkes sammen.

De repræsentative resultater inkluderet her var afledt af fedt organer kulturperler aminosyrer og steroid hormon 20-hydroxy ecdysone at simulere blodmel aktivering af vitellogenesen16,17, 23,24. Vi analyseret og sammenlignet den differentiale genekspression af ikke-aktiveret versus aktiveret fedt organer via næste generation sequencing analyse.

Protocol

1. forberedelse af løsninger og reagenser

  1. aminosyre stamopløsning
    1. Forbered en 4 X aminosyre stamopløsning 23 , 24 ved vejning og de 20 forskellige aminosyrer tilføjes i en Erlenmeyerkolbe ifølge de koncentrationer, der er angivet i tabel 1.
      Bemærk: I nogle tilfælde, amino acid(s) kan være udelukket fra opløsningen og erstattet af lige store kindtand mængder af mannitol at opretholde et lig koncentration af osmolytes.
    2. Tilføje den passende mængde af Hedeselskabet 2 O at producere det ønskede antal løsning.
    3. Til at sikre, at aminosyrerne har fuldstændigt opløst, varme forsigtigt under konstant omrøring, indtil væsken er helt klart, det vil tage på en lille gul nuance.
      Bemærk: Det kan være nødvendigt at reducere pH 6 ved at tilføje HCl til at tillade nogle af de mere hydrofobe aminosyrer til at opløse.
    4. Alikvot løsningen og steril-filter ved hjælp af en sprøjte filter med en 0,2 µm pore størrelse.
    5. Opbevares i en lukket beholder ved-20 ° C i op til 6 måneder.
  2. APS
    Bemærk: Se 25.
    1. For 20 X salt stamopløsning, kombinere salte er opført i tabel 2 i 50 mL vand. Rør indtil opløst.
      Bemærk: Det kan være nødvendigt at lidt varme løsning for at opløse salte.
    2. Sterilt-filter ved hjælp af en sprøjte filter med en 0,2 µm pore størrelse og gemme løsningen i en 50 mL tube på -20 ° C.
  3. Calcium stamopløsning
    1. til 50 X calcium stamopløsning tilsættes 0,90 g calciumchlorid til 100 mL vand (tabel 3), rør indtil opløst.
    2. Sterilt-filter ved hjælp af en sprøjte Opløsningen filtreres med en 0,2 µm porestørrelse, alikvot i 50 mL rør, og opbevares ved -20 ° C.
  4. Tris buffer (pH 7,4)
    1. For Tris buffer, kombinere salt og løsninger, der er anført i tabel 4 og tilføje ddH 2 O op til 100 mL.
    2. Sterilt-filter ved hjælp af en sprøjte Opløsningen filtreres med 0,2 µm porestørrelse og alikvot i 50 mL rør, opbevares ved stuetemperatur.
  5. Fedt kroppen næringssubstratet
    1. for at forberede fedt kroppen næringssubstrat, forberede alle løsninger der er anført ovenfor.
    2. Kombinere dem som bind i tabel 5 at gøre 200 mL af fedt kroppen næringssubstratet.
    3. PH indstilles til 7.2 ved hjælp af NaOH eller HCl.
    4. Sterilt-filter løsning ved hjælp af en sprøjte filter med en porestørrelse 0,2 µm.
    5. Inddeler løsningen i 15 mL alikvoter og opbevares ved-20 ° C i op til 6 måneder.

2. Forberede dissektion

  1. forberede et stereomikroskop (10-20 x forstørrelse) med belysning og lægge ud to ultra-fine pincet og en micro dissektion saks.
  2. Forberede alle løsninger nødvendige for eksperimentet. Tø fedt kroppen næringssubstrat til stuetemperatur.
    Bemærk: Precipitants kan opløses ved forsigtigt opvarmning løsning ikke højere end 30 ° C.
  3. Med en betjent sug, indsamle voksne kvindelige myg (3-7 dage efter fremkomsten) og bedøver dem ved hjælp af CO2- eller ice.
    Bemærk: Når bedøvede, myg bør holdes under CO 2 for kortest tid muligt, højst 20 min. Alternativt, myg kan bedøvede på is og holdes i ca 30 min.
  4. Udarbejde en 6-godt plade med 3 mL APS pr. brønd.

3. Fedt kroppen dissektion

  1. fokusere dissekere stereomikroskopet og justere stol til en behagelig højde.
  2. Placerer en konkav objektglas på mikroskop overflade og tilføje to dråber af APS til byens.
  3. Afhente en myg af et ben med en pincet og overføre det til APS overfladen på objektglas.
  4. Omhyggeligt greb myg af brystkassen, med pincet i venstre hånd, og drej myg, så den ventrale side er opad.
  5. Mens du holder kroppen stabil af brystkassen, forstå de to sidste abdominal segmenter med pincet i højre hånd, og træk forsigtigt.
    Bemærk: De to sidste abdominal segmenter vil adskille fra maven og vedlagte æggestokke, Malpighian-tubuli, stortarmen og midgut; undertiden vil afgrøden glide ud af maven. Hvis de ikke er blevet fjernet, indsætte de lukkede tips af pincet i det lille hul lavet og fjerne de resterende væv.
  6. Afsætte den rigtige pincet og afhente foråret saks. Skub en kniv ind i hullet i maven op til segment under brystkassen. Hurtigt og forsigtigt skære maven på langs.
    Bemærk: Når snittet er foretaget, maven skal begynde at udvide udad, men dette ikke kan ske straks.
  7. Fortsætte med at gøre det andet snit, som vil være et tværgående snit under brystkassen og lidt under hvor den første snit sluttede.
    Bemærk: Maven skal derefter åbne og tage afstand fra brystkassen, med neglebånd op og fedt organer side nedsænket i APS. Dette organ bugvæggen er fedt kroppen forberedelse til i vitro kultur.
  8. Lift fedt organer fra APS løsning ved hjælp af spidsen af et par pincet og overføre dem fra løsningen til 6-godt pladen som indeholder APS ved stuetemperatur. Tillad væv til hvile i ca. 0,5 h inden man rykkede til fedt krop kultur.

4. Fedt krop kultur

  1. inkuberes fedt organer på APS ved stuetemperatur til mindst 0,5 h til Reagensglasset dem.
  2. Overføre fedt organer ved hjælp af spidsen af pincet og løfte forsigtigt dem ud af APS-løsning. Sænke spidsen ind i fedt kroppen næringssubstratet.
    Bemærk: Selve fedt bør åbne på overfladen af medium og flyde frit. Fedt krop kultur er typisk udføres i 96-brønd plader, med 150-200 µL af medium i hver brønd. Et godt kan passe op til tre individuelle fedt organer, og de er rentabelt for mere end 12 h (upubliceret personlige resultater).
  3. Efter inkubationstid, overføre fedt organer fra medium til 1,5 mL centrifugeglas indeholdende de passende reagenser til downstream forarbejdning.
    Bemærk: Typiske analyser omfatter qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western blotting 18 , 20, transcriptomics 26, proteomics 21 eller metabolomics 22.

Representative Results

Som et eksempel, vi udført en fedt krop kultur eksperiment og stimuleret isolerede fedt organer ved at inkubere dem på en løsning, der indeholder en afbalanceret blanding af alle tyve naturligt forekommende aminosyrer og insekt steroid hormon 20-hydroxy ecdysone (10 µM) til 6 h . Som kontrol, blev fedt organer rugede på APS for et tilsvarende beløb af tid.

Efter inkubation blev den samlede RNA isoleret ved hjælp af en tri-reagens27 efter fabrikantens anvisninger. Kvaliteten og kvantiteten af ekstraheret RNA prøver blev vurderet ved hjælp af et spektrofotometer, fluorometriske kvantitering og Agarosen gelelektroforese. RNA sekventering biblioteker blev genereret ved hjælp af 4 µg af total RNA og var kvantificeres ved hjælp af to forskellige teknikker. Bibliotekerne blev efterfølgende sendt til en kommerciel udbyder parrede ende-sekventering.

Resultaterne af dette forsøg er vist i tabel 6. Generne viser den stærkeste transcriptional svar på amino syre og 20-hydroxyecdysone var primært æggeblomme protein gener, som er i overensstemmelse med tidligere resultater11.

Figur 1 viser en zonekort, der angiver gen expression niveauer af 1,256 varierende udtrykte gener fra kulturperler fedt organer efter to forskellige behandlinger.

