Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

Published: August 19, 2017 doi: 10.3791/55508
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 4, 1,5
1Department of Biology, New Mexico State University, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University, 3Department of Computer Sciences, New Mexico State University, 4Department of Epidemiology of Microbial Diseases, Yale School of Public Health, 5Institute of Applied Biosciences, New Mexico State University

Summary

שומן הגוף הוא האיבר מטבולית במרכז בחרקים. אנו מציגים מערכת תרבות איברים חיים המאפשרת למשתמש ללמוד את התגובות של רקמות הגוף השמן מבודד לגירויים שונים.

Abstract

שומן הגוף חרקים ממלאת תפקיד מרכזי חילוף החומרים חרקים, אחסון מזון, שיקוף פונקציות של הכבד, רקמת שומן חולייתנים. רקמות הגוף השמן חרקים מופץ בדרך כלל בכל הגוף חרקים. עם זאת, לעיתים קרובות מרוכז בבטן, מחובר לקיר הגוף בבטן.

יתוש שומן הגוף הוא המקור הבלעדי של חלמון חלבונים, אשר הם קריטיים עבור ייצור הביצים. לכן, התרבות במבחנה של רקמות שומן הגוף יתושים מייצג מערכת חשובה זו לחקר יתושים פיזיולוגיה, חילוף החומרים, ובסופו של דבר, ביצים. התהליך תרבות הגוף השמן מתחיל עם ההכנה של פתרונות, ריאגנטים, כולל פתרונות מניות חומצת אמינו, אאדס תמיסת מלח פיזיולוגית מלח מניות פתרון (APS), פתרון מניות סידן בינוני תרבות הגוף השמן. התהליך ממשיך עם חיתוך שומן הגוף, ואחריו טיפול ניסיוני. לאחר הטיפול, מגוון רחב של ניתוחים שונים ניתן לבצע, כולל RNA רצף (RNA-Seq), qPCR, שהכלים המערבי, פרוטאומיקס, מטבולומיקס.

בניסוי שלנו למשל, נדגים את הפרוטוקול באמצעות כריתה ותרבות של שומן הגוף של היתוש קדחת צהובה, Aedes aegypti, וקטור העיקרי של arboviruses כולל קדחת דנגה, chikungunya Zika. RNA מגופים שומן תרבותי תחת מצב פיזיולוגי ידוע upregulate חלבונים חלמון לעומת הפקד היו RNA-Seq ניתוח כדי להדגים את התועלת פוטנציאלי של הליך החקירות של ביטוי גנים.

Introduction

היתושים הם וקטורים של מחלות האדם הרסנית, לרבות מלריה, קדחת דנגה, chikungunya Zika1,2,3. למרות אינטנסיבי המאמצים הבינלאומיים לרסן מחלות אלה וכדי לשלוט להעברת המחלה אוכלוסיות יתוש, התפרצות מגפת המחלות בעקיצות יתוש הן עדיין נפוץ, במיוחד במדינות מתפתחות. חיסונים יעילים נגד רבים של מחלות אלו הן אינו זמין או של יעילות מוגבלת4,5. הדרך היעילה ביותר למנוע התפרצויות היא לשלוט אוכלוסיות יתוש, בעיקר באמצעות שימוש בקוטלי חרקים טיפולים. עם זאת, עמידות חרקים יש שפותחה אוכלוסיות יתושים רבים ולהיות בעיה נפוצה ברחבי העולם6,7,8. המחקר של יתוש פיזיולוגיה חיוני להתפתחות של הרומן כלים ואסטרטגיות כדי לשלוט במחלה.

יתוש שומן הגוף ממלאת תפקיד מרכזי לאחסון מזון, הומאוסטזיס מטבולית, רבייה, קטבוליזם xenobiotic9,10,11,12. זה האיבר האחסון המרכזי עבור טריגליצרידים, גליקוגן וחומצות אמינו בצורה של חלבוני. הוא מתפקד גם המיקום של סינתזה עבור רוב החלבונים hemolymph של מטבוליטים. יתושים, שומן הגוף הוא המקור הבלעדי של ייצור החלבון חלמון המתרחשת אצל נקבות לאחר שהם לוקחים ארוחת דם13,14.

סוג התא העיקרי של שומן הגוף הוא גדול, polyploid trophocyte או adipocyte3,9,10,12. רקמת שומן גוף שמאורגנים אונות או עטיפות, ניתן למצוא כל חלקי הגוף של היתוש, עם החלק הגדול ביותר ממוקם בבטן, איפה אונות גדולה של שומן הגוף מחוברים לקיר הבטן הגוף.

מערכת תרבות הגוף השמן יתושים המובאת כאן פותחה בשנות ה-70 ונותרה כלי רב עוצמה עבור לומד הגוף השמן פיזיולוגיה10, במיוחד בשילוב עם טכנולוגיות אנליזה הנוכחית. הבסיס של טכניקה זו מבוססת על בידודו של הקירות גוף הבטן ואת הרקמה המשויך שומן הגוף. מהות הידרופובי הקוטיקולה הבטן גורם לו לצוף על פני השטח של המדיום תרבות, עם האונות המצורפת של הגוף השמן בטן שקועה. Spiracles ואת המבנה tracheolar נשמרים, הבטחת חמצון של בתרבית רקמה. מעתה ואילך, נתייחס ההכנות הללו "שומן גופות." בודדים גופות שומן נשארות קיימא עבור יותר מ 12 שעות כאשר מתפשט בתוך המדיום המתאים (שלא פורסמו תוצאות). תרבות הגוף השמן הוא כלי בעל ערך יש לטפל בהן מגוון של שאלות לגבי הגוף השמן אנדוקרינולוגיה ופיזיולוגיה9,10,12,15,16, 17.

בתרבית שומן הגוף יכולה להיות נתונה שונות ניסיוני ושליטה טיפולים, העיתוי של אשר יכול להיות הוחלט על ידי החוקר. בסוף תקופת הדגירה, הגופים שומן ניתן לאסוף ולהשתמש מעובד עבור ניתוחים במורד הזרם, כולל qPCR16,17,18,19, ווסטרן סופג18 ,20, פרוטאומיקס21או גליקומיקס22. ניתן לבצע ניסויים על סולמות שונים, מ בודדים גופות שומן לקבוצות של מאות זה יכול להיות תרבותי ביחד.

התוצאות נציג כלולים כאן נגזר שומן גוף תרבותי בנוכחות חומצות אמינו ו ecdysone הידרוקסי 20 של הורמונים סטרואידים כדי לדמות את ההפעלה ארוחת דם של16,vitellogenesis17, 23,24. אנו מנותח, בהשוואה בביטוי הגן דיפרנציאלית של לא מופעל נגד גופים שומן מופעל באמצעות ניתוח הדור הבא רצפי.

