Kroppen fett er det sentrale metabolsk orgelet i insekter. Vi presenterer et levende orgel kultur system som gjør det mulig å studere reaksjoner av isolerte fett kroppsvev på ulike stimuli.
Insekt fett kroppen spiller en sentral rolle i insekt metabolisme og næringsstoffer lagring, speiling funksjonene i lever og fettvev i virveldyr. Insekt fett kroppens vev er vanligvis distribuert gjennom insekt kroppen. Men er det ofte konsentrert i magen og festet til kroppen bukveggen.
Mygg fett kroppen er den eneste kilden til eggeplomme proteiner, som er kritiske for eggproduksjon. Derfor kultur i vitro mygg fett kroppsvev representerer en betydelig system for studier av mygg fysiologi, metabolisme, og til slutt, eggproduksjon. Fett kroppen kultur prosessen begynner med utarbeidelse av løsninger og reagenser, inkludert aminosyre lager løsninger, Aedes fysiologisk salt lager saltløsning (APS), kalsium lagerløsning og fett kroppen kultur medium. Prosessen fortsetter med fett kroppen disseksjon, etterfulgt av en eksperimentell behandling. Etter behandling, kan en rekke ulike analyser utføres, og inkludert RNA sekvensering (RNA-Seq), qPCR, Western blots, Proteomikk og metabolomics.
I vårt eksempel eksperiment viser vi protokollen gjennom excision og kultur av fett organer fra gulfeber mosquito, Aedes aegypti, en rektor vektor av arboviruses inkludert dengue, chikungunya og Zika. RNA fra fett kroppen kultivert under en fysiologisk tilstand som kalles upregulate eggeplomme proteiner versus kontrollen ble gjenstand RNA-Seq analyse å demonstrere den potensielle nytten av denne prosedyren for undersøkelser av genuttrykk.
Myggen er vektorer av ødeleggende menneskelige sykdommer, inkludert malaria, denguefeber, chikungunya og Zika1,2,3. Til tross for intens internasjonal innsats til å dempe disse sykdommene og styre sykdom-overføre mygg befolkninger, er epidemic utbrudd av mygg-sykdommer fortsatt vanlig, særlig i utviklingsland. Effektive vaksiner mot mange av disse sykdommene er utilgjengelig eller begrenset effekt4,5. Den mest effektive måten å hindre utbrudd er å kontrollere mygg befolkninger, hovedsakelig gjennom bruk av insektmiddel behandlinger. Insektmiddel motstand har imidlertid utviklet mange mygg bestander og bli et vanlig problem rundt i verden6,7,8. Studiet av mygg fysiologi er avgjørende for utviklingen av romanen verktøy og strategier for å kontrollere sykdommen.
Mygg fett kroppen spiller en sentral rolle i næringsstoffer lagring, metabolske homeostase, reproduksjon og xenobiotic oval katabolisme9,10,11,12. Det er det hovedlageret orgelet for triglyserider, glykogen og aminosyrer i form av lagring proteiner. Det fungerer også som plassering for syntese for de fleste hemolymph proteiner og metabolitter. I mygg er kroppen fett den eneste kilden til eggeplomme protein produksjon som oppstår i kvinner når de tar en blod måltid13,14.
Den viktigste celle typen fett kroppen er store, polyploid trophocyte eller adipocyte3,9,10,12. Fett kroppens vev er organisert i fliker eller hylser og kan finnes i alle kroppsdeler av mosquito, med den største delen ligger i magen, hvor store lobes av fett kroppen er festet til kroppen bukveggen.
Presenteres her mygg fett kroppen kultur-systemet ble utviklet i ‘ 70s og er et kraftig verktøy for å studere fett kroppen fysiologi10, spesielt i kombinasjon med gjeldende analyseteknologier. Grunnlaget for denne teknikken er basert på isolasjon av abdominal kroppen veggene og tilknyttede fett kroppsvev. Abdominal cuticle hydrofobe natur gjør at den flyter på overflaten av den kultur mediet, med tilknyttede lobes av abdominal fett kroppen nedsenket. Den voksne og tracheolar struktur er vedlikeholdt, sikre oksygenering av kultivert vev. Heretter, vil vi referere til disse forberedelsene som “fett organer.” Isolert fett kroppen være levedyktig på mer enn 12 h når ruges i passende medium (upubliserte resultater). Fett kroppen kultur er et verdifullt verktøy som har tatt en rekke spørsmål om fett kroppen endokrinologi og fysiologi9,10,12,15,16, 17.
Kulturperler fett organer kan utsettes for ulike eksperimentelle og kontroll behandlinger, tidspunktet som kan være avgjøres av utprøver. På slutten av inkubasjonstiden, kan fett organer være samlet inn og behandlet for nedstrøms analyser, blant annet qPCR16,17,18,19, Western blotting18 ,20, Proteomikk21eller metabolomics22. Eksperimenter kan utføres på forskjellige skalaer, fra personlige fett kroppene til grupper av hundrevis som kan kultivert sammen.
Representant resultatene med her var avledet fra fett organer kultivert i nærvær av aminosyrer og steroid hormon 20-hydroxy isoinokosterone simulere blod måltid aktivering av vitellogenesis16,17, 23,24. Vi analysert og forhold til differensial genuttrykk av ikke-aktivert versus aktivert fett kroppen via neste generasjons sekvensering analyse.
Insekt orgel kultur ble brukt mye å studere insekt endokrinologi, utvikling og metabolisme, så vel som å undersøke samhandlingen mellom bestemte organer og bakteriell symbionter29,30,31, 32,33,34. In vitro fett kroppen orgel kultur ble brukt spesielt til å studere aminosyre transport og regulering av eggeplomme protein produksjon i mygg og andre insekter16,17,35 , 36. under av vitellogenesis, mygg fett kroppen bruker en rekke høy spesifisitet aminosyre transportører importere blod måltid-avledet aminosyrer fra hemolymph å syntetisere store mengder eggeplomme proteiner12 ,19,35,36. Fett kroppen kultur var medvirkende til avgrensning av fett kroppen ernæringsmessige kravene i denne sammenheng18.
Kvaliteten på utgangsmaterialet, kvinnelige mygg, er avgjørende for suksessen til disse eksperimentene. Larvene oppvokst i under overfylt forhold og matet på høy-næringsstoffer dietter vanligvis gi de beste resultatene. Det er noen viktige variabler å vurdere når etablere mygg fett kroppen kultur forhold i laboratoriet i eksperimentell design. Vi viste tidligere studier som fett kroppen genuttrykk varierer betydelig avhengig av personlige livshistorie og ernæringsmessig status mygg11,22. Mygg kultur betingelsene skal uniform å redusere variasjon i størrelsen og ernæringsmessige reserver av eksperimentelle myggen. I tillegg bør skal utføre disseksjoner trenes å sikre rask og nøyaktig disseksjoner med konsistente resultater. Cellen levedyktighet i isolerte fett kroppen kan kontrolleres ved hjelp av ulike flekker metoder37,38.
Eksperimentell design av et fat kroppen kultur eksperiment bør ta i betraktning antall dissections i en gitt tidsperiode. Når store mengder fett organer, kan disseksjon økter eller flere dissectors være nødvendig. Det er et bredt spekter av framtidige applikasjoner for i vitro fett kroppen kultur i mygg og andre insekter. Det vil være spesielt nyttig for testing av potensielle narkotika kandidater for insekt kontroll. Bruk av transgene teknikker i insekter å uttrykke spesifikke reporter proteiner i fett kroppen trophocytes vil åpne opp nye metoder å utvikle kraftige bioassay for å studere fett kroppen fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av NIH grant #SC1AI109055, i 2014 NMSU HHMI grant #52008103 og NSF PGR gi #1238731. Vi takker deltakerne på NMSU våren 2015 BIOL302 molekylær metoder klassen og Lavesh Bhatia for deres teknisk støtte med fett kroppen cellekulturer eksperimenter.
Scissors | Fiskars | 83872 | |
Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
Battery-powered aspirator w/ collection vial | Hausherrs Machine Works, Inc. | 3740-01-210-2368 | |
Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500085 | |
Light microscope | Leica Microsystems | ||
96 well plate | Sigma | CL S3383 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Alanine | Sigma | A7627 | |
Arginine | Sigma | A5006 | |
Asparagine | Sigma | A0884 | |
Aspartic Acid | Sigma | A9256 | |
Cysteine | Sigma | W326305 | |
Glutamic Acid | Sigma | G1251 | |
Glutamine | Sigma | G3126 | |
Glycine | Sigma | G2879 | |
Histidine | Sigma | H6034 | |
Isoleucine | Sigma | I2752 | |
Lysine | Sigma | L5501 | |
Leucine | Sigma | L8000 | |
Phenylalanine | Sigma | P2126 | |
Proline | Sigma | P0380 | |
Serine | Sigma | S4500 | |
Threonine | Sigma | T8625 | |
Tryptophan | Sigma | T0254 | |
Tyrosine | Sigma | T3754 | |
Valine | Sigma | V0500 | |
Methionine | Sigma | M9625 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
MgCl2-6H2O | Sigma | M2670 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
CaCl2-2H2O | Sigma | C8106 | |
Tris pH8.0 | Sigma | T1503 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
ddH2O | Sigma | W4502 |