Figure 1
Figur 1 . Zonekort af gener udtrykt i fedt krop kultur. Zonekort var beregnet på baggrund af antallet af specifikke udskrifter for hvert gen i de forskellige biblioteker ved hjælp af heatmap pakke28 der er en del af R Softwaremiljø. Mørkere nuance repræsenterer højere genekspression. 1,256 gener med statistisk signifikant variation i udtrykket (Q-værdier < 0,05) er vist. Generne er ordnet efter deres gennemsnit udtryk niveauer, angivet med dendrogram til venstre (ikke efter deres fylogenetiske relationer). Bemærk det høje antal gener med op - eller nedreguleret udtryk efter stimulation med aminosyrer (AA) og 20-hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes fysiologisk saltvand. Se supplerende fil 1 en liste af gener og deres relative udtryk niveauer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Aminosyre Molekylær vægt g/mol mM koncentration mg pr. Liter mg til 300 mL volumen
Alanin 89,1 26.68 2377.19 713.16
Arginin 174.2 26.68 4647.66 1394.3
Asparagin 150.1 26.68 4004.67 1201.4
Asparaginsyre 133 26.68 3548.44 1064.53
Cystein 121.16 10.68 1293.99 388.2
Glutaminsyre 147.1 26.68 3924.63 1177.39
Glutamin 146 26.68 3895.28 1168.58
Glycin 75 53.32 3999 1199.7
Histidin 155,16 80 12412.8 3723.84
Isoleucin 131 10.68 1399.08 419.72
Lycine 183 26.68 4882.44 1464.73
Leucin 131 26.68 3495.08 1048.52
Phenylalanin 165 10.68 1762.2 528.66
Prolin 115 26.68 3068.2 920.46
Serin 105 53.32 5598.6 1679.58
Threonin 119 10.68 1270.92 381.28
Tryptofan 204 10.68 2178.72 653.62
Tyrosin 181 5,32 962.92 288.88
Valin 117 10.68 1249.56 374.87
Methionin 149 10.68 1591.32 477.4

Tabel 1. 4 x aminosyre stamopløsning.

Komponent Vægt i gram føjet til 50 ml ddH2O
NaCl 8,0 g
KCl 0.074 g
MgCl2-6 H2O 0.120 g
NaHCO3 0.0250 g

Tabel 2. 20 X salt stamopløsning.

Komponent Vægt i gram tilsættes 100 ml ddH2O
CaCl2-2 H2O 0,90 g

g > tabel 3. 50 x calcium stamopløsning.

Komponent Koncentrationen af stamopløsningen Volumen lager for 100 ml buffer
Tris pH8.0 1 M 5 mL
EDTA 0,25 M 2 mL
NaCl NA 0,3 g
Hedeselskabet2O NA til 100 mL (~ 93 mL)

Tabel 4. Tris buffer.

Komponent Volumen lager for 200 ml
Aminosyre stamopløsning 150 mL
Salt stamopløsning 10 mL
Calcium stamopløsning 4 mL
TES Buffer 10 mL
ddH2O 26 mL

Tabel 5. Fedt kroppen næringssubstratet.

Anmærkning Gen beskrivelse Fold ændring P-værdi
AAEL006138 Vitellogeninproduktion-B 3443 2.52E-112
AAEL006126 Vitellogeninproduktion-C 2795 8.64E-91
AAEL006563 vitellogenic carboxypeptidase 1002 2.17E-119
AAEL010434 Vitellogeninproduktion-A 220 1.14E-27
AAEL006542 vitellogenic carboxypeptidase 185 2.14E-65
AAEL012678 AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%) 96 4.00E-70
AAEL000080 hypotetiske protein 82 6.69E-188
AAEL015312 Vitellogenic cathepsin B 77 1.27E-15
AAEL009588 nukleare receptor 3 75 4.58E-56
AAEL010529 hypotetiske protein 66 1.32E-29

Tabel 6. Eksperimentelle resultater.

Supplerende fil 1. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Insekt orgel kultur blev brugt i udstrakt grad at studere insekt Endokrinologi, udvikling og metabolisme samt undersøge samspillet mellem specifikke organer og bakteriel symbionter29,30,31, 32,33,34. In vitro fedt kroppen orgel kultur var bruges specifikt til at studere aminosyre transport og regulering af æggeblomme protein produktion i myg og andre Diptera16,17,35 , 36. i løbet af processen af vitellogenesen, myg fedt kroppen bruger en bred vifte af high-specificitet aminosyre transportvirksomheder til at importere blodmel-afledte aminosyrer fra hemolymph til at syntetisere store mængder af æggeblomme proteiner12 ,19,35,36. Fedt krop kultur var medvirkende til afgrænsningen af fedt kroppen ernæringsmæssige krav i denne forbindelse18.

Kvalitet af råvaren, kvindelige myg, er afgørende for en vellykket gennemførelse af disse forsøg. Myg larver rejst i henhold til overfyldt forhold og fodres på high-næringsstof kost normalt giver de bedste resultater. Der er nogle vigtige variabler at overveje, når oprettelse af myg fedt krop kultur betingelser i laboratoriet for eksperimentel design. Vi viste i tidligere undersøgelser, at fedt kroppen genekspression varierer betydeligt afhængigt af de individuelle livshistorie og ernæringsmæssige status af myg11,22. Myg kultur betingelser bør være ensartet at reducere variation i størrelse og ernæringsmæssige reserver af eksperimentelle myg. Derudover bør personale udfører dissektioner være uddannet til at sikre hurtig og præcis dissektioner med ensartede resultater. Cellernes levedygtighed i isolerede fedt organer kan kontrolleres ved hjælp af forskellige farvning metoder37,38.

Den eksperimentelle design af et fedt krop kultur eksperiment bør tages højde antallet af dissektioner muligt i en given periode. Når store mængder af fedt organer er påkrævet, kan flere dissektion sessioner eller flere dissectors være nødvendigt. Der er en bred vifte af fremtidige ansøgninger om in vitro- fedt krop kultur i myg og andre insekter. Det bliver især nyttig ved afprøvning af potentielle lægemiddelkandidater til insekt kontrol. Brugen af transgene teknikker i insekter til at udtrykke særlige reporter proteiner i fedt kroppen trophocytes vil åbne nye metoder til at udvikle kraftfulde bioassays for studiet af fedt kroppens fysiologi.

Disclosures

Vi har intet at videregive.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af NIH grant #SC1AI109055, 2014 NMSU HHMI grant #52008103 og NSF PGR yde #1238731. Vi takke deltagerne i NMSU forår 2015 BIOL302 Molekylær metoder klasse og Lavesh Bhatia for deres tekniske support med fedt krop kultur eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors  Fiskars 83872
Fly pad Genesee Scientific 789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial Hausherrs Machine Works, Inc. 3740-01-210-2368
Fine tip forceps World Precision Instruments, Inc.  500085
Light microscope  Leica Microsystems
96 well plate  Sigma CL S3383
Sucrose Sigma S9378
Alanine Sigma A7627
Arginine Sigma A5006
Asparagine Sigma A0884
Aspartic Acid Sigma A9256
Cysteine Sigma W326305
Glutamic Acid Sigma G1251
Glutamine Sigma G3126
Glycine Sigma G2879
Histidine Sigma H6034
Isoleucine Sigma I2752
Lysine Sigma L5501
Leucine Sigma L8000
Phenylalanine Sigma P2126
Proline Sigma P0380
Serine Sigma S4500
Threonine Sigma T8625
Tryptophan Sigma T0254
Tyrosine Sigma T3754
Valine Sigma V0500
Methionine Sigma M9625
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
MgCl2-6H2O Sigma M2670
NaHCO3 Sigma S5761
CaCl2-2H2O Sigma C8106
Tris pH8.0  Sigma T1503
EDTA Sigma E6758
ddH2O Sigma W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benelli, G., Mehlhorn, H. Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control. Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).
  2. Newby, G., et al. The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries. Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).
  3. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
  4. Long, C. A., Zavala, F. Malaria vaccines and human immune responses. Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).
  5. Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines. Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).
  6. Frings, S., Lindemann, B. Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride. J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).
  7. Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).
  8. Yewhalaw, D., et al. Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program. PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).
  9. Arrese, E. L., Soulages, J. L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).
  10. Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Chapman & Hall. London. 507-522 (1997).
  11. Price, D. P., et al. The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal. PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).
  12. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Front Physiol. 5, 103 (2014).
  13. Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. Accumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).
  14. Raikhel, A. S., et al. Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).
  15. Hansen, I. A., Attardo, G. M. Ch. 6. Short Views on Insect Molecular Biology. Chandrasekar, R. , International Book Mission. South India. (2009).
  16. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).
  17. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).
  18. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction. J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).
  19. Carpenter, V. K., et al. SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction. J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).
  20. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).
  21. Hugo, L. E., et al. Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission. PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).
  22. Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasit Vectors. 8, 252 (2015).
  23. Uchida, K., et al. Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids. J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).
  24. Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal. J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).
  25. Hayes, E. Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L). J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).
  26. Price, D. P., et al. The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal. Plos One. 6 (7), e22573 (2011).
  27. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).
  28. Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe. PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).
  29. Larsen, W. P. Growth in an insect organ culture. J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).
  30. Judy, K. J., et al. Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta. Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).
  31. Marks, E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures. Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).
  32. Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System. PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).
  33. Postlethwait, J. H., Handler, A. M. Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).
  34. Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes. J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).
  35. Boudko, D. Y., et al. Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti. Nat Commun. 6, 8546 (2015).
  36. Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon. Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).
  37. Jones, K. H., Senft, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).
  38. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).

Tags

Infektionssygdomme sag 126 fedt kroppen orgel kultur myg Aedes aegypti ernæring vitellogenesen
Fedt kroppen organsystem kultur i <em>Aedes Aegypti</em>, en vektor af Zika Virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chung, H. N., Rodriguez, S. D.,… More

Chung, H. N., Rodriguez, S. D., Carpenter, V. K., Vulcan, J., Bailey, C. D., Nageswara-Rao, M., Li, Y., Attardo, G. M., Hansen, I. A. Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus. J. Vis. Exp. (126), e55508, doi:10.3791/55508 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter