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Biology

지방 기관 문화 시스템 Aedes Aegypti, Zika 바이러스 벡터에

Published: August 19, 2017 doi: 10.3791/55508
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 4, 1,5
1Department of Biology, New Mexico State University, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University, 3Department of Computer Sciences, New Mexico State University, 4Department of Epidemiology of Microbial Diseases, Yale School of Public Health, 5Institute of Applied Biosciences, New Mexico State University

Summary

뚱뚱한 몸은 곤충에 중앙 대사 기관 이다. 선물이 라이브 기관 문화 시스템 사용자가 다양 한 자극에 격리 지방 몸 조직의 응답 공부입니다.

Abstract

곤충 뚱뚱한 몸을 곤충 신진 대사 영양소 저장, 간 및 지방 조직 척추 동물에서의 기능을 미러링에 중심 역할을 한다. 곤충 지방 신체 조직 일반적으로 곤충 시체를 통해 배포 됩니다. 그러나, 그것은 종종 복 부에 집중 이며 복 부 체 벽에 부착 된.

모기 지방 몸은 달걀 생산을 위한 중요 한 노 른 자 단백질의 유일한 소스 이다. 모기 지방 신체 조직의 생체 외에서 문화 모기 생리학의 연구에 대 한 중요 한 시스템을 대표 하는 따라서, 신진 대사, 그리고, 궁극적으로, 계란 생산. 뚱뚱한 몸 문화 프로세스 솔루션 및 시 약, 아미노산 재고 솔루션, Aedes 생리 염 분 소금 재고 솔루션 (AP), 칼슘 재고 솔루션 및 뚱뚱한 몸 문화 매체를 포함 하 여의 준비로 시작 합니다. 프로세스 지방 시체 해 부, 실험 치료 다음 계속 합니다. 치료 후, 다른 분석의 다양 한 수행할 수 있습니다, RNA 시퀀싱 (RNA-Seq), 정량, 서쪽 오 점, proteomics, metabolomics 등.

우리의 예제에서는 실험 황열병 모기, Aedes aegypti, 뎅기열, Zika, chikungunya, 등 arboviruses의 주요 벡터에서에서 절단 및 지방 시체의 문화를 통해 프로토콜 보여 줍니다. 컨트롤 대 upregulate 노 른 자 단백질으로 알려진 생리 적인 조건 하에서 경작 하는 지방 시체에서 RNA 유전자 발현의 조사에 대 한이 절차의 잠재적인 유틸리티를 보여 주기 위해 RNA-Seq 분석 대상이 됐다.

Introduction

모기는 말라리아, 뎅기열, chikungunya, Zika1,2,3등 엄청난 인간 질병의 벡터. 강렬한 국제적인 노력이이 질병을 억제 하 고 질병 전송 모기 인구를 통제 하에 불구 하 고 모기 품 어진 질병의 전염병 발생은 특히 개발 도상국에서에서 여전히 일반적 이다. 이 질병의 많은 대 한 효과적인 백신은 사용할 수 없는 또는 제한 된 효능4,5. 발생을 방지 하는 가장 효과적인 방법은 살충제 처리를 통해 주로 모기 인구를 통제 하는 것입니다. 그러나, 살충제 저항 많은 모기 인구에서 개발 하 고 세계6,,78주변 일반적인 문제. 모기 생리학의 연구 소설 도구와 질병을 제어 하는 전략의 발전에 필수적 이다.

모기 뚱뚱한 몸을 영양소 저장, 대사 항상성, 생식, 그리고 xenobiotic 놓을9,10,,1112에 중심 역할을 한다. 트리 글리세라이드, 글 리 코겐, 아미노산 저장 단백질의 형태로 주요 저장 기관 이다. 그것은 또한 대부분의 hemolymph 단백질 및 대사 산물에 대 한 종합의 위치 역할을 합니다. 모기, 뚱뚱한 몸을 빼앗아 혈액 식사13,14후 여성에서 발생 하는 노 른 자 단백질 생산의 유일한 소스입니다.

주 세포 유형의 뚱뚱한 몸은 큰, 이다 trophocyte 또는 체형3,,910,12. 지방이 신체 조직 돌출부 또는 칼 집으로 구성 하 고 어디 지방 신체의 돌출부가 큰 복 부 체 벽에 붙어있는 복 부에 있는 가장 큰 부분으로 모든 신체 부위는 모기의에서 찾을 수 있습니다.

여기에 제시 된 모기 뚱뚱한 몸 문화 시스템 70 년대에 개발 되었다 고 지방 신체 생리학10, 특히 현재 분석 기술 함께 공부를 위한 강력한 도구를 남아 있다. 이 기법의 기초 복 부 몸 벽과 연결 된 지방 신체 조직의 격리를 기반으로 합니다. 복 부 표 피의 소수 성 특성 포장 되어 복 부 지방이 신체의 연결 된 돌출부와 문화 매체의 표면에 떠 그것을 발생 합니다. Tracheolar 구조와 spiracles 교양된 조직에의 산소를 보장 유지 됩니다. 이제부터, 우리 "지방 시체." 이러한 준비를 참조 한다 고립 된 지방 시체 가능한 적절 한 매체 (게시 되지 않은 결과)에서 알을 품을 때 12 h 이상 유지. 지방이 신체 문화는 뚱뚱한 몸을 내분비학 및 생리학9,10,12,,1516에 관한 질문의 다양 한 해결은 귀중 한 도구 17.

교양된 지방 시체 다양 한 실험 대상이 될 수 있는 고 제어 치료의 타이밍은 조사자에 의해 따라 결정 될 수 있다. 잠복기의 끝에, 지방 기관 수 수집 및 정량16,,1718,19,18 를 더럽혀 서 포함 한 다운스트림 분석에 대 한 처리 20, proteomics21또는 대사체학22. 함께 배양 수 수백의 그룹에 개별 지방 시체에서 다양 한 스케일에서 실험을 수행할 수 있습니다.

여기에 포함 된 대표적인 결과 지방 시체 아미노산 및 vitellogenesis16,17의 혈액 식사 활성화를 시뮬레이션 하기 위해 스테로이드 호르몬 20-hydroxy ecdysone 존재 양식에서 파생 했다 23,24. 우리와 다음 세대 시퀀싱 분석을 통해 활성화 된 지방 기관 대 하지 활성화의 차동 유전자 발현을 비교 분석.

Protocol

1. 솔루션 및 시 약 준비

  1. 아미노산 재고 솔루션
    1. 준비 4 X 아미노산 재고 솔루션 23 , 24 무게와 표 1에 주어진 농도 따라 삼각 플라스 크에 20 다른 아미노산을 추가.
      참고: 경우에 따라 amino acid(s) 솔루션에서 제외 하 고 수 어 금 니 같은 양의 osmolytes의 동등한 농도 유지 하기 위해 마 니 톨에 의해 대체.
    2. DdH 2 O 생산 솔루션의 원하는 볼륨의 적절 한 금액을 추가.
    3. 아미노산 완전히 해산 할 수 있도록 부드럽게 액체 완전히 취소 될 때까지 지속적으로 교 반 하면서가 열, 그것은 약간의 노란 색상에 걸릴 것입니다.
      참고: 그것은 해산 더 소수 성 아미노산의 일부 있도록 HCl를 추가 하 여 6 pH를 감소 해야 할 수도 있습니다.
    4. 약 수는 솔루션 및 살 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m로 기 공 크기.
    5. 최대 6 개월 동안-20 ° C에서 밀봉된 한 콘테이너에서 매장.
  2. APS
    참고: 25 참조.
    1. X 20에 대 한 재고 솔루션을 소금, 물 50 mL에 표 2에 나열 된 염 결합. 완전히 녹아 때까지 저 어.
      참고: 그것은 약간을 완전히 해산 소금 솔루션을 열 필요가 있을 수 있습니다.
    2. 멸 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m로 기 공 크기 및 솔루션-20에서 50 mL 튜브에 저장 ° c.
  3. 칼슘 재고 솔루션
    1. 칼슘 재고 솔루션 X 50 물 (표 3) 100 mL를 염화 칼슘의 0.90 g 추가; 완전히 녹아 때까지 저 어.
    2. 멸 균 필터 주사기를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기, aliquot 솔루션 50 mL 튜브, 필터링 및-20에서 저장 ° c.
  4. Tris 버퍼 (pH 7.4)
    1. 는 Tris 버퍼, 소금 및 표 4에 나열 된 솔루션을 결합 하 여 고 추가 ddH 2 O 최대 100 mL.
    2. 멸 균 필터 주사기를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기와 약 수 솔루션 50 mL 튜브 필터, 실내 온도에 저장.
  5. 뚱뚱한 몸 문화 매체
    1. 뚱뚱한 몸 문화 매체를 준비 하려면 위에 나열 된 모든 솔루션을 준비.
    2. 뚱뚱한 몸 문화 매체의 200 mL을 표 5에서 볼륨에 의하여 그들을 결합 하는 것.
    3. 7.2 NaOH 또는 HCl에 산도 조정.
    4. 멸 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기와 솔루션.
    5. 15 mL aliquots로 솔루션을 분할 하 고-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장.

2. 해 부에 대 한 준비

  1. 조명 stereomicroscope (10-20 배 확대)을 준비 하 고 2 초 정밀 핀셋과 마이크로 해 부가 위 레이아웃.
  2. 실험에 필요한 모든 솔루션을 준비합니다. 실내 온도에 뚱뚱한 몸을 배양 해 동.
    참고: 침 부드럽게 30 보다 더 높은 솔루션을가 열 하 여 녹 수 있다 ° c.
  3. 는 흡 인기와 성인 여성 모기 (출현 후 3-7 일)를 수집 하 고 그들을 anesthetize 이산화탄소 또는 얼음을 사용 하 여
    참고: 한 번 취, 모기 지켜져야 한다 CO 2 짧은 시간에 대 한 가능한, 또는 20 분을 초과 하지 않는, 모기 얼음에 취 수 하 고 약 30 분 동안 보관
  4. 잘 당 ap 3 mL와 함께 6-잘 접시 준비.

3. 뚱뚱한 몸을 해 부

  1. 해 stereomicroscope을 집중 하 고 편안한 높이로 자를 조정.
  2. 현미경 표면에 오목 현미경 슬라이드를 놓고 중앙에 APS의 두 방울을 추가.
  3. 모기 다리는 집게를 사용 하 여 선택 하 고 현미경 슬라이드에 APS 표면에 그것을 전송.
  4. 신중 하 게 모기는 흉부에 의해 왼쪽 손에 집게 그립 하 고 복 부 쪽이 위쪽으로 모기 회전.
  5. 시체 꾸준한 흉부를 잡고 있는 동안, 오른손에 집게와 마지막 2 개의 복 부 세그먼트를 파악 하 고 부드럽게 당겨.
    참고: 마지막 2 개의 복 부 세그먼트에서 복 부와 연결 된 난소, 말 tubules, hindgut, midgut; 구분 됩니다. 때로는 자르기 복 부 밖으로 슬라이드 합니다. 그들은 제거 되지 않은, 만든 작은 구멍에는 집게의 닫힌된 끝을 삽입 하 고 나머지 조직 제거.
  6. 오른쪽 집게를 따로 설정 하 고 봄이 위를 선택 합니다. 가슴 아래 세그먼트까지 복 부에 있는 구멍에 한 블레이드를 밀어. 부드럽게 하 고 신속 하 게 복 부 세로로 잘라.
    참고: 컷 했다 일단 복 부를 시작 한다 밖으로, 확장 이것 즉시 발생 하지 않을 수 있습니다 비록.
  7. 두 번째 컷, 가슴 아래와 첫 번째 컷 종료 보다 약간 측면 컷 될 수 있도록 진행.
    참고: 복 부 해야 다음을 열고 가슴을 표 피와 AP 내 면 몰입 지방 기관에서 해리. 이 복 부 체 벽은 생체 외에서 문화에 대 한 뚱뚱한 몸을 준비.
  8. 집게의 쌍의 팁을 사용 하 여 APS 솔루션에서 지방 시체를 리프트 하 고 AP를 포함 하는 실 온에서 6 잘 플레이트에 솔루션에서 그들을 전송. 뚱뚱한 몸 문화에 전에 대략 0.5 h에 대 한 나머지 조직 허용.

4. 뚱뚱한 몸 문화

  1. 0.5 h 이상 그들을 equilibrate를 위한 실내 온도에 APS에 지방 시체를 품 어.
  2. 지방 시체는 집게의 팁을 사용 하 여 전송 하 고 부드럽게 APS 솔루션에서 그들을 들어 냅니다. 뚱뚱한 몸 문화 매체에는 팁 낮은.
    참고: 뚱뚱한 몸 한다 매체의 표면에 열고 자유롭게 떠. 뚱뚱한 몸 문화 각 우물에서 매체의 150-200 µ L 96 잘 접시에서 일반적으로 수행 됩니다. 하나 잘 최대 3 개의 개별 지방 기관, 들어갈 수 있는 그리고 그들은 이상의 12 h (게시 되지 않은 개인 결과)에 대 한 가능한.
  3. 잠복기, 후 지방 시체에서에서 전송 매체 다운스트림 처리에 대 한 적절 한 시 약을 포함 하는 원심 분리기 1.5 mL 튜브에.
    참고: 일반적인 분석 포함 정량 16 , 17 , 18 , 19, 서양 blotting 18 , 20, transcriptomics 26, proteomics 21 또는 대사체학 22.

Representative Results

예를 들어, 우리는 뚱뚱한 몸을 문화 실험을 수행 하 고 모든 20 자연적 사건 아미노산 및 6 h에 대 한 곤충 스테로이드 호르몬 20-hydroxy ecdysone (10 µ M)의 균형 잡힌된 혼합물을 포함 하는 솔루션에 그들을 배양 하 여 고립 된 지방 시체를 자극 . 컨트롤, 지방 시체는 시간의 동일한 금액에 대 한 APS에 incubated 했다.

부 화, 후 총 RNA 격리 된 제조업체의 지침에 따라 트라이 시 약27 을 사용 하 여 했다. 품질 추출 된 RNA 샘플의 수량 및 분 광 광도 계, fluorometric 정량 및 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 평가 됐다. RNA 시퀀싱 라이브러리 총 RNA의 4 µ g를 사용 하 여 생성 된 및 두 개의 서로 다른 기술을 사용 하 여 계량 했다. 그 후, 도서관 짝된 끝-시퀀싱에 대 한 상업적인 공급자에 게 보내졌다.

이 실험의 결과 표 6에 표시 됩니다. 유전자 아미노산 및 20-hydroxyecdysone 강한 transcriptional 반응을 보이고 했다 주로 노 른 자 단백질 유전자, 이전 결과11합의입니다.

그림 1 에서는 차동 1,256의 유전자 표현 레벨을 나타내는 열 지도 2 개의 다른 처리 후 교양된 지방 기관에서 유전자 표현.

Figure 1
그림 1 . 뚱뚱한 몸 문화에 표현 하는 유전자의 열 지도. 열 지도 heatmap 패키지28 R 소프트웨어 환경의 일부를 사용 하 여 다른 라이브러리에 있는 각 유전자에 대 한 특정 사본 수에 따라 계산 했다. 어두운 그늘 높은 유전자 발현을 나타냅니다. 1256 유전자 식에 통계적으로 유의 한 변화를 (Q 값 < 0.05) 표시 됩니다. 유전자 (에 따르면 그들의 계통 발생 관계) 왼쪽에 dendrogram 표시, 그들의 평균된 식 수준에 따라 정렬 됩니다. 아미노산 (AA)와 20-hydroxyecdysone (20E) 자극 후 식 위로 또는 아래로 통제 되는 유전자의 높은 숫자 note APS Aedes 생리 식 염 수를 =. 유전자와 그들의 상대 식 레벨의 목록에 대 한 추가 파일 1 을 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

아미노산 분자량 g/mol mM 농도 리터 당 밀리 그램 300 mL 볼륨에 대 한 mg
알라닌 89.1 26.68 2377.19 713.16
아르기닌 174.2 26.68 4647.66 1394.3
아스파라긴 150.1 26.68 4004.67 1201.4
Aspartic 산 133 26.68 3548.44 1064.53
시스테인 121.16 10.68 1293.99 388.2
글루탐산 147.1 26.68 3924.63 1177.39
글루타민 146 26.68 3895.28 1168.58
글리신 75 53.32 3999 1199.7
히스티딘 155.16 80 12412.8 3723.84
이소류신 131 10.68 1399.08 419.72
Lycine 183 26.68 4882.44 1464.73
신 131 26.68 3495.08 1048.52
페닐알라닌 165 10.68 1762.2 528.66
프롤린 115 26.68 3068.2 920.46
떠들고 105 53.32 5598.6 1679.58
트레오닌 119 10.68 1270.92 381.28
트립토판 204 10.68 2178.72 653.62
티로신 181 5.32 962.92 288.88
Valine 117 10.68 1249.56 374.87
메티오닌 149 10.68 1591.32 477.4

표 1입니다. 아미노산 재고 솔루션 X 4입니다.

구성 요소 50 ml ddH2O에 추가 그램 무게
NaCl 8.0 g
KCl 0.074 g
MgCl2-6 H2O 0.120 g
NaHCO3 0.0250 g

표 2. 20 X 소금 재고 솔루션.

구성 요소 100 ml ddH2O에 추가 하는 그램에 무게
CaCl2-2 H2O 0.90 g

g > 표 3. 칼슘 재고 솔루션 X 50.

구성 요소 재고 솔루션의 농도 100 ml 버퍼에 대 한 음량 주식
트리 스 pH8.0 1 M 5 mL
EDTA 0.25 M 2 mL
NaCl NA 0.3 g
ddH2O NA 100 ml (~ 93 mL)

표 4. Tris 버퍼.

구성 요소 볼륨 주식 200 ml
아미노산 재고 솔루션 150 mL
소금 재고 솔루션 10 mL
칼슘 재고 솔루션 4 mL
TES 버퍼 10 mL
ddH2O 26 mL

표 5. 뚱뚱한 몸 문화 매체.

주석 진 설명 배 변경 P-값
AAEL006138 Vitellogenin-B 3443 2.52E-112
AAEL006126 Vitellogenin-C 2795 8.64E-91
AAEL006563 vitellogenic carboxypeptidase 1002 2.17E-119
AAEL010434 Vitellogenin-A 220 1.14E-27
AAEL006542 vitellogenic carboxypeptidase 185 2.14E-65
AAEL012678 AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%) 96 4.00E-70
AAEL000080 가설 단백질 82 6.69E-188
AAEL015312 Vitellogenic cathepsin B 77 1.27E-15
AAEL009588 핵 수용 체 3 75 4.58E-56
AAEL010529 가설 단백질 66 1.32E-29

표 6. 실험 결과.

보충 파일 1. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

곤충 기관 문화 공부 벌레 내분비학, 개발, 및 물질 대사, 또한 특정 기관과 세균 symbionts29,,3031, 사이 상호 작용을 조사로 광범위 하 게 사용 되었다 32,,3334. 뚱뚱한 몸 기관 문화 체 외에서 아미노산 전송 모기 및 다른 Diptera16,,1735 노 른 자 단백질 생산의 규칙을 공부 하 고 특히 사용 되었다 , 36. vitellogenesis 과정에서 모기 지방 시체를 사용 하 여 높은 특이성 아미노산 운송업 자의 배열을 노 른 자 단백질12 의 대량 합성 hemolymph에서 혈액 식사 파생 된 아미노산을 가져올 19,,3536. 뚱뚱한 몸 문화가 컨텍스트18에 뚱뚱한 몸을 영양 요구의 묘사에 쓸모 있었다.

시작 자료, 여성 모기의 품질은이 실험의 성공에 대 한 중요 한. 모기 유 충에서 붐비는 조건에서 제기 하 고 일반적으로 높은 영양소 다이어트를 먹이 최고의 결과 얻을. 실험 설계 측면에서 실험실에서 모기 뚱뚱한 몸 문화 조건을 설정할 때 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 변수가 있다. 우리는 뚱뚱한 몸을 유전자 발현에 따라 크게 개인 생활 역사와 모기11,22의 영양 상태는 이전 학문에서 보였다. 모기 문화 조건이 균일 한 크기의 변화를 줄이기 위해 고 영양 실험 모기의 보유. 또한, 수행 하는 해 인사 일관 된 결과를 신속 하 고 정확한 해를 되도록 훈련 한다. 다른 얼룩 방법37,38을 사용 하 여 격리 된 지방 기관에서 세포 생존 능력을 확인할 수 있습니다.

뚱뚱한 몸 문화 실험의 실험 설계 해 수 주어진된 기간에 가능한 고려 소요 됩니다. 지방 기관의 필요한 경우, 여러 개의 절 개 세션 또는 여러 dissectors 필요할 수 있습니다. 모기와 다른 곤충에 뚱뚱한 몸 문화를 체 외에서 미래의 애플 리 케이 션의 넓은 범위가 있다. 그것은 살충제에 대 한 잠재적인 약 후보자를 테스트 하기 위해 특히 유용할 것 이다. 뚱뚱한 몸 trophocytes에 특정 기자 단백질을 표현 하는 곤충에서 유전자 변형 기술의 사용 뚱뚱한 몸 생리학의 연구에 대 한 강력한 생물 검정을 개발 하는 새로운 방법을 열 것 이다.

Disclosures

공개 하는 것이 없다.

Acknowledgments

이 연구는 2014 NMSU HHMI 부여 #52008103, 및 NSF PGR 부여 #1238731 NIH 그랜트 #SC1AI109055에 의해 지원 되었다. 우리는 NMSU 봄 2015 BIOL302 분자 방법 클래스와 Lavesh Bhatia 참가자를 뚱뚱한 몸 문화 실험 그들의 기술 지원에 대 한 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors  Fiskars 83872
Fly pad Genesee Scientific 789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial Hausherrs Machine Works, Inc. 3740-01-210-2368
Fine tip forceps World Precision Instruments, Inc.  500085
Light microscope  Leica Microsystems
96 well plate  Sigma CL S3383
Sucrose Sigma S9378
Alanine Sigma A7627
Arginine Sigma A5006
Asparagine Sigma A0884
Aspartic Acid Sigma A9256
Cysteine Sigma W326305
Glutamic Acid Sigma G1251
Glutamine Sigma G3126
Glycine Sigma G2879
Histidine Sigma H6034
Isoleucine Sigma I2752
Lysine Sigma L5501
Leucine Sigma L8000
Phenylalanine Sigma P2126
Proline Sigma P0380
Serine Sigma S4500
Threonine Sigma T8625
Tryptophan Sigma T0254
Tyrosine Sigma T3754
Valine Sigma V0500
Methionine Sigma M9625
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
MgCl2-6H2O Sigma M2670
NaHCO3 Sigma S5761
CaCl2-2H2O Sigma C8106
Tris pH8.0  Sigma T1503
EDTA Sigma E6758
ddH2O Sigma W4502

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References

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