Protocol

1-הכנת ריאגנטים והפתרונות

  1. פתרון מניות חומצת אמינו
    1. הכן 4 X חומצת אמינו פתרון מניות 23 , 24 ידי שקילה, הוספת את 20 חומצות אמינו שונות הבקבוק Erlenmeyer על פי ריכוז נתון טבלה 1-
      הערה: במקרים מסוימים, amino acid(s) יכול להיות מהפתרון והוחלף שווה טוחנת כמויות של מניטול לשמור על ריכוז שווה של osmolytes.
    2. להוסיף את הכמות המתאימה של ddH 2 O לייצר האחסון הרצוי של פתרון.
    3. על מנת להבטיח כי חומצות אמינו יש התפרקה לחלוטין, מחממים בעדינות תוך כדי ערבוב מתמיד עד שהנוזל נקי לחלוטין; הוא יקבל גוון צהוב קלה.
      הערה: זה עשוי להיות נחוץ לצמצם את רמת ה-pH 6 על-ידי הוספת HCl כדי לאפשר כמה חומצות אמינו הידרופוביות יותר להתמוסס.
    4. Aliquot הפתרון וסינון סטרילי-באמצעות מסנן מזרק 0.2-µm גודל הנקבוביות.
    5. חנות במיכל אטום ב-20 ° C עד 6 חודשים.
  2. APS
    הערה: לראות 25.
    1. עבור 20 X מלח פתרון מניות, לשלב המלחים המפורטים בטבלה מס ' 2 ב- 50 מ ל מים. מערבבים עד התפרקה לחלוטין.
      הערה: ייתכן צורך לחמם מעט לפתרון נמסים לחלוטין המלחים.
    2. סטרילי-מסנן באמצעות מסנן מזרק 0.2-מיקרומטר גודל הנקבוביות ולאחסן את הפתרון בשפופרת 50-mL ב-20 מעלות צלזיוס
  3. פתרון מניות סידן
    1. עבור 50 X פתרון מניות סידן, להוסיף 0.90 גר' סידן כלורי 100 מ ל מים (טבלה 3); ומערבבים עד התפרקה לחלוטין.
    2. סטרילי-מסנן באמצעות מזרק לסנן עם גודל הנקבוביות 0.2-מיקרומטר, aliquot את הפתרון לתוך צינורות 50-mL, ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס
  4. טריס מאגר (pH 7.4)
    1. עבור מאגר טריס, לשלב את המלח ואת הפתרונות המפורטים בטבלה 4 ולהוסיף ddH 2 O עד 100 מ ל.
    2. סטרילי-מסנן באמצעות מזרק לסנן עם גודל הנקבוביות 0.2-מיקרומטר, aliquot את הפתרון לתוך צינורות 50-mL; לאחסן בטמפרטורת החדר.
  5. בינוני תרבות הגוף השמן
    1. כדי להכין המדיום תרבות הגוף השמן, להכין כל הפתרונות המפורטים לעיל.
    2. לשלב אותם לפי אמצעי האחסון טבלה 5 לעשות 200 מ של תרבות הגוף השמן בינונית.
    3. להתאים את ה-pH ל 7.2 באמצעות NaOH או HCl.
    4. מסנן סטרילי הפתרון באמצעות מסנן מזרק עם גודל הנקבוביות 0.2-מיקרומטר.
    5. לחלק את הפתרון aliquots 15-mL ולאחסן ב-20 ° C עד 6 חודשים.

2. הכנות לקראת ניתוח

  1. להכין את stereomicroscope (10-20 x הגדלה) עם תאורה ופרוס שני פינצטה ultra-בסדר, זוג מספריים ניתוח מיקרו-
  2. להכין את כל הפתרונות הדרושים לניסוי. להפשיר את המדיום תרבות הגוף השמן לטמפרטורת החדר.
    הערה: Precipitants יכול להיות מומס על ידי חימום בעדינות את הפתרון לא יותר מ-30 מעלות צלזיוס
  3. העצמות, לאסוף את היתושים הבוגרים הנשי (3-7 ימים לאחר הופעתה), עזים ומתנגד אותם באמצעות פחמן דו-חמצני או קרח
    הערה: פעם מרדימים, היתושים יש לשמור תחת CO 2 בזמן הקצר ביותר האפשרי, שלא יעלה על 20 דק. לחלופין, היתושים יכול להיות מורדם על הקרח שמרה במשך כ-30 דקות
  4. להכין צלחת 6-ובכן עם 3 מ"ל של APS לכל טוב.

3. חיתוך שומן הגוף

  1. למקד את stereomicroscope ויבתר ולהתאים את הכיסא לגובה נוח.
  2. למקם שקופית קעורה מיקרוסקופ על פני מיקרוסקופ, להוסיף 2 טיפות APS למרכז.
  3. לאסוף יתוש על ידי רגל באמצעות מלקחיים ולהעביר אותה אל פני השטח APS בשקופית מיקרוסקופ.
  4. בקפידה אחיזה היתוש מאת בית החזה, עם המלקחיים ביד שמאל, וסובב היתוש כך הצד הבטני היא כלפי מעלה.
  5. תוך החזקת הגוף יציב על-ידי בית החזה, את שני מקטעי בטן, עם המלקחיים ביד ימין, ומשוך בעדינות.
    הערה: לאחרונה שני מגזרים בטן יפריד הבטן השחלות המצורפת, Malpighian בקוריאנית, hindgut, ואת פיתול; לפעמים היבול יהיה להחליק החוצה הבטן. אם הן לא הוסרו, הכנס את קצות המלקחיים סגורה לתוך החור קטן שנוצר ולהסיר את הרקמות הנותרים.
  6. להפריש את המלקחיים נכון ולקחת את המספריים האביב. החלק סכין אחד לתוך החור בבטן עד המקטע להלן בית החזה. בעדינות ובמהירות לחתוך את הבטן לאורכו.
    הערה: לאחר ביצוע החתך, הבטן צריך להתחיל להרחיב כלפי חוץ, אבל זו לא תיתכן מיד.
  7. להמשיך לבצע גזירה שנייה, אשר יהיה חתך לרוחב מתחת בית החזה, מעט מתחת שבו החתך הראשון הסתיים.
    הערה: הבטן כדאי לפתוח ואז מביצועם מבית החזה, את הקוטיקולה למעלה והגופים שמן הצד-שקוע בתוך גישה. הקיר גוף הבטן היא הכנת הגוף השמן לתרבות במבחנה.
  8. להרים את הגופות שומן מהפתרון APS משתמש הקצה של זוג מלקחיים ולהעביר אותם מהפתרון לצלחת 6-ובכן המכיל APS בטמפרטורת החדר. לאפשר את הרקמה כדי לנוח כ 0.5 h לפני קידום לתרבות הגוף השמן.

4. תרבות הגוף השמן

  1. דגירה הגופים שומן ב- APS בטמפרטורת החדר במשך לפחות 0.5 h כדי equilibrate אותם.
  2. העברת הגופות שומן באמצעות הקצה של המלקחיים והרם אותם בעדינות מתוך הפתרון APS. הנמך את הטיפ אל המדיום תרבות הגוף השמן.
    הערה: לגוף שומן צריך לפתוח על פני השטח של המדיום, מרחפים בחופשיות. תרבות הגוף השמן מבוצעת בדרך כלל בתוך צלחות 96-ובכן, עם 150-200 µL בינוני היטב בכל. ובכן משתלבים אחד עד שלושה בודדים גופות שומן, והם קיימא עבור יותר מ 12 שעות (שלא פורסמו תוצאות אישי).
  3. לאחר תקופת דגירה, להעביר את הגופות שומן של המדיום לתוך צינורות 1.5-mL צנטריפוגה המכיל את ריאגנטים המתאים לעיבוד הזרם.
    הערה: ניתוחים טיפוסיים כוללים qPCR 16 , 17 , 18 , 19, ווסטרן סופג 18 , 20, transcriptomics 26, פרוטאומיקס 21 או גליקומיקס 22.

Representative Results

לדוגמה, אנו ביצע ניסוי תרבות הגוף השמן, מגורה בודדים גופות שומן על ידי המקננת בהם על פתרון המכיל תערובת מאוזנת של כל עשרים חומצות אמינו המתרחשים באופן טבעי את החרקים הורמונים סטרואידים הידרוקסי 20 ecdysone (10 מיקרומטר) עבור 6-אייץ ' . כפקד, שומן הגוף היו מודגרות ב- APS עבור כמות שווה של הזמן.

לאחר דגירה, הרנ א סה כ היה מבודד באמצעות tri-ריאגנט27 ההוראות של היצרן. האיכות והכמות של דגימות RNA שחולצו היו העריכו באמצעות ספקטרופוטומטרים, כימות fluorometric, agarose בג'ל. ספריות רצפי RNA נוצרו באמצעות 4 µg של RNA הכולל, היו לכמת באמצעות שתי טכניקות שונות. לאחר מכן, הספריות נשלחו ספק מסחרי עבור סיום לזווג-רצף.

תוצאות ניסוי זה מוצגים טבלה 6. גנים מציג את החזקה תעתיק בתגובה חומצת אמינו ו- 20-hydroxyecdysone היו בעיקר חלמון חלבון גנים, אשר הוא מסכים עם תוצאות קודמות11.

איור 1 מציג מפת החום המציין את רמות ביטוי גנים בכ-1,256 באופן שונה לידי ביטוי גנים מגופים שומן בתרבית לאחר שני טיפולים שונים.

Figure 1
איור 1 . חום מפה של גנים ביטוי בתרבות הגוף השמן. המפה החום היה מחושב בהתבסס על מספר תעתיקים ספציפיים עבור כל ג'ין בספריות שונות באמצעות חבילת heatmap28 המהווה חלק הסביבה תוכנה R. הגוון כהה מייצג ביטוי גנים גבוה יותר. גנים 1,256 עם וריאציה סטטיסטית בביטוי (Q-ערכים < 0.05) מוצגים. הגנים מסודרים לפי רמות ביטוי בממוצע שלהם, שמציין את dendrogram בצד השמאל (לא לפי יחסיהם פילוגנטי). הערה המספר הגבוה של גנים עם מעלה או למטה-מוסדר ביטוי לאחר גירוי עם חומצות אמינו (AA) ו 20-hydroxyecdysone (20E). APS = תמיסת מלח פיזיולוגית אאדס . ראה 1 קובץ משלים עבור רשימת גנים ואת רמות ביטוי היחסי שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

חומצת אמינו מולקולרית משקל גר'/מול מ מ ריכוז מ ג לליטר מ"ג עבור אמצעי האחסון 300 מ
אלנין המהווה 89.1 26.68 2377.19 713.16
ארגינין 174.2 26.68 4647.66 1394.3
אספרגין 150.1 26.68 4004.67 1201.4
חומצה אספרטית 133 26.68 3548.44 1064.53
ציסטאין 121.16 10.68 1293.99 388.2
חומצה גלוטמית 147.1 26.68 3924.63 1177.39
גלוטמין 146 26.68 3895.28 1168.58
גליצין 75 53.32 3999 1199.7
היסטידין 155.16 80 12412.8 3723.84
איזולאוצין 131 10.68 1399.08 419.72
Lycine 183 26.68 4882.44 1464.73
לאוצין 131 26.68 3495.08 1048.52
פנילאלנין 165 10.68 1762.2 528.66
פרולין 115 26.68 3068.2 920.46
סרין 105 53.32 5598.6 1679.58
תראונין 119 10.68 1270.92 381.28
טריפטופן 204 10.68 2178.72 653.62
טירוזין 181 5.32 962.92 288.88
ולין 117 10.68 1249.56 374.87
מתיונין 149 10.68 1591.32 477.4

טבלה 1. 4 X פתרון מלאי חומצה אמינית.

רכיב משקל בגרמים נוספו 50 מ ל ddH2O
NaCl 8.0 g
אשלגן כלורי 0.074 g
MgCl2-6 H2O 0.120 g
NaHCO3 0.0250 g

בטבלה 2. 20 X מלח פתרון מניות.

רכיב משקל בגרמים נוספו ddH2O 100 מ
CaCl2-2 H2O 0.90 g

g > בטבלה 3. 50 X מניות תמיסת סידן.

רכיב ריכוז של פתרון מניות אמצעי אחסון מלאי עבור מאגר 100 מ
טריס pH8.0 1 מ' 5 מ
EDTA 0.25 M 2 מ
NaCl נה 0.3 g
ddH2O נה 100 מ ל (~ 93 מ"ל)

בטבלה 4. מאגר טריס.

רכיב אמצעי אחסון מלאי עבור 200 מ
פתרון מניות חומצת אמינו 150 מ
מניות תמיסת מלח 10 מ
תמיסת סידן מניות 4 מ"ל
מלון טס מאגר 10 מ
ddH2O מ ל 26

טבלה 5- תרבות הגוף השמן בינונית.

ביאור תיאור הגן מקפלים שינוי ערך-P
AAEL006138 Vitellogenin-B 3443 2.52E-112
AAEL006126 Vitellogenin-C 2795 8.64E-91
AAEL006563 קרבוקסיפפטידאז vitellogenic 1002 2.17E-119
AAEL010434 Vitellogenin-A 220 1.14E-27
AAEL006542 קרבוקסיפפטידאז vitellogenic 185 2.14E-65
AAEL012678 AAEL003006-פה [אאדס aegypti](65%) 96 4.00E-70
AAEL000080 חלבון היפותטי 82 6.69E-188
AAEL015312 Vitellogenic cathepsin B 77 1.27E-15
AAEL009588 קולטן גרעיני 3 75 4.58E-56
AAEL010529 חלבון היפותטי 66 1.32E-29

טבלה 6- תוצאות ניסויית.

משלימה קובץ 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

איברים חרקים התרבות היה בשימוש נרחב ללמוד אנדוקרינולוגיה חרקים, פיתוח, חילוף החומרים, כמו גם כדי לחקור את האינטראקציה בין איברים מסוימים אנחנו חיים איתם בסמביוזה חיידקי29,30,31, 32,33,34. In vitro לקשרי תרבות איבר הגוף השמן שימש במיוחד ללמוד חומצת אמינו תחבורה והסדרה של חלמון ייצור החלבון יתושים ואת שאר Diptera16,17,35 , 36. במהלך התהליך של vitellogenesis, יתוש שומן הגוף משתמש מערך של חומצת אמינו גבוהה-ירידה לפרטים מובילי לייבוא נגזר ארוחת דם חומצות אמינו hemolymph לסנתז כמויות גדולות של חלבונים חלמון12 ,19,35,36. תרבות הגוף השמן היה לכלי התיחום של הדרישות התזונתיות של הגוף השמן הזה בהקשר18.

איכות חומר המוצא, היתושים נקבה, היא קריטית להצלחת הניסויים. רימות היתוש העולות צפופות תחת תנאים וניזונו התזונתי גבוה דיאטות בדרך כלל לייצר את התוצאות הטובות ביותר. יש כמה משתנים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת יצירת תנאים תרבות הגוף השמן יתושים במעבדה מבחינת עיצוב ניסיוני. הראנו במחקרים קודמים, ביטוי גנים שומן הגוף משתנה באופן משמעותי בהתאם כל סיפור חיי הפרט ואת המצב התזונתי של יתוש11,22. התנאים התרבות יתוש צריך להיות אחיד כדי להפחית את מידת ההשתנות בגודל, עתודות התזונתיים של היתושים ניסיוני. בנוסף, אנשי ביצוע והניתוחים בקיצור כדי להבטיח ניתוח מהיר ומדויק עם תוצאות עקביות. תא הכדאיות בגופים שומן מבודדים ניתן לבדוק באמצעות שונים מכתימים שיטות37,38.

הנבחנים של ניסוי תרבות הגוף השמן צריך לקחת בחשבון מספר והניתוחים אפשרי בתקופת זמן נתונה. כאשר נדרשים כמויות גדולות של שומן הגוף, הפעלות לנתיחה מרובות או dissectors מרובים ייתכן שיהיה צורך. יש מגוון רחב של יישומים עתידיים עבור in vitro לקשרי תרבות הגוף השמן בבית. יתושים וחרקים אחרים. זה יהיה שימושי במיוחד עבור בדיקות מועמדים פוטנציאליים סמים לבקרת מזיקים. השימוש בטכניקות הטרנסגניים בחרקים לבטא חלבונים ספציפיים כתב ב הגוף השמן trophocytes יפתח את שיטות חדשות כדי לפתח bioassays עוצמה עבור חקר הפיזיולוגיה של הגוף השמן.

Disclosures

אין לנו לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענק-NIH #SC1AI109055, גרנט NMSU HHMI #52008103 2014, ו NSF PGR להעניק #1238731. אנו מודים המשתתפים של NMSU האביב 2015 BIOL302 מולקולרית שיטות מחלקה, בבהאטיה Lavesh לתמיכה טכנית שלהם עם הניסויים תרבות הגוף השמן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors  Fiskars 83872
Fly pad Genesee Scientific 789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial Hausherrs Machine Works, Inc. 3740-01-210-2368
Fine tip forceps World Precision Instruments, Inc.  500085
Light microscope  Leica Microsystems
96 well plate  Sigma CL S3383
Sucrose Sigma S9378
Alanine Sigma A7627
Arginine Sigma A5006
Asparagine Sigma A0884
Aspartic Acid Sigma A9256
Cysteine Sigma W326305
Glutamic Acid Sigma G1251
Glutamine Sigma G3126
Glycine Sigma G2879
Histidine Sigma H6034
Isoleucine Sigma I2752
Lysine Sigma L5501
Leucine Sigma L8000
Phenylalanine Sigma P2126
Proline Sigma P0380
Serine Sigma S4500
Threonine Sigma T8625
Tryptophan Sigma T0254
Tyrosine Sigma T3754
Valine Sigma V0500
Methionine Sigma M9625
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
MgCl2-6H2O Sigma M2670
NaHCO3 Sigma S5761
CaCl2-2H2O Sigma C8106
Tris pH8.0  Sigma T1503
EDTA Sigma E6758
ddH2O Sigma W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benelli, G., Mehlhorn, H. Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control. Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).
  2. Newby, G., et al. The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries. Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).
  3. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
  4. Long, C. A., Zavala, F. Malaria vaccines and human immune responses. Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).
  5. Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines. Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).
  6. Frings, S., Lindemann, B. Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride. J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).
  7. Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).
  8. Yewhalaw, D., et al. Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program. PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).
  9. Arrese, E. L., Soulages, J. L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).
  10. Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Chapman & Hall. London. 507-522 (1997).
  11. Price, D. P., et al. The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal. PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).
  12. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Front Physiol. 5, 103 (2014).
  13. Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. Accumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).
  14. Raikhel, A. S., et al. Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).
  15. Hansen, I. A., Attardo, G. M. Ch. 6. Short Views on Insect Molecular Biology. Chandrasekar, R. , International Book Mission. South India. (2009).
  16. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).
  17. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).
  18. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction. J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).
  19. Carpenter, V. K., et al. SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction. J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).
  20. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).
  21. Hugo, L. E., et al. Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission. PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).
  22. Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasit Vectors. 8, 252 (2015).
  23. Uchida, K., et al. Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids. J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).
  24. Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal. J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).
  25. Hayes, E. Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L). J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).
  26. Price, D. P., et al. The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal. Plos One. 6 (7), e22573 (2011).
  27. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).
  28. Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe. PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).
  29. Larsen, W. P. Growth in an insect organ culture. J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).
  30. Judy, K. J., et al. Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta. Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).
  31. Marks, E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures. Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).
  32. Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System. PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).
  33. Postlethwait, J. H., Handler, A. M. Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).
  34. Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes. J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).
  35. Boudko, D. Y., et al. Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti. Nat Commun. 6, 8546 (2015).
  36. Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon. Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).
  37. Jones, K. H., Senft, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).
  38. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).

Tags

מחלות זיהומיות גיליון 126 שומן הגוף האיברים תרבות יתושים Aedes aegypti תזונה vitellogenesis
תרבות הגוף השמן איברים במערכת <em>Aedes Aegypti</em>, וקטור של וירוס Zika
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chung, H. N., Rodriguez, S. D.,… More

Chung, H. N., Rodriguez, S. D., Carpenter, V. K., Vulcan, J., Bailey, C. D., Nageswara-Rao, M., Li, Y., Attardo, G. M., Hansen, I. A. Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus. J. Vis. Exp. (126), e55508, doi:10.3791/55508 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter