Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fett kroppen Organ kultur-systemet i Aedes Aegypti, en vektor av Zika Virus

Published: August 19, 2017 doi: 10.3791/55508
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 4, 1,5
1Department of Biology, New Mexico State University, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University, 3Department of Computer Sciences, New Mexico State University, 4Department of Epidemiology of Microbial Diseases, Yale School of Public Health, 5Institute of Applied Biosciences, New Mexico State University

Summary

Kroppen fett er det sentrale metabolsk orgelet i insekter. Vi presenterer et levende orgel kultur system som gjør det mulig å studere reaksjoner av isolerte fett kroppsvev på ulike stimuli.

Abstract

Insekt fett kroppen spiller en sentral rolle i insekt metabolisme og næringsstoffer lagring, speiling funksjonene i lever og fettvev i virveldyr. Insekt fett kroppens vev er vanligvis distribuert gjennom insekt kroppen. Men er det ofte konsentrert i magen og festet til kroppen bukveggen.

Mygg fett kroppen er den eneste kilden til eggeplomme proteiner, som er kritiske for eggproduksjon. Derfor kultur i vitro mygg fett kroppsvev representerer en betydelig system for studier av mygg fysiologi, metabolisme, og til slutt, eggproduksjon. Fett kroppen kultur prosessen begynner med utarbeidelse av løsninger og reagenser, inkludert aminosyre lager løsninger, Aedes fysiologisk salt lager saltløsning (APS), kalsium lagerløsning og fett kroppen kultur medium. Prosessen fortsetter med fett kroppen disseksjon, etterfulgt av en eksperimentell behandling. Etter behandling, kan en rekke ulike analyser utføres, og inkludert RNA sekvensering (RNA-Seq), qPCR, Western blots, Proteomikk og metabolomics.

I vårt eksempel eksperiment viser vi protokollen gjennom excision og kultur av fett organer fra gulfeber mosquito, Aedes aegypti, en rektor vektor av arboviruses inkludert dengue, chikungunya og Zika. RNA fra fett kroppen kultivert under en fysiologisk tilstand som kalles upregulate eggeplomme proteiner versus kontrollen ble gjenstand RNA-Seq analyse å demonstrere den potensielle nytten av denne prosedyren for undersøkelser av genuttrykk.

Introduction

Myggen er vektorer av ødeleggende menneskelige sykdommer, inkludert malaria, denguefeber, chikungunya og Zika1,2,3. Til tross for intens internasjonal innsats til å dempe disse sykdommene og styre sykdom-overføre mygg befolkninger, er epidemic utbrudd av mygg-sykdommer fortsatt vanlig, særlig i utviklingsland. Effektive vaksiner mot mange av disse sykdommene er utilgjengelig eller begrenset effekt4,5. Den mest effektive måten å hindre utbrudd er å kontrollere mygg befolkninger, hovedsakelig gjennom bruk av insektmiddel behandlinger. Insektmiddel motstand har imidlertid utviklet mange mygg bestander og bli et vanlig problem rundt i verden6,7,8. Studiet av mygg fysiologi er avgjørende for utviklingen av romanen verktøy og strategier for å kontrollere sykdommen.

Mygg fett kroppen spiller en sentral rolle i næringsstoffer lagring, metabolske homeostase, reproduksjon og xenobiotic oval katabolisme9,10,11,12. Det er det hovedlageret orgelet for triglyserider, glykogen og aminosyrer i form av lagring proteiner. Det fungerer også som plassering for syntese for de fleste hemolymph proteiner og metabolitter. I mygg er kroppen fett den eneste kilden til eggeplomme protein produksjon som oppstår i kvinner når de tar en blod måltid13,14.

Den viktigste celle typen fett kroppen er store, polyploid trophocyte eller adipocyte3,9,10,12. Fett kroppens vev er organisert i fliker eller hylser og kan finnes i alle kroppsdeler av mosquito, med den største delen ligger i magen, hvor store lobes av fett kroppen er festet til kroppen bukveggen.

Presenteres her mygg fett kroppen kultur-systemet ble utviklet i ' 70s og er et kraftig verktøy for å studere fett kroppen fysiologi10, spesielt i kombinasjon med gjeldende analyseteknologier. Grunnlaget for denne teknikken er basert på isolasjon av abdominal kroppen veggene og tilknyttede fett kroppsvev. Abdominal cuticle hydrofobe natur gjør at den flyter på overflaten av den kultur mediet, med tilknyttede lobes av abdominal fett kroppen nedsenket. Den voksne og tracheolar struktur er vedlikeholdt, sikre oksygenering av kultivert vev. Heretter, vil vi referere til disse forberedelsene som "fett organer." Isolert fett kroppen være levedyktig på mer enn 12 h når ruges i passende medium (upubliserte resultater). Fett kroppen kultur er et verdifullt verktøy som har tatt en rekke spørsmål om fett kroppen endokrinologi og fysiologi9,10,12,15,16, 17.

Kulturperler fett organer kan utsettes for ulike eksperimentelle og kontroll behandlinger, tidspunktet som kan være avgjøres av utprøver. På slutten av inkubasjonstiden, kan fett organer være samlet inn og behandlet for nedstrøms analyser, blant annet qPCR16,17,18,19, Western blotting18 ,20, Proteomikk21eller metabolomics22. Eksperimenter kan utføres på forskjellige skalaer, fra personlige fett kroppene til grupper av hundrevis som kan kultivert sammen.

Representant resultatene med her var avledet fra fett organer kultivert i nærvær av aminosyrer og steroid hormon 20-hydroxy isoinokosterone simulere blod måltid aktivering av vitellogenesis16,17, 23,24. Vi analysert og forhold til differensial genuttrykk av ikke-aktivert versus aktivert fett kroppen via neste generasjons sekvensering analyse.

Protocol

1. forberede løsninger og reagenser

  1. aminosyre lagerløsning
    1. forberede en 4 X aminosyre lagerløsning 23 , 24 ved veiing og legge til 20 ulike aminosyrer i en Erlenmeyer kolbe ifølge konsentrasjonen i tabell 1.
      Merk: I noen tilfeller amino acid(s) kan utelukkes løsningen og erstattet av lik molar mengder mannitol å opprettholde en lik konsentrasjonen av osmolytes.
    2. Legge til riktig mengde ddH 2 O å produsere det ønskede volumet løsning.
    3. å sikre at aminosyrer har fullstendig oppløst, varm forsiktig mens kontinuerlig under omrøring til væsken er helt klart, det vil ta på en liten gul fargetone.
      Merk: Det kan være nødvendig å redusere pH 6 ved å legge HCl å tillate noen av de mer hydrofobe aminosyrene å oppløse.
    4. Aliquot løsningen og sterile-filter med en sprøyte-filter med en 0,2-µm pore størrelse.
    5. Lagres i lukket beholder på 20 ° C i opptil 6 måneder.
  2. APS
    Merk: se 25.
    1. For 20 X salt lagerløsning, kombinere salter oppført i tabell 2 i 50 mL vann. Rør til fullstendig oppløst.
      Merk: Det kan være nødvendig å litt varme løsningen for å løse salter.
    2. Sterile-filter med en sprøyte-filter med en 0,2-µm pore størrelse og lagre løsningen i en 50-mL tube på -20 ° C.
  3. Kalsium lagerløsning
    1. For 50 X kalsium lagerløsning, legge 0,90 g veisalt til 100 mL vann (tabell 3), rør til fullstendig oppløst.
    2. Sterile-filteret bruker en sprøyte filtrere 0,2-µm pore størrelse, aliquot løsningen i 50-mL rør, og lagre på -20 ° C.
  4. Tris buffer (pH 7.4)
    1. For Tris buffer, kombinere salt og løsningene som er oppført i Tabell 4 og legge til ddH 2 O opptil 100 mL.
    2. Sterile-filteret bruker en sprøyte filtrere med 0,2-µm porestørrelse og aliquot løsningen i 50-mL rør, lagre ved romtemperatur.
  5. Fett kroppen kultur medium
    1. for å forberede fett kroppen kultur medium, forberede alle løsningene ovenfor.
    2. Kombinere dem som volumene i tabell 5 å 200 mL fett kroppen kultur medium.
    3. Justerer pH verdien til 7.2 NaOH eller HCl.
    4. Sterile-filter løsningen filtere sprøyte med en 0,2-µm porestørrelse.
    5. Del løsningen i 15-mL dele og lagre på 20 ° C for inntil 6 måneder.

2. Forbereder disseksjon

  1. forberede en stereomicroscope (10-20 x forstørrelse) med belysning og legge ut to ultra-fin pinsett og et par mikro disseksjon saks.
  2. Forbereder alle løsninger nødvendig for eksperimentet. Tine fett kroppen kultur medium til romtemperatur.
    Merk: Precipitants kan løses ved å forsiktig varme løsningen ikke høyere enn 30 ° C.
  3. Med en aspirator, samle voksne kvinnelige mygg (3-7 dager etter fremveksten) og bedøve dem med karbondioksid eller ice.
    Merk: Når anesthetized, myggen bør holdes under CO 2 for kortest tid mulig, ikke overstiger 20 min. Alternativt, myggen kan være anesthetized på is og holdt for ca 30 min.
  4. Forberede en 6-vel plate med 3 mL APS per brønn.

3. Fett kroppen disseksjon

  1. fokus på dissecting stereomicroscope og Juster stolen til en behagelig høyde.
  2. Plassere en konkav microscope skyve på mikroskopet og legge to dråper APS Center.
  3. Plukke opp en mygg av et Ben med en pinsett og overføre den til APS overflaten på mikroskopet lysbildet.
  4. Nøye grep mosquito av thorax, med tang i venstre hånd, og rotere mosquito slik at siden ventrale er oppadgående.
  5. Hold kroppen jevn av thorax og forstå de to siste abdominal segmentene, med tang i høyre hånd, og trekk forsiktig.
    Merk: De to siste abdominal segmentene vil skille fra magen og tilknyttede eggstokkene, Malpighian tubuli, baktarm og midttarmen; noen ganger ville avling skyve ute av magen. Hvis de ikke er fjernet, lukket tips av Tang inn i det lille hullet opprettet og fjerne gjenværende vev.
  6. Satt rett tang og plukke opp våren saksen. Skyv ett blad inn i hullet i magen til segmentet under thorax. Forsiktig og raskt kutte magen lengderetningen.
    Merk: Når kuttet er gjort, magen bør begynne å utvide utover, men dette ikke kan skje umiddelbart.
  7. Fortsetter å gjøre andre kutt, som vil være en lateral kutt under thorax og under der det første kuttet endte.
    Merk: Buk skal deretter åpne opp og dissociate fra thorax, med cuticle opp og fett organer side-omgitt APS. Denne bukveggen i kroppen er fett kroppen forberedelse for kultur i vitro.
  8. Løft fett organer fra APS løsningen med spissen av et par pinsett og overføre dem fra løsningen til 6-vel plate som inneholder APS ved romtemperatur. Tillate vevet til å hvile i ca 0,5 timer før fremme til fett kroppen kulturen.

4. Fett kroppen kultur

  1. ruge fett organer på APS ved romtemperatur for minst 0,5 h å equilibrate dem.
  2. Overføre fett organer med spissen av tang og løft dem ut av APS løsningen. Senk spissen til fett kroppen kultur medium.
    Merk: Fett kroppen bør åpne på overflaten av mediet og flyter fritt. Fett kroppen kulturen utføres vanligvis i 96-brønnen plater, med 150-200 µL av medium i hver brønn. En godt kan passe opptil tre individuelle fett organer, og de er levedyktig på mer enn 12 h (upubliserte personlige resultater).
  3. Etter inkubasjonstiden, overføre fett organer fra mediet til 1.5-mL sentrifuge rør som inneholder riktige reagensene nedstrøms behandling.
    Merk: Typisk analyser inkluderer qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western blotting 18 , 20, transcriptomics 26, Proteomikk 21 eller metabolomics 22.

Representative Results

Som et eksempel, vi utført et fett kroppen kultur eksperiment og stimulert isolert fett organer av rugende dem på en løsning som inneholder en balansert blanding av alle tjue naturlig forekommende aminosyrer og insekt steroid hormon 20-hydroxy isoinokosterone (10 µM) 6 h . Som en kontroll, ble fett organer inkubert på APS for en lik mengde tid.

Etter inkubasjon ble den totale RNA isolert med en tri-reagens27 følge instruksjonene fra produsenten. Kvaliteten og kvantiteten av utdraget RNA prøver ble vurdert med et spektrofotometer, fluorometric kvantifisering og agarose gel geleelektroforese. RNA sekvensering biblioteker ble generert ved hjelp av 4 µg av totalt og kvantifisert bruker to ulike teknikker. Deretter ble bibliotekene sendt til en kommersiell leverandør for sammenkoblede slutten-sekvensering.

Resultatet av dette eksperimentet er vist i tabell 6. Gener viser sterkeste transcriptional svaret aminosyre og 20-hydroxyecdysone var hovedsakelig eggeplomme protein gener, som er i samsvar med tidligere resultater11.

Figur 1 viser en varmekart som angir gene expression nivåene av 1,256 ulikt uttrykt gener fra kulturperler fett kroppen etter to ulike behandlinger.

Figure 1
Figur 1 . Varmekartet av gener som er uttrykt i fett kroppen kultur. Varmekartet ble beregnet basert på antall bestemte transkripsjoner for hver genet i ulike bibliotekene bruker heatmap pakken28 som en del av R programvaremiljø. Mørkere skygge representerer høyere genuttrykk. 1,256 gener med statistisk signifikant variasjon i uttrykket (Q-verdiene < 0,05) vises. Gener er sortert i henhold til tilgangsnivåene gjennomsnitt uttrykk, angitt av dendrogram til venstre (ikke i deres phylogenetic relasjoner). Merk det høye antallet gener med opp - eller ned-regulert uttrykk etter stimulering med aminosyrer (AA) og 20-hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes fysiologiske saline. Se ekstra fil 1 en liste av gener og deres relative uttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Aminosyre Molekylvekt g/mol mM konsentrasjon mg per Liter mg for 300 mL volum
Alanin 89.1 26.68 2377.19 713.16
Arginin 174.2 26.68 4647.66 1394.3
Asparagine 150.1 26.68 4004.67 1201.4
Aspartic syre 133 26.68 3548.44 1064.53
Cystein 121.16 10.68 1293.99 388.2
Glutaminsyre 147.1 26.68 3924.63 1177.39
Glutamin 146 26.68 3895.28 1168.58
Glysin 75 53.32 3999 1199.7
Histidin 155.16 80 12412.8 3723.84
Isoleucin 131 10.68 1399.08 419.72
Lycine 183 26.68 4882.44 1464.73
Leucine 131 26.68 3495.08 1048.52
Fenylalanin 165 10.68 1762.2 528.66
ProLine 115 26.68 3068.2 920.46
Serine 105 53.32 5598.6 1679.58
Threonin 119 10.68 1270.92 381.28
Tryptofan 204 10.68 2178.72 653.62
Tyrosin 181 5,32 962.92 288.88
Valin 117 10.68 1249.56 374.87
Metionin 149 10.68 1591.32 477.4

Tabell 1. 4 x aminosyre lagerløsning.

Komponent Vekt i gram lagt til 50 ml ddH2O
NaCl 8.0 g
KCl 0.074 g
MgCl2-6 H2O 0.120 g
NaHCO3 0.0250 g

Tabell 2. 20 X salt lagerløsning.

Komponent Vekt i gram lagt til 100 ml ddH2O
CaCl2-2 H2O 0,90 g

g > tabell 3. 50 x kalsium lagerløsning.

Komponent Konsentrasjonen av lagerløsning Volum lager 100 ml bufferen
Tris pH8.0 1 M 5 mL
EDTA 0,25 M 2 mL
NaCl NA 0,3 g
ddH2O NA til 100 mL (~ 93 mL)

Tabell 4. Tris buffer.

Komponent Volum lager for 200 ml
Aminosyren lagerløsning 150 mL
Salt lager løsning 10 mL
Kalsium lagerløsning 4 mL
TES Buffer 10 mL
ddH2O 26 mL

Tabell 5. Fett kroppen kultur medium.

Merknad Gene beskrivelse Kaste endring P-verdien
AAEL006138 Vitellogenin-B 3443 2.52E-112
AAEL006126 Vitellogenin-C 2795 8.64E-91
AAEL006563 vitellogenic karboksypeptidase 1002 2.17E-119
AAEL010434 Vitellogenin-A 220 1.14E-27
AAEL006542 vitellogenic karboksypeptidase 185 2.14E-65
AAEL012678 AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%) 96 4.00E-70
AAEL000080 hypotetisk protein 82 6.69E-188
AAEL015312 Vitellogenic katepsin B 77 1.27E-15
AAEL009588 kjernefysisk reseptor 3 75 4.58E-56
AAEL010529 hypotetisk protein 66 1.32E-29

Tabell 6. Eksperimentelle resultater.

Ekstra fil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Insekt orgel kultur ble brukt mye å studere insekt endokrinologi, utvikling og metabolisme, så vel som å undersøke samhandlingen mellom bestemte organer og bakteriell symbionter29,30,31, 32,33,34. In vitro fett kroppen orgel kultur ble brukt spesielt til å studere aminosyre transport og regulering av eggeplomme protein produksjon i mygg og andre insekter16,17,35 , 36. under av vitellogenesis, mygg fett kroppen bruker en rekke høy spesifisitet aminosyre transportører importere blod måltid-avledet aminosyrer fra hemolymph å syntetisere store mengder eggeplomme proteiner12 ,19,35,36. Fett kroppen kultur var medvirkende til avgrensning av fett kroppen ernæringsmessige kravene i denne sammenheng18.

Kvaliteten på utgangsmaterialet, kvinnelige mygg, er avgjørende for suksessen til disse eksperimentene. Larvene oppvokst i under overfylt forhold og matet på høy-næringsstoffer dietter vanligvis gi de beste resultatene. Det er noen viktige variabler å vurdere når etablere mygg fett kroppen kultur forhold i laboratoriet i eksperimentell design. Vi viste tidligere studier som fett kroppen genuttrykk varierer betydelig avhengig av personlige livshistorie og ernæringsmessig status mygg11,22. Mygg kultur betingelsene skal uniform å redusere variasjon i størrelsen og ernæringsmessige reserver av eksperimentelle myggen. I tillegg bør skal utføre disseksjoner trenes å sikre rask og nøyaktig disseksjoner med konsistente resultater. Cellen levedyktighet i isolerte fett kroppen kan kontrolleres ved hjelp av ulike flekker metoder37,38.

