Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الجسم الدهون نظام الثقافة الجهاز في بعوض الزاعجة المصرية، ناقل للفيروس Zika

Published: August 19, 2017 doi: 10.3791/55508
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 4, 1,5
1Department of Biology, New Mexico State University, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University, 3Department of Computer Sciences, New Mexico State University, 4Department of Epidemiology of Microbial Diseases, Yale School of Public Health, 5Institute of Applied Biosciences, New Mexico State University

Summary

الجسم الدهون هو الجهاز المركزي الأيضي في الحشرات. نقدم نظام جهاز يعيش ثقافة التي تمكن المستخدم من دراسة ردود أنسجة الجسم الدهون منعزلة للمنبهات المختلفة.

Abstract

الجسم الدهون الحشرات يلعب دوراً مركزياً في الأيض الحشرات وتخزين المواد الغذائية، النسخ المتطابق لوظائف الكبد والأنسجة الدهنية في الفقاريات. عادة ما يتم توزيع أنسجة الجسم الدهون الحشرات في جميع أنحاء الجسم الحشرات. ومع ذلك، غالباً ما تتركز في البطن وتعلق على هيئة جدار البطن.

الجسم الدهون البعوض هو المصدر الوحيد لصفار البيض والبروتينات، والتي تعتبر حاسمة بالنسبة لإنتاج البيض. ولذلك، يمثل ثقافة أنسجة الجسم الدهون البعوض في المختبر نظاما هاما لدراسة فسيولوجيا البعوض، التمثيل الغذائي، وفي نهاية المطاف، إنتاج البيض. وتبدأ عملية الثقافة الدهون الجسم بإعداد الحلول والمواد الكاشفة، بما في ذلك حلول الأسهم من الأحماض الأمينية و بعوض المحلول الملحي الفسيولوجي الملح حل الأسهم (الجزائرية) وحل مخزون الكالسيوم والجسم الدهون الثقافة المتوسطة. ما زالت العملية مع تشريح الجسم الدهون، متبوعاً علاج تجريبي. وبعد العلاج، ويمكن أن يؤديها مجموعة متنوعة من تحليلات مختلفة، بما في ذلك الحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-Seq)، قبكر والبقع الغربية، البروتيوميات وجميع.

في تجربتنا مثال، نبدي البروتوكول عن طريق الختان والثقافة الهيئات الدهون من البعوض الحمى الصفراء، بعوض الزاعجة المصرية، ناقل الرئيسي من سيتناقش بما في ذلك حمى الضنك وداء شيكونغونيا وزكى. الجيش الملكي النيبالي من الهيئات الدهون مثقف تحت شرط فسيولوجية المعروفة لبروتينات صفار upregulate مقابل السيطرة تخضع لتحليل الحمض النووي الريبي Seq لإثبات الفائدة المحتملة لهذا الإجراء لإجراء تحقيقات تعبير الجيني.

Introduction

البعوض ناقلات الأمراض البشرية المدمرة، بما في ذلك الملاريا وحمى الضنك وداء شيكونغونيا و Zika1،،من23. وعلى الرغم من الجهود الدولية المكثفة للحد من هذه الأمراض ومراقبة السكان البعوض يحيل بها المرض، انتشار الأوبئة للأمراض التي ينقلها البعوض لا تزال شائعة، لا سيما في البلدان النامية. لقاحات فعالة ضد العديد من هذه الأمراض أما غير متوفرة أو لفعالية محدودة4،5. الطريقة الأكثر فعالية للحيلولة دون تفشي السيطرة على البعوض السكان، أساسا من خلال استخدام المبيدات الحشرية العلاجات. ومع ذلك، وضعت في العديد من البعوض السكان مقاومة المبيدات الحشرية وأصبحت مشكلة شائعة في جميع أنحاء العالم6،،من78. دراسة علم وظائف الأعضاء البعوض أمر ضروري لتطوير أدوات جديدة واستراتيجيات السيطرة على المرض.

الجسم الدهون البعوض يلعب دوراً مركزياً في تخزين المواد الغذائية والتوازن الأيضي، والاستنساخ، وتقويض إكسينوبيوتيك9،10،،من1112. هو جهاز التخزين الرئيسي للشحوم، والجليكوجين، والأحماض الأمينية في شكل بروتينات التخزين. وهو يعمل أيضا كموقع التوليف لمعظم البروتينات hemolymph ونواتج الأيض. في البعوض، والجسد الدهون هو المصدر الوحيد لإنتاج البروتين الصفار الذي يحدث في الإناث بعد أن تأخذ وجبة الدم13،14.

نوع الخلايا الرئيسية للجسم الدهون هو تروفوسيتي كبير، الكروموزومية أو adipocyte3،9،،من1012. ينقسم إلى الفصوص أو مانعات أنسجة الجسم الدهون ويمكن العثور عليها في جميع أجزاء الجسم من البعوض، مع الجزء الأكبر يقع في البطن، حيث يتم إرفاق الفصوص كبيرة من الدهون في الجسم على هيئة جدار البطن.

النظام ثقافة الجسم الدهون البعوض المعروضة هنا وضعت في السبعينات وما زالت أداة قوية لدراسة الجسم الدهون علم وظائف الأعضاء10، لا سيما في تركيبة مع تحليل التكنولوجيات الحالية. ويستند أساسا لهذا الأسلوب عزل جدران الجسم البطن والأنسجة المرتبطة بها الدهون في الجسم. طبيعة بشرة البطن مسعور يتسبب في أن تطفو على سطح متوسط الثقافة، مع الفصوص المرفقة من البطن الدهون الجسم مغمورة. يتم الحفاظ على سبيراكليس وهيكل تراتشيولار، تأمين الأوكسجين للأنسجة المستزرعة. من الآن فصاعدا، سوف نشير إلى هذه الأعمال التحضيرية باعتبارها "هيئات الدهون." الهيئات الدهون منعزلة البقاء لأكثر من 12 ح عند المحتضنة في الوسيلة المناسبة (نتائج غير منشورة). الثقافة الدهون في الجسم هو أداة قيمة وقد تناول مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة بالدهون الجسم الغدد الصماء وعلم وظائف الأعضاء9،10،،من1215،16، 17.

مثقف الدهون الهيئات يمكن أن تخضع لمختلف التجارب والتحكم في العلاجات، توقيت التي يمكن أن يقررها المحقق. في نهاية فترة الحضانة، يمكن جمع الهيئات الدهون ومعالجته لتحليلات المتلقين للمعلومات، بما في ذلك قبكر16،17،،من1819، الغربية النشاف18 ،20، البروتيوميات21أو22من جميع. يمكن إجراء تجارب على نطاقات مختلفة، من الهيئات الدهون الفردية لمجموعات من مئات التي يمكن أن تكون مثقف معا.

نتائج تمثيلية شملت هنا مستمدة من الدهون الهيئات مثقف حضور الأحماض الأمينية و ecdysone 20-هيدروكسي هرمون الستيرويد لمحاكاة التنشيط وجبة الدم من، فيتيلوجينيسيس،من1617 ،من 2324. يمكننا تحليل ومقارنة التعبير الجيني التفاضلي لعدم تنشيط مقابل تنشيط الهيئات الدهون عن طريق تحليل تسلسل الجيل القادم.

Protocol

1-إعداد الحلول والمواد الكاشفة

  1. حل الأسهم من الأحماض الأمينية
    1. تحضير 4 X الأحماض الأمينية حل الأسهم 23 ، 24 بوزنها و إضافة الأحماض الأمينية مختلفة 20 قارورة Erlenmeyer وفقا للتركيزات الواردة في الجدول 1-
      ملاحظة: في بعض الحالات، amino acid(s) يمكن استبعادها من الحل والاستعاضة عنها بكميات متساوية المولى من المانيتول الاحتفاظ بتركيز متساو من أوسموليتيس-
    2. إضافة مبلغ ddH 2 س لإنتاج وحدة التخزين المطلوبة للحل المناسب-
    3. لضمان أن يكون تماما حل الأحماض الأمينية، الحرارة بلطف مع التحريك باستمرار حتى السائل واضح تماما؛ وسوف يستغرق على لوناً أصفر طفيف.
      ملاحظة: قد تكون ضرورية لخفض درجة الحموضة إلى 6 بإضافة HCl للسماح لبعض من الأحماض الأمينية مسعور أكثر بحل.
    4. قاسمة الحل والعقيمة عامل تصفية باستخدام عامل تصفية المحاقن مع 0.2-ميكرومتر المسامية الحجم.
    5. تخزين في حاوية محكمة الإغلاق في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. وكالة الأنباء الجزائرية
    ملاحظة: انظر 25.
    1. ل 20 X الملح حل الأسهم، والجمع بين الأملاح المدرجة في الجدول 2 في 50 مل الماء. يقلب حتى يذوب تماما.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري على الحرارة قليلاً الحل لإذابة الأملاح تماما.
    2. ستيريلي-تصفية باستخدام عامل تصفية المحاقن مع 0.2-ميكرومتر المسامية الحجم وتخزين الحل في أنبوب 50 مل في-20 درجة مئوية.
  3. الكالسيوم المخزون الحل
    1. 50 س الحل مخزون الكالسيوم، أضف ز 0.90 من كلوريد الكالسيوم إلى 100 مل الماء (الجدول 3)؛ ويحرك حتى يذوب تماما.
    2. ستيريل-تصفية باستخدام المحاقن تصفية مع حجم مسام 0.2 ميكرومتر، الكوة الحل في أنابيب 50 مل، وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  4. تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4)
    1. تريس المخزن المؤقت، والجمع بين الملح والحلول المدرجة في الجدول 4 وإضافة ddH 2 س يصل إلى 100 مل.
    2. ستيريل-تصفية باستخدام المحاقن تصفية مع حجم المسام 0.2 ميكرون وقاسمه الحل في أنابيب 50 مل؛ وتخزين في درجة حرارة الغرفة-
  5. الجسم الدهون الثقافة المتوسطة
    1. بإعداد متوسطة الثقافة الجسم الدهون، إعداد جميع الحلول المذكورة أعلاه-
    2. الجمع بينهما وفقا لوحدات التخزين في الجدول 5 جعل 200 مل من الجسم الدهون الثقافة المتوسطة.
    3. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو HCl.
    4. ستيريل-تصفية الحل باستخدام عامل تصفية المحاقن مع حجم مسام 0.2 ميكرون.
    5. تقسيم الحل إلى مختبرين 15 مل وتخزينها في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. إعداد لتشريح

  1. إعداد ستيريوميكروسكوبي (10-20 x التكبير) مع الإضاءة ووضع ملاقط فائقة غرامة اثنين ومقص التشريح الصغير-
  2. إعداد كافة الحلول اللازمة للتجربة. ذوبان الجليد المتوسط الثقافة الدهون في الجسم إلى درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن حل بريسيبيتانتس بلطف تدفئة حل لا تزيد عن 30 درجة مئوية.
  3. مع المضخة، جمع البعوض الإناث البالغات (3-7 أيام بعد ظهور) وتخدير لهم باستخدام ثاني أكسيد الكربون أو مدت
    ملاحظة: مرة تخديره، البعوض ينبغي أن يظل قيد CO 2 لأقصر وقت ممكن، لا تتجاوز 20 دقيقة بدلاً من ذلك، يمكن تخديره على الجليد البعوض والاحتفاظ بها لما يقرب من 30 دقيقة
  4. إعداد لوحة 6-جيدا مع 3 مل من وكالة الأنباء الجزائرية في بئر-

3. تشريح جثة الدهون

  1. التركيز ستيريوميكروسكوبي تشريح وضبط الرئاسة إلى ارتفاع مريحة.
  2. وضع شريحة مجهر مقعر على سطح مجهر وإضافة نقطتين من وكالة الأنباء الجزائرية إلى المركز-
  3. التقاط البعوض بساق باستخدام ملقط وأنه نقل إلى السطح الجزائرية على الشريحة المجهر.
  4. بعناية قبضة البعوض بالصدر، مع الملقط في اليد اليسرى، وتدوير البعوض حيث يكون الجانب البطني صعودا.
  5. بينما يمسك الجسم ثابت بالصدر، فهم أجزاء البطن الأخيرين، مع الملقط في اليد اليمنى، واجذب.
    ملاحظة: فصل آخر جزئين البطن من البطن والمبايض المرفقة، Malpighian الأنابيب، والمعي الخلفي والامامي؛ في بعض الأحيان سوف الشريحة المحصول من البطن. إذا كانوا قد لا أزيلت، إدراج نصائح مغلقة الملقط في حفرة صغيرة تم إنشاؤها وإزالة الأنسجة المتبقية.
  6. جانبا الملقط حق وتلتقط المقص الربيع. شريحة شفرة واحد في الحفرة في البطن حتى الجزء أسفل الصدر. بلطف وسرعة قطع البطن طوليا.
    ملاحظة: بمجرد القص، البطن ينبغي البدء في التوسع إلى الخارج، على الرغم من أن هذا قد لا يحدث فورا.
  7. المضي قدما لجعل خفض الثاني، الذي سوف يكون قطع أفقي أسفل الصدر، وأقل قليلاً من حيث انتهى أول خطوة من نوعها-
    ملاحظة: البطن ينبغي ثم فتح وتنأى عن الصدر، مع بشرة أعلى والهيئات الدهون الجانب مغمورة داخل وكالة الأنباء الجزائرية. هذا الجدار الجسم البطن وهو إعداد الجسم الدهون للثقافة في المختبر.
  8. رفع الجثث الدهون من وكالة الأنباء الجزائرية الحل باستخدام التلميح لزوج من الملقط ونقلها من الحل إلى لوحة 6-كذلك يتضمن وكالة الأنباء الجزائرية في درجة حرارة الغرفة. تسمح الأنسجة إلى الراحة لحوالي 0.5 ح قبل الانتقال إلى ثقافة الجسم الدهون.

4. ثقافة الجسم الدهون

  1. احتضان الهيئات الدهون في وكالة الأنباء الجزائرية في درجة حرارة الغرفة لمالا يقل عن 0.5 ح حجته لهم.
  2. نقل الهيئات الدهون باستخدام تلميح الملقط وانتشالهم بلطف الحل وكالة الأنباء الجزائرية. أدنى التلميح إلى المتوسطة ثقافة الجسم الدهون.
    ملاحظة: يجب فتح على سطح المتوسط الجسم الدهون والتعويم الحر. ثقافة الجسم الدهون تتم عادة في لوحات 96-جيدا، مع 150-200 ميليلتر من المتوسط في كل بئر. أحد جيدا يمكن أن يصلح يصل إلى ثلاث هيئات الدهون الفردية، وأنها قابلة للتطبيق لأكثر من 12 ح (نتائج شخصية غير منشورة).
  3. بعد فترة الحضانة، نقل جثث الدهون من المتوسط إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل يحتوي على الكواشف الملائمة للتجهيز النهائي.
    ملاحظة: تشمل تحليلات نموذجية قبكر 16 ، 17 ، ، من 18 19، الغربية النشاف 18 ، 20 ترانسكريبتوميكس 26، البروتيوميات 21 أو 22 من جميع.

Representative Results

على سبيل مثال، إجراء تجربة ثقافة جسم الدهون وتحفيز الهيئات الدهون منعزلة من حضانة لهم في محلول يحتوي على مزيج متوازن من جميع الأحماض الأمينية العشرين التي تحدث بشكل طبيعي وهرمون الستيرويد الحشرات 20-هيدروكسي اكديسوني (10 ميكرون) ح 6 . كعنصر تحكم، كانت الهيئات الدهون المحتضنة في وكالة الأنباء الجزائرية لمبلغ مساو من الوقت.

بعد الحضانة، كان مجموع الجيش الملكي النيبالي المعزولة باستخدام كاشف ثلاثي27 اتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم تقييم نوعية وكمية من عينات الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام جهاز المطياف الضوئي، كوانتيتيشن فلوروميتريك، والتفريد [اغروس] هلام. مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي تم إنشاؤها باستخدام 4 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، وتم تحديده كمياً باستخدام تقنيات مختلفة اثنين. في وقت لاحق، أرسلت المكتبات إلى موفر خدمة تجارية للتسلسل نهاية الاقتران.

وترد نتائج هذه التجربة في الجدول 6. وكانت الجينات تظهر الاستجابة النسخي أقوى من الأحماض الأمينية و 20-هيدروكسيكديسوني أساسا صفار البروتين الجينات، وما يتفق مع النتائج السابقة11.

ويبين الشكل 1 حرارة خريطة تبين مستويات التعبير الجيني 1,256 خلطات أعرب الجينات من مثقف الدهون الهيئات بعد اثنين من العلاجات المختلفة.

Figure 1
الشكل 1 . الحرارة خريطة الجينات التي أعرب عنها في ثقافة الجسم الدهون. وكان حساب الحرارة خريطة استناداً إلى عدد النصوص المحددة لكل الجينات في مكتبات مختلفة باستخدام حزمة heatmap28 الذي يعد جزءا من بيئة البرامج R. يمثل أغمق التعبير الجيني أعلى. جينات 1,256 مع اختلاف يعتد به إحصائيا في التعبير (قيم س-< 0.05) وترد. يتم ترتيب الجينات وفقا لمستويات التعبير المتوسط، أشارت إلى جانب ديندروجرام على اليسار (لا وفقا لعلاقاتهم النشوء والتطور). لاحظ العدد الكبير من الجينات مع التعبير أعلى أو أسفل ينظم بعد التحفيز بالأحماض الأمينية (أإ) و 20-هيدروكسيكديسوني (20E). وكالة الأنباء الجزائرية = المحلول الملحي الفسيولوجي بعوض . انظر تكميلية الملف 1 للحصول على قائمة من الجينات، ومستويات التعبير النسبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

حمض أميني الوزن الجزيئي غ/مول مم تركيز ملغم للتر الواحد مغ لحجم 300 مل
ألانين 89.1 26.68 2377.19 713.16
ارجينين 174.2 26.68 4647.66 1394.3
أسباراجين 150.1 26.68 4004.67 1201.4
حمض الأسبارتيك 133 26.68 3548.44 1064.53
سيستين 121.16 10.68 1293.99 388.2
حمض الغلوتاميك 147.1 26.68 3924.63 1177.39
الجلوتامين 146 26.68 3895.28 1168.58
جليكاين 75 53.32 3999 1199.7
الحامض الأميني 155.16 80 12412.8 3723.84
آيسولوسين 131 10.68 1399.08 419.72
ليسين 183 26.68 4882.44 1464.73
ليوسيني 131 26.68 3495.08 1048.52
فينيلألانين 165 10.68 1762.2 528.66
برولين 115 26.68 3068.2 920.46
سيرين 105 53.32 5598.6 1679.58
ثريونين 119 10.68 1270.92 381.28
التربتوفان 204 10.68 2178.72 653.62
تيروزين 181 5.32 962.92 288.88
فالين 117 10.68 1249.56 374.87
الميثيونين 149 10.68 1591.32 477.4

الجدول 1. 4 X حل الأسهم من الأحماض الأمينية.

المكون الوزن بالجرام إضافة إلى 50 مل ddH2س
كلوريد الصوديوم ز 8.0
بوكل ز 0.074
مجكل2-6 ح2س ز 0.120
ناكو3 ز 0.0250

الجدول 2- 20 X الملح حل الأسهم.

المكون الوزن بالجرام إضافة إلى 100 مل ddH2O
كاكل2-2 ح2س ز 0.90

ز > الجدول 3. 50 س الحل مخزون الكالسيوم.

المكون تركيز حل الأسهم تقييم حجم المخزن المؤقت 100 مل
تريس pH8.0 م 1 5 مل
يدتا 0.25 M 2 مل
كلوريد الصوديوم نا ز 0.3
ddH2س نا إلى 100 مل (~ 93 مل)

الجدول 4- العازلة تريس.

المكون تقييم حجم 200 مل
حل الأسهم من الأحماض الأمينية 150 مل
حل الأسهم الملح 10 مل
حل مخزون الكالسيوم 4 مل
المخزن المؤقت لقسم التدريب والامتحانات 10 مل
ddH2O مل 26

الجدول 5- هيئة الدهون الثقافة المتوسطة.

تعليق توضيحي وصف الجينات أمثال التغيير قيمة P
AAEL006138 ب-تغيرات 3443 2.52E--112
AAEL006126 ج-تغيرات 2795 8.64E-91
AAEL006563 كاربوكسيبيبتيداسي فيتيلوجينيك 1002 2.17E--119
AAEL010434 تغيرات-أ 220 1.14E-27
AAEL006542 كاربوكسيبيبتيداسي فيتيلوجينيك 185 2.14E--65
AAEL012678 AAEL003006-السلطة الفلسطينية [بعوضة aegypti](65%) 96 4.00E-70
AAEL000080 البروتين افتراضية 82 6.69E-188
AAEL015312 كاثيبسين فيتيلوجينيك ب 77 1.27E-15
AAEL009588 مستقبلات النووية 3 75 4.58E--56
AAEL010529 البروتين افتراضية 66 1.32E--29

الجدول 6- النتائج التجريبية.

الملف الإضافي 1- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

الثقافة الحشرات الجهاز كان يستخدم على نطاق واسع دراسة الحشرات علم الغدد الصماء، والتنمية، والايض، فضلا عن التحقيق في التفاعل بين أجهزة محددة والبكتيرية سيمبيونتس29،،من3031، 32،،من3334. واستخدمت في المختبر الجسم الدهون جهاز الثقافة تحديداً لدراسة النقل من الأحماض الأمينية وتنظيم إنتاج البروتين صفار في البعوض وغيرها17،16، ديبتيرا35 , 36-أثناء عملية فيتيلوجينيسيس، يستخدم الجسم الدهون البعوض صفيف الناقلين الأحماض الأمينية خصوصية عالية لاستيراد الأحماض الأمينية المستمدة من وجبة الدم من هيموليمف لتجميع كميات كبيرة من بروتينات صفار12 ،19،،من3536. ثقافة الجسم الدهون كانت مفيدة لتحديد المتطلبات الغذائية الجسم الدهون في هذا السياق18.

نوعية المواد البداية، أنثى البعوض، أمر حاسم لنجاح هذه التجارب. يرقات البعوض التي أثيرت في ظروف مزدحمة تحت وتتغذى على الوجبات الغذائية العالية في المغذيات وعادة ما ينتج أفضل النتائج. وهناك بعض المتغيرات الهامة في الاعتبار عند وضع شروط ثقافة الجسم الدهون البعوض في المختبر من حيث التصميم التجريبي. أظهرنا في دراسات سابقة أن التعبير الجيني الجسم الدهون تتفاوت تفاوتاً كبيرا تبعاً لتاريخ حياة الفرد والحالة التغذوية ل البعوض11،22. يجب أن تكون شروط الثقافة البعوض موحدة للحد من التفاوت في الحجم والاحتياطيات الغذائية للبعوض التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تدريب الموظفين يؤدون تشريح لضمان تشريح سريعة ودقيقة مع نتائج متسقة. يمكن التحقق من صلاحية خلية في هيئات الدهون منعزلة باستخدام مختلف الأساليب المصبوغة37،38.

تصميم تجريبي لتجربة ثقافة الجسم الدهون ينبغي أن تأخذ في الاعتبار عدد تشريح ممكن في فترة زمنية معينة. عندما يتطلب الأمر كميات كبيرة من الدهون في الهيئات، دورات تشريح متعددة أو dissectors متعددة قد يكون ضروريا. وهناك طائفة واسعة من التطبيقات المستقبلية للثقافة في المختبر الجسم الدهون في البعوض وغيرها من الحشرات. أنه سوف يكون مفيداً بشكل خاص لاختبار المرشحين المحتملين من المخدرات لمكافحة الحشرات. استخدام التقنيات المعدلة وراثيا في الحشرات للتعبير عن البروتينات مراسل محددة في الجسم الدهون تروفوسيتيس سوف تفتح طرق جديدة لتطوير المقايسة قوية لدراسة فسيولوجيا الجسم الدهون.

Disclosures

ليس لدينا شيء الكشف عنها.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث المعاهد الوطنية للصحة منحة #SC1AI109055، منح NMSU HHMI #52008103 2014، وجبهة الخلاص الوطني مكتب المدعي العام الاتحادي منح #1238731. ونحن نشكر المشاركين في فئة NMSU ربيع عام 2015 BIOL302 الأساليب الجزيئية ولافيش باتيا على دعمها التقني مع تجارب الثقافة الجسم الدهون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors  Fiskars 83872
Fly pad Genesee Scientific 789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial Hausherrs Machine Works, Inc. 3740-01-210-2368
Fine tip forceps World Precision Instruments, Inc.  500085
Light microscope  Leica Microsystems
96 well plate  Sigma CL S3383
Sucrose Sigma S9378
Alanine Sigma A7627
Arginine Sigma A5006
Asparagine Sigma A0884
Aspartic Acid Sigma A9256
Cysteine Sigma W326305
Glutamic Acid Sigma G1251
Glutamine Sigma G3126
Glycine Sigma G2879
Histidine Sigma H6034
Isoleucine Sigma I2752
Lysine Sigma L5501
Leucine Sigma L8000
Phenylalanine Sigma P2126
Proline Sigma P0380
Serine Sigma S4500
Threonine Sigma T8625
Tryptophan Sigma T0254
Tyrosine Sigma T3754
Valine Sigma V0500
Methionine Sigma M9625
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
MgCl2-6H2O Sigma M2670
NaHCO3 Sigma S5761
CaCl2-2H2O Sigma C8106
Tris pH8.0  Sigma T1503
EDTA Sigma E6758
ddH2O Sigma W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benelli, G., Mehlhorn, H. Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control. Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).
  2. Newby, G., et al. The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries. Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).
  3. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
  4. Long, C. A., Zavala, F. Malaria vaccines and human immune responses. Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).
  5. Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines. Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).
  6. Frings, S., Lindemann, B. Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride. J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).
  7. Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).
  8. Yewhalaw, D., et al. Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program. PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).
  9. Arrese, E. L., Soulages, J. L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).
  10. Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Chapman & Hall. London. 507-522 (1997).
  11. Price, D. P., et al. The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal. PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).
  12. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Front Physiol. 5, 103 (2014).
  13. Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. Accumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).
  14. Raikhel, A. S., et al. Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).
  15. Hansen, I. A., Attardo, G. M. Ch. 6. Short Views on Insect Molecular Biology. Chandrasekar, R. , International Book Mission. South India. (2009).
  16. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).
  17. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).
  18. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction. J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).
  19. Carpenter, V. K., et al. SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction. J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).
  20. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).
  21. Hugo, L. E., et al. Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission. PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).
  22. Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasit Vectors. 8, 252 (2015).
  23. Uchida, K., et al. Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids. J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).
  24. Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal. J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).
  25. Hayes, E. Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L). J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).
  26. Price, D. P., et al. The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal. Plos One. 6 (7), e22573 (2011).
  27. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).
  28. Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe. PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).
  29. Larsen, W. P. Growth in an insect organ culture. J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).
  30. Judy, K. J., et al. Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta. Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).
  31. Marks, E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures. Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).
  32. Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System. PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).
  33. Postlethwait, J. H., Handler, A. M. Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).
  34. Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes. J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).
  35. Boudko, D. Y., et al. Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti. Nat Commun. 6, 8546 (2015).
  36. Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon. Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).
  37. Jones, K. H., Senft, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).
  38. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).

Tags

الأمراض المعدية، المسألة 126، الجسم الدهون، وثقافة الجهاز، البعوض، بعوض الزاعجة المصرية، والتغذية، فيتيلوجينيسيس
الجسم الدهون نظام الثقافة الجهاز في <em>بعوض الزاعجة المصرية</em>، ناقل للفيروس Zika
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chung, H. N., Rodriguez, S. D.,… More

Chung, H. N., Rodriguez, S. D., Carpenter, V. K., Vulcan, J., Bailey, C. D., Nageswara-Rao, M., Li, Y., Attardo, G. M., Hansen, I. A. Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus. J. Vis. Exp. (126), e55508, doi:10.3791/55508 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter