Summary
在这里，我们提出了一个协议，调查宿主组织分布，传输模式和效果上的浓核病毒的宿主健身鳞翅目物种内，棉铃虫。该协议也可以用于研究其他经口传播的病毒和它们的昆虫宿主之间的相互作用。
Abstract
许多新的病毒已经在用新一代测序技术的动物宿主被发现。此前，我们报道了互惠病毒， 棉铃虫浓核病毒（HaDV2），在鳞翅目的物种，棉铃虫， 棉铃虫 （棉铃虫）。在这里，我们描述了目前用于研究HaDV2其主机上的效果的协议。首先，我们从单一的养殖对建立自由HaDV2，棉铃虫落。然后，我们口服接种用含有HaDV2-过滤的液体以产生两个菌落用该遗传背景一些新生儿幼虫后代：一个HaDV2感染，其他未感染的。一个协议到HaDV2感染和-uninfected个体还提出之间比较生命表参数（ 例如，幼虫，蛹和成虫期和繁殖力），作为用于确定HaDV2的宿主组织分布和传输效率的协议。这些协议をULD也适用于研究在其昆虫宿主，特别是鳞翅目的主机其他口头传播病毒的影响。
Introduction
在过去的几十年中，测序技术的发展，如下一代测序（NGS）提供了便利的许多新的DNA和RNA病毒，特别是非致病性病毒，而且先前已知的病毒1，2，3新颖菌株的发现， 4，5，6，7，8，9，10，11，12。在模式生物果蝇 ，已使用的宏基因组技术13检测超过20个新的部分病毒基因组。许多病毒序列，包括新颖的病毒，也已在其它昆虫，如蜜蜂，米识别osquitoes，亚洲柑橘木虱，蜻蜓，和多个鳞翅目种类14，15，16，17，18，19，20，21。
在未来，可以预计将有更多的新病毒会使用这些先进技术的昆虫被发现;因此，我们对病毒与宿主相互作用的理解可能会相应地改变6,9。例如，病毒与宿主相互作用被认为是比以前认为的更加复杂，因为许多新的病毒被定义为互惠的合作伙伴，而不是严格的病原体22。例如，在Dysaphis plantaginea的共生浓核病毒DplDNV诱导翅变形和增加流动性，有利于主机的扩散以及病毒23。此外，互惠病毒已与关于哺乳动物健康，干旱和植物的耐寒性，和细菌感染24的碰撞描述。塞内卡山谷病毒-001被证明介导选择性细胞毒性对肿瘤细胞具有神经内分泌癌特征25。 A型肝炎病毒感染抑制丙型肝炎病毒的复制，并可能导致丙型肝炎26恢复。疱疹病毒潜伏期赋予免受细菌感染27共生保护。人内源性逆转录病毒HERV-W的包膜糖蛋白诱导对脾坏死病毒28的细胞抗性。从内生真菌弯孢热耐受性病毒（CThTV）参与这种真菌和热带恐慌草之间的互惠互动REF“> 29。因此，新发现的病毒和其宿主之间的相互作用的知识应该产生自己的生物学和管理的新观点。然而，新的病毒，尤其是隐蔽病毒，显示典型的急性感染无明显体征，有很少被查处，我们需要一个管道和协议来调查他们的主人的新发现的病毒的影响。
此前，我们已经报道的棉铃虫， 棉铃虫的流行新monosense浓核病毒棉铃虫浓核病毒（HaDV2），并提出了HaDV2和棉铃虫30,31之间的互惠关系的证据。在本文中，我们将介绍实验室实验方案进行详细研究HaDV2和棉铃虫宿主之间的相互作用。这里介绍的协议也可能是研究人员对第r高度相关OLE的其他口服传播的病毒，特别是在鳞翅目害虫。
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Protocol
1. HaDV2无棉铃虫殖民地的建设
- 后棉铃虫幼虫（ 棉铃虫 ）上以受控的生长室或人工气候室中的人工饲料32在25±1℃，14小时光照/ 10小时黑暗和60％相对湿度。
- 通过使用覆盖有棉纱布每对塑料笼子（10厘米的高度，直径5cm），保证良好的通风，并作为一个产卵基板帮助新eclosed蛾的单对配合。为了提高获得无病毒菌落的可能性，利用至少30对单对交配。用10％的糖和2％维生素溶液32供给成年蛾浸泡上棉球和每日补充。
- 由于雌成虫产卵对棉花纱布约2天交配后，每天更换纱布。收集并维护在同一生长室中含有鸡蛋纱布（或人工气候湛BER）作为成蛾，直到卵孵化。
- 立即新孵化的幼虫转移到新的24孔板中，与一个单独的每孔。
- 第一产蛋日期之后的5天，收集家长飞蛾，并将它们存储在液氮中。
注：收集白蛾第一产蛋日期5天后确保父母在收集点活，因此避免了使用上的DNA提取精度死飞蛾的任何可能的影响。 - 隔离使用根据制造商的说明书的DNA提取试剂盒在这些样品的基因组DNA。
- 扩增肌动蛋白基因的引物与肌动蛋白F /肌动蛋白R A 574-bp片段（肌动蛋白F：5- CATCTACGAGGGTTACGC-3和肌动蛋白R：5- CATCTGTTGGAAGGTGGA-3）。可视化的聚合酶链反应（PCR），使用根据标准方案琼脂糖凝胶电泳产物;肌动蛋白基因的成功扩增确保DNA的质量是好的。
- 评估Ť他HaDV2的存在下，在使用PCR用特异性引物的父蛾：DVVPF（GGATTGGCCTGGGAAATGAC）和DVVPR（CGTTGTTTTTATATCCGAGG）31。
- 一旦一个干净的一对已被确定，从该单个HaDV2未感染的育种对至少五代后的后代，并保持此作为HaDV2 - 自由集落（NONINF应变）;所述HaDV2感染菌落被定义为INF-菌株。
- 为了确认在NONINF应变的HaDV2感染状态（并排除已知细菌或主机开发病毒的效果），评估在八个随机选择的个人幼虫为HaDV2， 沃尔巴克氏体和棉铃虫核型（HaNPV）的感染状况的使用PCR的NONINF -应变（用特异性引物：DVVPF / DVVPR为HaDV2，NPVF / NPVR为HaNPV，和81F / 691R为沃尔巴克氏体 31，33）。
注：据了解，一些病毒可能迟到NT在被感染的宿主，使用基于PCR的技术，甚至测不出时的水平。 NGS技术可以用来确认没有病毒序列存在于基因组DNA样品英寸
2.含有HaDV2-液态流体的制备
注：我们已经表明，HaDV2病毒颗粒的纯化试图阻止其感染性和活动31;因此，进行以下方案通过过滤HaDV2感染的个体，以实现感染HaDV2溶液。
- 单独收集成蛾，并立即将它们存储在液氮中。
- 完全研磨使用杀菌研钵和杵在液氮中所收集的个人蛾。传递约10μg碎片到一个干净的1.5毫升管中。传输剩余的碎片到新的试管，并立即将其存储在-80℃。
- 从碎片的10微克DNA提取，弗洛翼由制造商提供的方案。一旦蛾DNA已经被分离，检查HaDV2使用协议，如在步骤1.6中描述。
- 根据在步骤2.3中获得的结果，分割剩余的碎片分成两组：HaDV2阳性和HaDV2阴性，这取决于它们的感染状态。加入1毫升的磷酸盐缓冲盐水（PBS; 137mM的氯化钠，2.7mM的氯化钾，8毫的Na 2 HPO 4，和1.5mM的KH 2 PO 4; pH7.5）中，每个单独的完全溶解剩余的幼虫碎片。
- 离心匀浆物（来自步骤2.4）在6500×g的15分钟，4℃。过滤与0.22μm的膜过滤器的液体上清液。收集经过滤的液体（每管200μL），并立即将其存储在-80℃。
注：0.22μm的膜过滤器将过滤掉大部分不希望的颗粒，细菌和真菌的。第一预冷离心机至4℃。执行所有协议involvi纳克在冰上过滤后的液体的操作，以防止变成褐色和凝结匀浆。
3. HaDV2感染棉铃虫殖民地的建设
- HaDV2水平传播能力
- 生成HaDV2标准曲线。
- 扩增含有引物的片段（VPF：CTGGTGAGGCGATGGACATG; VPR：TGACAAGATCCAGCGTAGACATC）和探针（VP-探针：GCCACCACTAGAGGACCCACCAGATG），其用于HaDV2病毒的定量，与从头引物（PF：GGACAATGCTGGTGAGGC; PR：AATCCTCTTTGTCCGTTATCTATG）。使用下面的程序：30秒在94℃，在53℃30秒，和60秒72℃，40个循环PCR仪31上。添加包含HaDV2基因组的基因组DNA（步骤2.3）的1μL到作为模板DNA的25-μLPCR反应。根据制造商的方案克隆扩增片段到克隆载体。
- 计算的拷贝数质粒用以下公式：拷贝/μL=（N A×C）/（N×M×10 9），其中N A是阿伏伽德罗数（6.02×10 23分子/摩尔）; C是质粒（毫微克/微升），其可以使用显微分光光度进行测定的质量浓度; n为含有PCR产物（5195 bp）的重组质粒的长度; M是平均碱基对的双链DNA（660克/摩尔）的分子量。
- 制备6 10倍连续稀释在1.5毫升微量离心管中，用1.5×10 9个浓度，1.5×10 8 1.5×10 7，1.5×10 6，1.5×10 5，1.5×10 4拷贝数/ μL。
- 执行使用特异性引物（VPF / VPR）和探针（VP-探针），以产生循环THRE实时定量聚合酶链式反应（qPCR的）在步骤3.1.1.3中描述的质粒的shold（CT）的值。执行三个独立的技术重复，取它们的平均值为进一步计算。
- 使用上述的结果，产生标准曲线的log 2变换的HaDV2浓度现有平均CT值相关。
- 在过滤后的液体的流体量化HaDV2。
- 吸取含有HaDV2 DNA提取过滤的液体流体（步骤2.6）的100-μL测试样品。
- 使用实时-qPCR的获得的CT值的液体流体和使用在步骤3.1.1标准曲线计算拷贝数。
- 确定与不同浓度的HaDV2感染过滤液体的口腔感染效率。
- 含有HaDV2液态流体稀释至下列浓度：10 8，10 7，10 6，10 5，10 4，和0拷贝数/μL。
- 传播人工迪等均匀地凝固之前厘米直径9培养皿中。均匀地散布HaDV2含有过滤后的液体（200μL）用于固体人工饲料的表面上的各浓度。在通风橱中做到这一点。
- 在培养皿中转移100新鲜孵化的幼虫与含HaDV2人工食物。轻轻敲击棉纱布（包括新鲜孵化的幼虫），以幼虫从纱布转移到白纸片材。轻轻敲打纸，使幼虫吐丝和“气球”断纸。使用消毒镊子触摸丝绸和移动幼虫培养皿中。
- 48小时后，转移的人工饲料至24孔板（每孔一个个体）的幼虫。
- 在后方上述浓度到成年阶段与HaDV2接种幼虫。
- 收集成年蛾，提取DNA，并用PCR检测HaDV2，如在步骤1.5中描述。
注：在这里，得到助的100％HaDV2感染率使用10 8拷贝数/μL，从而建立HaDV2感染细胞集落（INF-株）tton棉铃虫。
- 生成HaDV2标准曲线。
- HaDV2的垂直传播能力
- 从NONINF和INF-菌株选择成年蛾，以产生单对♀-/♂-，♀+ /♂-，♀-/♂+和♀+ /♂+（+：阳性HaDV2感染; - ：阴性HaDV2感染）。
- 传送从上述对向无病毒的24孔板的后代;后幼虫到第三龄。
- 提取从所收集的第三龄幼虫的DNA作为模板使用，以确定HaDV2的存在，如步骤1.5中所述。
4. HaDV2的组织分布
- 为了防止病毒和细菌污染，消毒镊子和剪刀在75％的乙醇三次，然后在醇灯的火焰加热它们。
注：镊子sterilization是在必要时污染发生。 - 用分析天平，称量空管将被用于存储组织。
- 从放置在冰上的INF-应变幼虫和成虫蛾约5分钟。
- 解剖在幼虫，成年女性，和成年男性在含有PBS缓冲液中的干净的培养皿在立体显微镜下以下的组织。
- 对于幼虫，吸管血淋巴和解剖前肠，肠，肠，脂肪体，和马氏管（ 图1A）。立即在液氮中的每个组织转移到管中。
- 固定使用两个昆虫针（直径为200μm，20mm长），插入到所述头部附近的节间膜和最后腹部段（ 图1A）上的泡沫板冷冻幼虫。
- 使得幼虫血淋巴流出切幼虫的后腹部前脚。移液器使用microp 10秒内幼虫血淋巴ipette防止血淋巴的褐变和凝固。
注：苯基硫脲（50微克/毫升）可以1:20体积/体积比混合与血淋巴，以防止黑化。 - 用一把剪刀，做一个切口在角质层从最后间膜头部。解剖使用两个镊子在立体显微镜下所有剩余的组织;对于每个组织图像示于图1A中 。
- 从三米个人混合组织样本一起作为一个重复。
- 为了防止剥离过程中与血淋巴剩余组织的污染，洗净在PBS中解剖组织缓冲液三次。然后，测试用于洗涤的PBS的HaDV2感染状态。如果最终的洗涤缓冲液是HaDV2 - 自由，组织应该是从与血淋巴污染干净。
- 对于成年女性，剖析头部（大脑），肌肉，脂肪体，肠，马氏管和卵巢（图1B）在PBS缓冲液中在立体显微镜下。对于成年男性，在PBS缓冲液在立体显微镜下解剖头部（大脑），肌肉，脂肪体，肠，马氏管，和睾丸（ 图1C）。立即在液氮中的每个组织转移到管中。
- 使用镊子和剪刀，取出成蛾的翅膀和洗剩余身体三次以清除鳞屑。
- 用剪刀分离的头部，胸部和腹部。
- 取出胸部的内骨骼和收集的肌肉。
- 使用镊子，除去腹部的角质层和解剖图1B和1C之后的其他组织。
- 从三个人的混合组织样本一起作为一个重复。洗在PBS中解剖组织缓冲液三次。
- 对于幼虫，吸管血淋巴和解剖前肠，肠，肠，脂肪体，和马氏管（ 图1A）。立即在液氮中的每个组织转移到管中。
- 称量管和上述组织时，他们已被冻结，并确保米不同组织的驴几乎相等。
质谱（组织）=质量（管/组织样品） - 质谱（仅管） - 提取从这些组织的DNA并进行定量PCR，如在步骤3.1.2说明。
- 计算每使用在步骤3.1.1中产生的标准曲线的每个mg组织的拷贝数。使用病毒滴度每单位质量，以校正由在组织的用于DNA提取量的任何差异的样品偏差。
- 计算在特定组织HaDV2的百分比如下：HaDV2的百分比对于每个组织= HaDV2复制每测试组织/（的拷贝数占所有组织毫克总和）的毫克数。
5.生物测定测试HaDV2对主机发展的影响
- 地方至少100蛹或从NONINF应变在棉花纱布覆盖，5-L，金属丝网笼衍生新出现的成年蛾。 2天后，交配成年女性会开始对棉花纱布产卵。收集和维护含有蛋的棉纱布;鸡蛋将在三天孵化。
- 与HaDV2新生儿幼虫接种。
- 转移NONINF应变的新生幼虫，以含有HaDV2（10 8拷贝数/μL）以建立INF-应变的人工饲料。
- 类似地，新生幼虫转移到覆盖有HaDV2无过滤的液体（步骤2.4），以建立对照组（NONINF株）的人工饲料。包括在各处理（ 图2A）为至少240的幼虫。
注：幼虫被用于构造NONINF-和INF-菌株从在同一时间相同的父和队列舱口衍生，确保相同的遗传背景。确保NONINF-和INF-菌株都保存在相同的气候室（25±1℃，14小时光照/ 10小时黑暗和60％相对湿度）发展的同步速度;速率可以取决于温度和湿度而变化。处理德利奇轻轻地吃幼虫。
- 48小时后，单独传送幼虫24孔板（每孔一个个体）（ 图2B）。
- 顺序号在每孔各幼虫，并记录每天的龄期和生存状态。
- 约5天后，当人工饮食恶化，同时这些个体转移到含有新鲜人工饲料（ 图2C）一个新的24孔板中。
- 使用分析天平以0.0001克精密称取从第7天幼虫11孵化后。称重后，幼虫单独返回到24孔板。
- 一旦第四蜕皮后蜕皮至第五龄（孵化后十天左右），转移幼虫玻璃管（10厘米高，2cm直径）（ 图2D）;第五龄幼虫也可通过头胶囊（约2.6mm）的宽度确定的。
注意事项：传送个人至在同一时间的每一天的玻璃管中。- 码每个幼虫与上使用涂料或标记玻璃管其原始参考号。每日记录幼虫状态;在玻璃试管，之后五天左右-蛹阶段持续大约11天幼虫化蛹会。
- 记录用于在玻璃管每个单独的蛹羽化和日期。记录3日龄蛹的质量。
- 羽化后，把一只雌一张雄与10％蔗糖和2％的维生素溶液（ 图2E）的单一笼。每天补充蔗糖溶液。记录死亡的每个蛾的日期。
- 当产卵，每天更换纱布。立即计算蛋的数量。算上刚孵出的后代，而他们孵化。
- 在生物测定，随机选择八个人每个处理确认HaDV2的感染状况。提取使用市售胰蛋白酶试剂这些样品的总RNA按照制造商的协议。合成第一链cDNA按照制造商的协议，并以此为模板，以测试是否病毒成功转录。
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Representative Results
从分别HaDV2 -自由（ 图3A）的父母后代饲养作为NONINF应变。我们使用相同的DNA模板，这表明DNA模板质量良好（ 图3B）成功地扩增肌动蛋白基因。此外，随机选择的8个后代也是免费HaDV2（ 图3C），HaNPV（ 图3D），并沃尔巴克氏体 （ 图3E）的。再一次，我们的结论是，后代的DNA样品的质量好，因为肌动蛋白基因的部分成功地扩增对于所有测试的样品（ 图3F）。
限定所述日志起始材料的质量和获得CT值之间的关系的标准曲线产生，如在图4中 。一个强大的线性相关性（R
刚孵化的幼虫用10 4和10拷贝数/μL之间8 10倍系列稀释液HaDV2流体的点标准曲线接种。我们获得的感染频率和HaDV2液体流体的浓度之间的线性相关性; 10 8拷贝数/μL，得到100％的感染对棉铃虫，但其他浓度没有（还参见Xu 等人31）。从父母具有不同HaDV2感染状态后代的感染HaDV2频率分别如下：100％♀+ /♂-，78％为♀-/♂+，以及100％♀+ / +♂（也参见许等人31）。
到correct在HaDV2滴度的个体差异，我们计算每每个组织的毫克HaDV2拷贝数和总HaDV2滴度的针对特定组织的百分比。结果表明，HaDV2主要分布在脂肪体（ 图5;也参见Xu 等人31）。生命表参数，包括幼虫期，蛹期，成人长度，和繁殖力的比较，在表1中示出（也参见Xu 等人31）。幼虫和蛹的群众分别为徐等人发表。 31。在NONINF应变和INF-应变两者HaDV2感染状态，通过PCR（由Xu 等人 。31日公布的结果）确定。
图1.解剖组织为（A）幼虫，（B）一成年女性，和（C）成年男性。 H，头部（大脑）;他，血淋巴; FB，脂肪体;山，马氏管; G，肠; FG，前肠; MG，肠; HG，后肠;穆肌肉; O，卵巢; T，睾丸。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.生物检测过程来确定HaDV2的对棉铃虫。与HaDV2的刚孵化的幼虫的（A）接种。 （B）的HaDV2感染和HaDV2 -自由个体48小时后，将转移到24孔板中。 （C）不同尺寸HaDV2感染者和个人不含的。第五龄幼虫的（D）传输到新的玻璃管（10厘米的高度，直径2厘米）。 （E）一个的放置雌一个雄蛾进入同一个笼子里，以确定成虫寿命，产蛋量和孵化率。 请点击此处查看该图的放大版本。
在HaDV2感染和HaDV2无菌落HaDV2，HaNPV，或沃尔巴克氏图3.感染状况。在女性和男性的父母HaDV2感染状态（A）。在随机选择的后代HaDV2（C），HaNPV（D），和沃尔巴克氏体 （E）的感染状态。要检查基因组DNA的质量，管家基因肌动蛋白也被放大为父母（B）和后代（F）。泳道M显示了DL2000标记（2000碱基对，1000 bp的750bp的，500个碱基，250个碱基，一个D 100碱基对）。第1道：母本。泳道2：父本。巷3 - 10：后代。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.标准曲线相关日志2转化HaDV2浓度循环阈值（CT）的值。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.在幼虫（A）HaDV2的主机组织分布，成年女性（B），和成年男性（C）棉铃虫。百分比（％）= HaDV2在不同组织的比率（每毫克），如所描述的我n阶4.7数据使用方差分析（ANOVA）和Tukey检验的分析统计学分析（幼虫：N = 7;成年男性：N = 6;成年女性：N = 6）。平均值±标准差。结果被徐等人发表。 31。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 生活史参数 | HaDV2 + | HaDV2- | 吨价 | DF | P值为 | |
| 幼虫期（天） | 男 | 16.51（±0.72） | 16.93（±1.21） | 4.147 | 379 | <0.001 |
| 女 | 16.51（±0.79） | 16.80（±1.05） | 2.732 | 312 0.0067 | ||
| 蛹期（天） | 男 | 13.02（±0.68） | 13.31（±0.69） | 4.057 | 379 | <0.001 |
| 女 | 11.62（±0.67） | 12.00（±0.63） | 5.1 | 312 | <0.001 | |
| 成人的长寿（天） | 男 | 10.69（±1.98） | 10.93（±2.46） | 0.915 | 367 | 0.36 |
| 女 | 9.07（±1.98） | 8.51（±1.58） | 2.992 | 367 | 0.003 | |
| 每雌产的蛋的数目 | 482（±174） | 403（±180） | 2.172 | 93 | 0.032 | |
| 每雌阴影数 | 207（±108） | 143（±99） | 3.026 | 93 | 0.0032 | |
表1.生活史参数HaDV2 +和HaDV2，棉铃虫。 学生t检验来确定显着性水平。平均值±SE被示出。本表数据由徐等人发表。 31。
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Discussion
在过去的几十年中，以昆虫病毒相互作用的大多数研究都集中在蜜蜂健康34，35，36，人类疾病37的载体，植物病毒38，和一些昆虫致病病毒有很大的潜力作为生物控制剂39。很少有人注意支付给隐蔽病毒的昆虫，特别是鳞翅目害虫。在这里，我们提出了一个协议的隐蔽病毒与宿主昆虫之间的相互作用的研究。病毒感染者和无病毒的宿主的个体生命表参数的比较，最好应该排除在宿主遗传背景的差异产生任何影响。为了研究病毒的表型，许多以前的研究相比，在相同的群体或个人接种或者自然感染或者未感染的个体的生命表参数通过显微注射，但这种努力是耗时23，40。棉铃虫与HaDV2，这里所描述的口服接种，作为一种简单而有效的手段来分析病毒的表型。此过程还确保了HaDV2感染和HaDV2未感染的菌落相同的遗传背景。
病毒接种可以在许多方面进行制备。使用高速离心病毒颗粒的纯化抑制病毒感染性，导致低的感染性;因此，含病毒的过滤的液体被用于感染棉铃虫幼虫31。该0.22μm的膜可以由HaDV2含有过滤后的液体和该HaDV2无过滤的液体被用作控制可能会排除其他病毒对我们的结果的影响过滤掉大部分真菌和细菌的粒子的事实。然而，我们不能排除一种可能性，即生物测定结果可能一LSO通过未被发现的病毒有偏差。因此，具有高感染性HaDV2颗粒理想地应在未来纯化，以获得稳定的结果。
病毒浓度与病毒感染性正相关;因此，我们有兴趣确定HaDV2浓度，将产生100％的感染。我们的研究结果表明，10 8拷贝数/μL可以用于病毒接种，以获得该感染率。毫无疑问，病毒滴度和感染发生率之间的相关性应该研究为今后研究了其它病毒与宿主相互作用。此外，每一个人在该领域的病毒滴度也应加以探讨。因此，我们可以再模拟病毒对个人在该领域的影响。
细腻的幼虫在孵化后的最初几天的柔和处理是非常重要的，因为它们很容易造成致命损伤。此外，HaDV2未感染山坳ONY应分别在温室保持，以防止污染HaDV2-的HaDV2的感染率已经发现是非常高的，无论是在野外和实验室31。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由中国国家重点基础研究发展计划（编号2013CB127602）和中国国家自然科学基金（31321004号）的创新研究群体科学基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | Multiple suppliers available. |
| DNA extraction kit | TIANGEN | DP304-03 | Multiple suppliers available. |
| thermal cycler | Veriti; Applied Biosystems | 4375786 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGS025NB | |
| pEASY-T Cloning Vector | TransGen, Beijing, China | CT301-02 | |
| Tweezers | IDEAL-TEK | 2.SA | |
| Premix Ex Taq (Probe qPCR) | Takara | RR390A | |
| Probes | Invitrogen | Custom order | |
| Primers | Invitrogen | Custom order | |
| microspectrophotometry NanoDrop 2000c | Thermo scientific | not available | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| stereomicroscope SZX-16 | Olympus | not available | |
| sucrose | Multiple suppliers available. | ||
| vitamin complex | Multiple suppliers available. |
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