Eksperimentell design av et fat kroppen kultur eksperiment bør ta i betraktning antall dissections i en gitt tidsperiode. Når store mengder fett organer, kan disseksjon økter eller flere dissectors være nødvendig. Det er et bredt spekter av framtidige applikasjoner for i vitro fett kroppen kultur i mygg og andre insekter. Det vil være spesielt nyttig for testing av potensielle narkotika kandidater for insekt kontroll. Bruk av transgene teknikker i insekter å uttrykke spesifikke reporter proteiner i fett kroppen trophocytes vil åpne opp nye metoder å utvikle kraftige bioassay for å studere fett kroppen fysiologi.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av NIH grant #SC1AI109055, i 2014 NMSU HHMI grant #52008103 og NSF PGR gi #1238731. Vi takker deltakerne på NMSU våren 2015 BIOL302 molekylær metoder klassen og Lavesh Bhatia for deres teknisk støtte med fett kroppen cellekulturer eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors  Fiskars 83872
Fly pad Genesee Scientific 789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial Hausherrs Machine Works, Inc. 3740-01-210-2368
Fine tip forceps World Precision Instruments, Inc.  500085
Light microscope  Leica Microsystems
96 well plate  Sigma CL S3383
Sucrose Sigma S9378
Alanine Sigma A7627
Arginine Sigma A5006
Asparagine Sigma A0884
Aspartic Acid Sigma A9256
Cysteine Sigma W326305
Glutamic Acid Sigma G1251
Glutamine Sigma G3126
Glycine Sigma G2879
Histidine Sigma H6034
Isoleucine Sigma I2752
Lysine Sigma L5501
Leucine Sigma L8000
Phenylalanine Sigma P2126
Proline Sigma P0380
Serine Sigma S4500
Threonine Sigma T8625
Tryptophan Sigma T0254
Tyrosine Sigma T3754
Valine Sigma V0500
Methionine Sigma M9625
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
MgCl2-6H2O Sigma M2670
NaHCO3 Sigma S5761
CaCl2-2H2O Sigma C8106
Tris pH8.0  Sigma T1503
EDTA Sigma E6758
ddH2O Sigma W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benelli, G., Mehlhorn, H. Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control. Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).
  2. Newby, G., et al. The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries. Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).
  3. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
  4. Long, C. A., Zavala, F. Malaria vaccines and human immune responses. Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).
  5. Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines. Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).
  6. Frings, S., Lindemann, B. Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride. J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).
  7. Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).
  8. Yewhalaw, D., et al. Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program. PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).
  9. Arrese, E. L., Soulages, J. L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).
  10. Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Chapman & Hall. London. 507-522 (1997).
  11. Price, D. P., et al. The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal. PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).
  12. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Front Physiol. 5, 103 (2014).
  13. Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. Accumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).
  14. Raikhel, A. S., et al. Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).
  15. Hansen, I. A., Attardo, G. M. Ch. 6. Short Views on Insect Molecular Biology. Chandrasekar, R. , International Book Mission. South India. (2009).
  16. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).
  17. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).
  18. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction. J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).
  19. Carpenter, V. K., et al. SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction. J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).
  20. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).
  21. Hugo, L. E., et al. Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission. PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).
  22. Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasit Vectors. 8, 252 (2015).
  23. Uchida, K., et al. Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids. J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).
  24. Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal. J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).
  25. Hayes, E. Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L). J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).
  26. Price, D. P., et al. The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal. Plos One. 6 (7), e22573 (2011).
  27. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).
  28. Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe. PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).
  29. Larsen, W. P. Growth in an insect organ culture. J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).
  30. Judy, K. J., et al. Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta. Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).
  31. Marks, E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures. Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).
  32. Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System. PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).
  33. Postlethwait, J. H., Handler, A. M. Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).
  34. Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes. J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).
  35. Boudko, D. Y., et al. Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti. Nat Commun. 6, 8546 (2015).
  36. Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon. Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).
  37. Jones, K. H., Senft, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).
  38. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).

Tags

Infeksjonssykdommer problemet 126 fett kroppen orgel kultur mygg Aedes aegypti ernæring vitellogenesis
Fett kroppen Organ kultur-systemet i <em>Aedes Aegypti</em>, en vektor av Zika Virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chung, H. N., Rodriguez, S. D.,… More

Chung, H. N., Rodriguez, S. D., Carpenter, V. K., Vulcan, J., Bailey, C. D., Nageswara-Rao, M., Li, Y., Attardo, G. M., Hansen, I. A. Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus. J. Vis. Exp. (126), e55508, doi:10.3791/55508 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter