Protokoller for Gransker Host-vev distribusjon, overføring-modus, og innvirkning på vertsmaskinen Fitness av en Densovirus i Cotton Bollworm

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å undersøke vertsvevet distribusjon, overføring modus, og effekt på verts egnethet av en densovirus løpet av sommerfugl-arter, bomull bollworm. Denne protokollen kan også bli anvendt for å studere interaksjonen mellom andre oralt overfør virus og deres insekt verter.

Abstract

Mange nye virus har blitt oppdaget i dyre verter som bruker neste generasjons sekvensering teknologi. Tidligere rapporterte vi en mutualistic virus, pestfagerfly densovirus (HaDV2), i en sommerfugl-arter, bomull bollworm, pestfagerfly (Hubner). Her beskriver vi protokollene som er brukt for å studere effekten av HaDV2 på sin vert. Først etablerer vi en HaDV2 fritt bomull bollworm koloni fra en enkelt avl par. Da vi oral inokulering av noen nyfødte larver avkom med HaDV2 holdig filtrerte væske for å fremstille to kolonier med det samme genetiske bakgrunn: en HaDV2-infiserte, ikke-infiserte den andre. En protokoll for å sammenligne liv tabell parametere (f.eks larve, puppe, og voksen perioder og fecundity) mellom de HaDV2-infiserte individer og -uninfected blir også presentert, som er protokollene for å bestemme vertsvevet fordeling og overføring effektivitet av HaDV2. Disse protokollene would også være egnet for undersøkelse av virkningene av andre oralt overfør virus på sine insekt verter, sommerfugl-verter i særdeleshet.

Introduction

I de siste tiårene, har utviklingen av sekvenseringsteknologi slik som neste generasjons sekvensering (NGS) lettes oppdagelsen av mange nye DNA og RNA-virus, spesielt ikke-patogene virus, men også nye isolater av tidligere kjente virus ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12.} I modellorganisme Drosophila melanogaster, har mer enn 20 nye partielle virusgenomene blitt detektert ved bruk av teknikker metagenomic ^13. Mange virussekvenser, inkludert nye virus, har også blitt identifisert i andre insekter, så som honningbier, mosquitoes, asiatisk sitrus psyllids, øyenstikkere, og flere sommerfugl-arter ^{14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.}

I fremtiden kan det forventes at flere nye virus blir oppdaget i insekter som bruker disse avanserte teknologier; dermed kan vår forståelse av virus og vert interaksjon endres tilsvarende ^{6, 9.} For eksempel er virus-vert interaksjoner anses å være mer komplisert enn tidligere antatt, fordi mange nye virus blir definert som mutualistic partnere fremfor strenge patogener ^22. For eksempel, den mutualistic densovirus DplDNV i Dysaphis plantaginea induserer den bevingede morf og øker mobiliteten, som letter spredning av verten, så vel som viruset ^23. Dessuten har mutualistic virus blitt beskrevet med hensyn til pattedyr helse, tørke og kulde toleranse av planter, og virkningen av bakterielle infeksjoner ^24. Seneca dal virus-001 er vist å mediere selektiv cytotoksisitet mot tumorceller med nevroendokrine kreft funksjoner ^25. Hepatitt A virusinfeksjoner undertrykke hepatitt C-virusreplikasjon, og kan føre til utvinning av hepatitt ^C-26. Herpesvirus latens confers symbiotisk beskyttelse mot bakteriell infeksjon ^27. Konvolutten glykoprotein of human endogenous retrovirus Herv-W induserer cellulær resistens overfor milten nekrosevirus ^28. Curvularia termisk toleranse virus (CThTV) fra en sopp endophyte er involvert i den mutualistic interaksjonen mellom denne soppen og en tropisk panikk gressref "> 29. Derfor er kunnskap om samspillet mellom de nylig funnet virus og deres verter skal generere nye perspektiver på deres biologi og forvaltning. Men nye virus, spesielt de skjulte virus viser ingen åpenbare tegn typisk for akutt infeksjon, har sjelden vært etterforsket, og vi trenger en rørledning og protokoller for å undersøke konsekvensene av de nylig funnet virus på sine verter.

Tidligere har vi rapportert prevalens en ny monosense densovirus pestfagerfly densovirus (HaDV2) i bomull bollworm, pestfagerfly, og presenterte bevis for en mutualistic forholdet mellom HaDV2 og bomull bollworm ^{30, 31.} I denne artikkelen vil vi beskrive laboratoriet protokollen til å studere i detalj samspillet mellom HaDV2 og dens bomull bollworm vert. Protokollen som presenteres her kan også være svært relevant for forskere undersøker role andre oralt overfør virus, spesielt i sommerfugl-skadedyr.

Protocol

1. Bygging av HaDV2 frie Cotton Bollworm Colony Bakre bomulls bollworm med larver (H. armigera) på en kunstig diett 32 i et kontrollert vekst rom eller en kunstig klimakammer ved 25 ± 1 ° C, med 14 timers lys / 10 timers mørke og 60% relativ fuktighet. Hjelpe til enkeltparet parring av nylig eclosed møll ved hjelp av en plast bur pr par (10 cm høyde, diameter 5 cm) som er dekket med bomullsgas for å sikre god ventilasjon og for å tjene som et substrat egglegg…

Representative Results

Progenies fra foreldrene som ble HaDV2-fri (figur 3A) er blitt oppdrettet som NONINF-stammen. Vi lykkes forsterket aktingenet med de samme DNA-maler, noe som tyder på at DNA-maler var av god kvalitet (figur 3B). I tillegg er de tilfeldig utvalgte åtte progenies var også fri for HaDV2 (figur 3C), HaNPV (figur 3D), og Wolbachia (figur 3E). Igjen, konkluderte vi at DNA-prøvene av avkom…

Discussion

I de siste tiårene har de fleste studier på insekt-virus interaksjoner fokusert på honningbie helse ^{34, 35, 36,} vektorer av menneskelig sykdom ^37, virus plante ^38, og noen insekt patogene virus som har stort potensial som biologiske bekjempelsesmidler ^39. Lite oppmerksomhet har blitt betalt til hemmelige virus i insekter, spesielt i sommerfugl-skadedyr. …

Materials

24-well plate	Corning	07-200-740	Multiple suppliers available.
DNA extraction kit	TIANGEN	DP304-03	Multiple suppliers available.
thermal cycler	Veriti; Applied Biosystems	4375786
PBS	Corning	21-040-CV
0.22 µm membrane filter	Millipore	SLGS025NB
pEASY-T Cloning Vector	TransGen, Beijing, China	CT301-02
Tweezers	IDEAL-TEK	2.SA
Premix Ex Taq (Probe qPCR)	Takara	RR390A
Probes	Invitrogen	Custom order
Primers	Invitrogen	Custom order
microspectrophotometry NanoDrop 2000c	Thermo scientific	not available
7500 Real-Time PCR system	Applied Biosystems	not available
stereomicroscope SZX-16	Olympus	not available
sucrose			Multiple suppliers available.
vitamin complex			Multiple suppliers available.