Summary
Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.
Abstract
L'ADN réponse aux dommages (DDR) a été largement caractérisé en études de cassures double brin (CDB) induit par micro irradiation par faisceau laser dans les cellules vivantes. Le DDR à l'hélice de distorsion modifications de l'ADN covalentes, y compris des reticulations entre brins d'ADN (ICL), ne sont pas aussi bien définie. Nous avons étudié la DDR stimulée par ICL, localisée par photoactivation laser de psoralènes immunotagged, dans les noyaux des cellules vivantes. Afin de répondre à des questions fondamentales sur la distribution de produits d'addition et de rencontres de la fourche de réplication, nous avons combiné la localisation laser avec deux autres technologies. des fibres d'ADN sont souvent utilisés pour afficher la progression des fourches de réplication par immunofluorescence d'analogues nucléosidiques incorporés pendant de courtes impulsions. points Immunoquantum ont été largement utilisés pour l'imagerie seule molécule. Dans la nouvelle approche, les fibres d'ADN de cellules portant ICL localisée au laser sont étalées sur des lames de microscope. Les ICL marqués sont affichés avec des points de immunoquantum et ee distances inter-lésion déterminée. les collisions de la fourche de réplication avec ICL peuvent visualiser et différents modèles de rencontre identifiés et quantifiés.
Introduction
ADN est sous attaque constante des agents exogènes tels que le rayonnement, la lumière ultraviolette, les toxines environnementales, les produits de combustion, etc. De plus, il est également attaqué par des espèces radicalaires endogènes produits par le métabolisme oxydatif. Tous ces éléments ont le potentiel de perturber chimiquement ou physiquement l'intégrité de l' ADN 1. Perturbations dans le génome peut activer l'ADN réponse Damage (DDR), un recrutement et cascade post traductionnelles avec des centaines, voire des milliers, de protéines et microARN impliqués dans la réparation des lésions, la régulation du cycle cellulaire, l'apoptose, la sénescence et les voies inflammatoires 2.
La plupart de nos informations sur le DDR proviennent d'études avec DSB. Cela est en grande partie en raison de la disponibilité des technologies pour l' introduction de pauses, y compris les pauses spécifiques de séquence, dans l' ADN génomique dans les cellules vivantes 3. De plus, le propensity des pauses pour induire des foyers de protéines DDR, qui peuvent être affichés par immunofluorescence, a été très utile pour identifier la cinétique et les exigences des protéines répondant. L' une des technologies clés pour l' étude de la DDR a été présenté par Bonner et ses collègues, qui ont utilisé un faisceau laser pour diriger une bande de DSB dans une « région d'intérêt » (ROI) dans les noyaux des cellules vivantes 4. En effet, ils ont créé un foyer long dans lequel les protéines de la DDR pourraient être identifiés par immunofluorescence. Cela a été illustré par la démonstration de la bande forte de l'histone H2AX phosphorylée (γ-H2AX) dans les cellules exposées au laser. Depuis lors, l'approche laser a été utilisé dans de nombreuses études de la DDR induites par DSB. Bien que puissant et populaire, et la source d'images dramatiques immunofluorescence, il convient de noter que, dans la plupart des expériences l'intensité du laser est ajustée de manière à produire des résultats observables, sans se soucier de l'identité de la lésion,la densité, ou l'espacement. En effet, il peut être difficile de faire ces estimations. Ainsi , ils sont largement ignorés, malgré la multiplicité des lésions introduites dans l' ADN par des lasers 5. Cela contribue aux nombreuses contradictions dans la littérature 6.
Contrairement aux DSB, la plupart des modifications chimiques de l'ADN ne stimulent pas la formation de foyers discrets de protéines DDR. Ceci est important à la lumière de notre compréhension actuelle des fréquences de lésion. Il a été estimé que les cellules humaines en culture subissent moins de 50 DSB par cycle cellulaire, en grande partie formés au cours de la phase S 7, 8, 9. Moins sont formées dans des cellules non proliférantes. Cela contraste avec le nombre de pertes de nucléobases ou des événements de modification, qui sont des dizaines de milliers par cellule / jour 1, 10. Nous savons donc le plusle DDR induite par des événements qui sont relativement rares, et beaucoup moins sur celles qui sont induites par des lésions des effets de distorsion de l'hélice, ce qui, au total, sont beaucoup plus fréquents.
Afin de répondre à des questions sur la réponse cellulaire à covalentes modifications de l'ADN génomique, nous voulions travailler avec un produit d'addition d'ADN de distorsion d'hélice qui avait inhérente l'activité d'induction de DDR. De plus, pour faciliter la conception expérimentale et l'interprétation que nous étions intéressés par une structure dont l'introduction pourrait être contrôlée par rapport au temps et était prête à la visualisation. Par conséquent, nous avons développé une stratégie basée sur psoralène. Les psoralènes sont bien caractérisés intercalants d'ADN favorisant photoactifs 5' TA: AT sites. Contrairement à d'autres agents de reticulation tels que les moutardes d'azote et de la mitomycine C (MMC), ils ne sont pas l'ADN réactif à moins exposé aux UV onde longue (UVA). Les molécules intercalées réagissent avec les bases thymine sur des brins opposés pour produire des reticulations entre brins de distorsion d'hélice (CIST) 11. Avec le psoralène triméthyl utilisé dans nos expériences la plupart des produits sont ICL, relativement peu monoadducts sont générés (moins de 10%) 12 et des réticulations entre les bases intrabrin adjacentes sur un brin ne sont pas formés. Parce qu'ils sont des blocs puissants à la réplication et la transcription, psoralène et d'autres agents de réticulation, comme le cis-platine et MMC, sont couramment utilisés en chimiothérapie. Ainsi psoralène permis d'études qui ont suivi l'activation du DDR par une structure de distorsion de l'hélice, et a également fourni un aperçu de la réponse cellulaire à un composé ayant une importance clinique.
Nous avons synthétisé un réactif dans lequel psoralène triméthyl était lié à la digoxigénine (Dig), un stérol végétal ne se trouve pas dans les cellules de mammifères et souvent utilisé comme immunotag. L'exigence de photoactivation permet la localisation par la lumière laser (365 nm) de psoralène CIST en ROI défini dans les noyaux dans des cellules vivantes. Ceux-ci peuvent être affichés par immunofluorescence contre l'étiquette Dig. Réparation de l' ADN et des protéines DDR est apparu dans les bandes de laser localisés ICL 13, 14.
Le DDR activé par les fortes intensités de laser utilisées pour produire des DSB peut être dû à des dommages isolés ou regroupés 15, 16. Par conséquent, la pertinence des résultats de ces expériences à des lésions d'origine naturelle, présente une concentration beaucoup plus basse, est incertain. Pour répondre à des questions similaires sur la fréquence des produits d'addition psoralène et l' espacement dans l' ADN, nous avons profité de la technologie de fibre d'ADN 17 et des points de immunoquantum. Les points quantiques sont beaucoup plus lumineux que les colorants fluorescents et ne sont pas blanchies par exposition à la lumière. Ainsi , ils sont fréquemment utilisés pour l' imagerie de la molécule unique 18, une application pour laquelle les colorants fluorescents sont pas suffisamment brillante. fibres d'ADN individuelles peuvent être étirées sur gdiapositives lass et peuvent être affichées par immunofluorescence contre analogues nucléosidiques incorporés au cours incubations avant la récolte des cellules. Nous avons traité les cellules avec Dig-psoralène et le retour sur investissement exposés à une irradiation par micro laser. Les fibres ont été préparées à partir des cellules et des produits d'addition individuels Dig-psoralène peut être visualisée avec les points de immunoquantum. Exposer les cellules à des analogues nucléosidiques pendant des durées relativement courtes (20-60 min) permet l'affichage des voies de réplication dans le voisinage de la CIST localisée au laser.
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Protocol
1. Préparation de Dig-TMP
- Mélanger 50 mg (0,18 mmoles) de 4'-chlorométhyl-4,5' , 8-triméthylpsoralène et 590 mg (2,7 mmoles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amine dans 25 ml rond sec flacon -bottom sous azote. Ajouter 10 ml de toluène et reflux pendant 12 h. Retirer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite.
- Purifier le résidu par Chromatographie sur colonne éclair sur gel de silice. Eluer la colonne avec du chloroforme, de methanol, et 28% de solution d'ammoniac (9: 1: 0,5). Evaporer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite, et récupérer le pur 4 « - [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminométhyl-4,5 », 8-triméthylpsoralène comme visqueuse jaune pâle liquide.
- Mélanger 5,5 mg (0,012 mmoles) de 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminométhyl-4,5', 8-triméthylpsoralène avec 5 mg (0,008 mmoles) d'ester NHS dans la digoxigénine un ballon à fond rond sec sous azote. Ajouter 0,5 mL anhydre de diméthylformamide (DMF) und 3,4 ul de triméthylamine et on agite à 50 ° C pendant 18 h.
- Retirer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite.
- Dissoudre le résidu dans une quantité minimale de dichlorométhane. Appliquer la solution dans les points 2 pl horizontalement à travers le fond d'une plaque preparative sur couche mince de gel de silice comme phase stationnaire. Exécuter le CCM preparative dans du chloroforme: methanol: 28% d'hydroxyde d'ammonium (8: 1: 0,1).
- Masque la plaque à l'exception des bords verticaux et d'identifier la bande de produit avec une lampe UV à courte longueur d'onde de 254 nm. Racler le produit à partir de la plaque avec une spatule et d'isoler le produit pur en utilisant du chloroforme: methanol mélange: 28% d'hydroxyde d'ammonium (0,1 8: 1).
- Éliminer les solvants dans un évaporateur rotatif sous pression réduite. Dissoudre les pastilles résiduelles dans 1 ml de 50% d' EtOH: H 2 O, distribuer dans des aliquotes de 50 ul dans des tubes de 1,5 ml (~ 20 aliquotes) et sèche dans un évaporateur centrifuge jusqu'à ce que tout le solvant est évaporé (~ 3 h).
- Redissoudre chaque aliquote dans 200 ul de 50% d' EtOH: H 2 O et sèche à nouveau dans un évaporateur centrifuge. Dissoudre de nouveau chaque aliquote dans 200 ul de 50% d' EtOH: H 2 O, sèche dans un évaporateur centrifuge et pellets conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme.
- Pour l' utilisation, on dissout le culot dans 50 ul de 50% d' EtOH: H 2 O. Préparer une dilution 1: 100 du Dig-TMP dissous dans H 2 O et de mesurer la DO à 250 nm. Le coefficient d'extinction de Dig-TMP est 25 000. La solution est stable pendant environ un mois si elles sont conservées à -20 ° C. Vérifier la concentration en mesurant la DO à 250 nm avant chaque utilisation.
- Calculer la concentration en stock: Abs x 100 x 10 6/25 000 = concentration (en uM). En général, la solution mère est d'environ 3 mM. Il est important d'être dans cette gamme afin de réduire le volume de EtOH ajouté au milieu.
2. Laser Localisés Dig-TMP ICL
- Pelocalisation laser rform avec un microscope confocal avec un laser à azote SRS (337 nm) pompé à travers une cellule à colorant émettant une ligne de 365 nm et de tir 3 impulsions ns à 10 Hz, avec une puissance de 0,7 nW.
- Faire une marque verticale sur le côté d'une boîte de culture cellulaire à fond de verre de 35 mm avec un marqueur. Gratter une croix au centre de la vitre sur la surface de culture avec un stylo de diamant de telle sorte que la bande noire sur le côté de la cuvette se trouve en haut d'un bras de la croix. La croix est marquée sur la surface de croissance du verre pour que les cellules et sera dans le même plan focal.
- Stériliser la plaque après marquage avec un rinçage de 70% d'EtOH. Sec avant étalement des cellules.
- Cellules de la plaque (souches de laboratoire standard telles que HeLa ou U2OS) dans des boîtes de culture croix marqué un ou deux jours avant. Cellule doit être en division active et 50-70% confluentes le jour de l'expérience. Incuber 24 h avec 1 uM de 5-chloro-2-désoxyuridine (CldU) à l'ADN de manière uniforme sur les étiquettes.
- AjouterDig-TMP dans 50% EtOH: H 2 O dans un milieu de culture cellulaire à une concentration finale de 20 uM. Porter le milieu à 37 ° C. Changer le milieu sur les cellules et les placer dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 30 minutes pour permettre au Dig-TMP à équilibrer.
- Bien que les cellules sont en incubation, déterminer les coordonnées x / y du champ de vision dans lequel le laser est actif. Suivre la procédure de calibrage, dans lequel le laser est dirigé par le logiciel pour graver une lame de verre en miroir le long d'une ligne horizontale et diagonale du fabricant. Les deux lignes définissent les limites du champ dans lequel le laser peut frapper une cible.
- Placer la plaque dans l'enceinte climatique, à 37 ° C avec du CO2 et de l' humidité contrôlée, sur la platine du microscope et de se concentrer à l'objectif de l' huile 60X sur l'intersection de la croix.
- Diriger le faisceau laser de 365 nm pour un retour sur investissement, établie par l'investigateur à l'outil de forme dans le logiciel, pour former une bande de 3 &# 181; mx 0,6 um. Le contour de la ROI est placé par le curseur dans les noyaux des cellules situées dans le voisinage immédiat de l'intersection de la croix. Ajuster le plan focal z pour cibler le milieu laser à travers le noyau. Utiliser un laser dans la plage de 350-370 nm. 405 nm lasers ne peuvent pas induire des réticulations 19.
NOTE: Nous localiser le retour sur investissement dans des zones en dehors de la nucléoplasmiques nucléoles, qui peut être distingué du nucléoplasme en contraste interférentiel différentiel (DIC) imagerie. - Vérifier la mise au point et l' activité du laser en augmentant le réglage de puissance à un niveau suffisant pour effacer une cellule (la cellule assombrir puis disparaître). Ceci est un diagnostic important pour un trajet de lumière sans obstacle pour le laser à travers le microscope, puis à travers la lamelle et dans les cellules.
- Baisser le réglage de puissance juste suffisante pour activer le psoralène et l'ICL induite DDR (doit être déterminée de manière empirique pour chaque laser / microroscope combinaison). Utiliser un paramètre de l'intensité du laser (1,7% ici), qui ne déclenche pas la DDR en l'absence de psoralène (suivi par la formation de γ-H2AX).
NOTE: Ceci est une détermination importante et les paramètres peuvent nécessiter un ajustement si la source laser ou un composant dans le trajet de la lumière est modifiée. Suivez l'accumulation de GFP protéines marquées de réparation telles que XPC ou FAN1, qui sont tous deux recrutés rapidement (en quelques secondes) aux bandes de psoralène laser, mais pas à un retour sur investissement exposé au laser seul. Certaines protéines du DDR apparaissent en quelques secondes, alors que plusieurs minutes peuvent être nécessaires pour d'autres. Il est nécessaire d'effectuer des déterminations de cours de temps pour chaque protéine d'intérêt. Nous notons également que dans les cellules qui ne sont pas exposés au laser, il n'y a pas de bandes de protéines répondant.
- Baisser le réglage de puissance juste suffisante pour activer le psoralène et l'ICL induite DDR (doit être déterminée de manière empirique pour chaque laser / microroscope combinaison). Utiliser un paramètre de l'intensité du laser (1,7% ici), qui ne déclenche pas la DDR en l'absence de psoralène (suivi par la formation de γ-H2AX).
- Après toutes les cellules dans un champ ont été déplacement ciblé la plaque à un nouveau champ, en restant près de l'intersection de la croix.
- Dans des expériences conçues pour détermine la distribution des distances inter-lésion exposer les cellules au laser à 20-25 champs (4-5 cellules / champ) autour de l'intersection. Afin d'analyser les modèles de réplication dans le voisinage de la CIST localisées incuber les cellules avec 10 pM de 5-iodo-2-désoxyuridine (IDU) après la cuisson au laser.
NOTE: Le temps d'incubation avec IdU est quelque peu arbitraire. Nous avons utilisé aussi court que 20 minutes et aussi longtemps que 60 minutes (voir ci-dessous). des impulsions plus longues (quelques heures) entraînent souvent dans plusieurs secteurs de réplication coalescents, perdant ainsi l'occasion à l'image des progrès des fourches simples. Dans certains bureaux expériences sont marquées avec CldU pendant 24 h à l'ADN de manière uniforme d'étiquette avant l'exposition au Dig-TMP suivie par marquage d'impulsion des voies de réplication.
3. Récolte de cellules et d'étirement des fibres ADN
- Retirer la plaque de l'étape, éliminer le milieu et laver avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirer la solution PBS. Déposer une goutte de 10 ul d'une trypsine commerciale/ Solution d'EDTA sur l'intersection de la croix au milieu de la surface du verre.
- Incuber pendant 3-4 min à température ambiante (RT), puis tirer la solution de trypsine avec les cellules détachées dans l'embout de pipette. Il n'y a pas besoin de neutraliser la trypsine.
- Placer la goutte de trypsine / EDTA avec les cellules à une extrémité d'une lame de microscope en verre silanisée. Lyser les cellules et libérer l'ADN par addition de 10 pi de solution de SDS à 0,5% et incuber pendant 3-4 min à température ambiante en mélangeant doucement avec le bout de la pipette, permettant à la périphérie de la piscine à sécher.
- Inclinaison vers le coulisseau 20 ° et laisser le liquide couler le long de la fin. Les fibres d'ADN sont étendues / étirée par les forces hydrodynamiques du liquide en écoulement. Laisser sécher à l'air les diapositives (~ 10 min) et le fixer à 3: 1 méthanol / acide acétique pendant 10 minutes. Retirez les diapositives de la solution de solution et de l'air sec à nouveau. A ce stade, ils peuvent être stockés indéfiniment dans 70% EtOH à -20 ° C. Le retrait de 70% EtOH laisser sécher avant la neétape xt.
- Laver les lames dans du PBS, et ensuite subir une dénaturation dans du HCl 2,5 M pendant 1 h à TA. Ce traitement depurinates ADN qui rend les nucléobases halogénés incorporés accessible à des anticorps.
- Neutraliser diapositives 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Laver deux fois dans du PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) pendant 5 minutes chacun.
- Bloc coulissant avec 5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 10% de sérum de chèvre dans du PBS. Couvrir les lames doucement avec un parafilm pour répandre la solution de blocage uniformément sur la lame et incuber pendant 1 h à TA.
- Pipeter 100 ul de dilution 1: 200 dans une solution de blocage de rat anti-bromodésoxyuridine (détecte spécifiquement CldU) anticorps primaire à chaque diapositive. Couvrir les lames doucement avec un parafilm pour répandre la dilution de façon uniforme sur la lame et incuber dans une chambre humide pendant 1 h à TA. Retirez le parafilm et laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun.
- Pipeter 100 ul de dilution (1: 100) de chèvre anti-rat Alexa Fluor 647 dans le blocage de solution à chaque diapositive. Couvrir leglisse doucement avec un parafilm et incuber pendant 45 min à température ambiante. Laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun.
- Pipeter 100 ul de dilution (1:40) de souris anti-bromodésoxyuridine (LDU détecte et CldU Cette spécificité double nécessite le blocage de CldU par le rat anti BrdU dans l'incubation préalable.) Anticorps primaire et un anticorps de lapin anti-DIG (1: 200 ) dans une solution de blocage à chaque diapositive. Couvrir les lames doucement avec un parafilm et incuber dans une chambre humide pendant 1 h à TA. Laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun.
- Pipeter 100 ul de dilution (1: 100) de chèvre anti-souris Alexa Fluor 488 ANDC (1: 5000) de chèvre anti-lapin de sonde (par exemple, Qdot 655) dans une solution de blocage à chaque diapositive. Couvrir les diapositives doucement avec parafilm et incuber pendant 45 min à température ambiante. Laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun.
- Drainer l'excès de PBST sur une serviette en papier. Ajouter 50 ul de milieu de montage antifade sur chaque lame et couvrir avec une lamelle. Image ou magasin pourpas plus de 48 h à -20 ° C.
4. Imagerie fibre par microscopie à fluorescence
- Effectuer l'acquisition d'image à travers un objectif 63X sur un microscope inversé avec une roue de filtre entièrement motorisé fixé avec FITC, Cy5 et Q détection de point 655. Le filtre d'excitation est de 425 nm, et le filtre d'émission est de 655 nm avec 20 nm centrée sur le pic d'émission 20.
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Representative Results
Laser Dig-TMP (figure 1A) localisées ICL peuvent être affichées par immunofluorescence contre le Dig-étiquette liée à la psoralène. Bien que le laser peut être dirigé pour frapper dans une zone de contour quelconque, rayures ne sont pas des formes « naturels » dans les cellules, et les signaux légitimes peuvent être facilement distingués des artefacts dus à une liaison non spécifique par des anticorps primaires ou secondaires. Cette fonction est utile lors de l'utilisation des anticorps de moins de spécificité parfaite. Un exemple de marqueur bien connu du DDR, γ-H2AX, dans une bande de Dig-TMP ICL est représenté sur la figure 1B.
L'immunofluorescence du Dig lésions marqué dans les bandes laser ne permet pas de tirer des conclusions quant à la fréquence et l'espacement des produits d'addition. Afin de rendre ces cellules ont été incubées avec détermination CldU pendant 24 h avant l'introduction des ICL. La coloration contre ee CldU permet la visualisation du Dig marqué des lésions sur les fibres longues et les rendements plus clairs motifs de fibres de taches directs tels que le DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) ou YOYO {1,1' - (4,4,8 , le bis [4 - [(3-méthylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) méthylidène] -l, 4-dihydroquinolinium] 8-tétraméthyl-4,8-diazaundecamethylene) tétraiodure}. Après l'introduction de ICL par photoactivation laser, les fibres ont été réparties à partir des cellules ciblées. L'analyse des signaux de fouille sur les fibres telles que celles représentées sur la figure 2 a révélé que les distances inter ICL variaient de moins de 10 kb à 160 kb supérieur, comme décrit dans notre publication récente 21. Il n'y avait pas de preuve pour les adduits en cluster. Ainsi, la bande de l'étiquette Dig, et l'accumulation des protéines de DDR dans la bande, reflète la présence de lésions bien séparées, au moins, telle que mesurée le long de l'ADN étendu. Considéré en termes de chromatine cellulaire si les ICL formés dans des tableaux nucléosomales, avec 6plier la compression de la longueur de l'ADN étendu, elles seraient encore séparées par l'équivalent d'environ 1,6 kb d'ADN.
Des expériences mettant en vedette dommages à l'ADN induite par laser suivent généralement l'induction de la DDR. Ces expériences sont rarement concernés par les questions relatives à la réplication de l'ADN. D'autre part, les analyses de fibres d'ADN sont généralement utilisés pour les études de réplication. L'exposition des cellules à des impulsions courtes d'analogues nucléosidiques halogénés résultats dans leur incorporation dans l'ADN. Une analyse d'immunofluorescence des fibres d'ADN révèle des analogues incorporés voies représentant la synthèse récente de l'ADN. Il était intéressant de se demander si la réplication de l'ADN a eu lieu dans le bandes laser ICL localisée, et si oui, quel serait le modèle de réplication à proximité des ICL? Les cellules ont été incubées pendant 24 h avec CldU pour faciliter l'affichage des fibres longues. ICL laser localisé ont été introduits dans des cellules, suivie d'une impulsion de 1 h de CDI. ADN f IBERS ont été préparés à partir des cellules ciblées et Dig tagged ICL et les étendues de réplication affichés. Les résultats indiquent que l'activation du laser du psoralène ne ferme pas la réplication ou d'affecter la fréquence globale des modèles de réplication. La réplication a eu lieu sur un côté, et également sur les deux côtés de la CIST, avec les motifs à double face dans un mélange 4: 1 de majorité que nous avons récemment montré 21.
Figure 1: génération de laser Localisés Dig-TMP ICL. (A) Structure de psoralène Dig-triméthyle. (B) L' accumulation de γ-H2AX (vert) dans le ROI contenant ICL localisé laser (DIG, rouge). Le noyau est coloré avec DAPI (bleu). La photo montre une cellule fond clair en partie sur la marque faite par la plume de diamant. Notez le nucléoles et le placement du retour sur investissement en dehors d'eux.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg » target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: ADN avec fibres laser Localized signaux Dig-TMP. (A) Les cellules ont été incubées pendant 24 h avec CldU à étiqueter ADN. Puis ICL localisée au laser ont été introduites et (B) les cellules ont été récoltées et étalées fibres. (C, D) Les signaux de fouille sont affichés avec un point d'immunoquantum (rouge) et le CldU par immunofluorescence (vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La technologie de localisation laser nécessite l'utilisation de cellules adhérentes avec des noyaux qui sont visibles en microscopie en champ clair. Nous avons essayé de fixer les cellules non adhérentes, telles que les lymphocytes primaires, ou des cellules cultivées faiblement adhérentes telles que AD293, à la surface du verre avec des préparations adhésives des cellules tels que la polylysine ou de collagène, ou des mélanges plus complexes. Bien que ces traitements peuvent lier les cellules à la surface, nous constatons qu'ils restent généralement arrondie qui rend très difficile de se concentrer dans les noyaux. En outre, les cellules ne parviennent pas souvent à survivre le lavage initial après le retrait du milieu de croissance. Toutefois, dans l'exigence de cellules adhérentes, nous avons utilisé avec succès un large éventail de lignées cellulaires standard ainsi que des cellules primaires pour ces études. Il est utile de tester les cellules de contamination par des mycoplasmes. Nous constatons que les réponses des cellules sont modifiées par ces infections.
Le plan focal du laser est important. L'objectif est deplacer les ICL dans le noyau. Trop élevé et le photoactivation sera au-dessus du noyau; trop faible et il sera sur le verre. Nous estimons qu'il est utile de mieux cibler l'image DIC à l'intersection du cytoplasme et le noyau.
Les analyses de fibres ne sont pas difficiles, mais exigent une certaine pratique avant les champs interprétables sont récupérés. Il est important de mettre en œuvre cette technique correctement. Le nombre de cellules récupérées à partir des expériences laser est faible, et chaque échantillon est utilisé dans son intégralité sur une seule diapositive. Par conséquent, il est essentiel de maximiser le rendement de chaque expérience, que les échantillons ne peuvent pas être séparés, avec des portions enregistrées pour une analyse ultérieure. Cependant, des centaines d'événements peuvent être récupérés à partir d'un seul échantillon. Deux éléments de la procédure sont d'une importance capitale. L'un est le débit du lysat cellulaire sur le toboggan. Si trop vite, une grande partie de l'ADN tarisse la diapositive. La qualité des lames de verre est également critique. Nous ręce de temps en tempsive beaucoup qui sont inefficaces. En conséquence, chaque nouveau lot doit être testé avant l'utilisation.
Comme cela est vrai pour toutes les manipulations de laboratoire la fiabilité des réactifs commerciaux-anticorps, des points de immunoquantum, etc., est toujours une préoccupation. Ceux-ci ne sont pas toujours stables et l'échec expérimental est généralement de problèmes relatifs aux un ou l'autre réactif. Les points de immunoquantum sont particulièrement problématiques et plus d'un lot peuvent avoir besoin d'être testés afin d'identifier celui qui est acceptable. beaucoup sont marquées par Inefficacité des signaux de fond élevés. Ceux-ci ne sont pas associés à des fibres et seront visibles sur les régions de la diapositive qui n'ont pas l'ADN.
L'utilisation de lasers pour introduire dommages à l'ADN local est devenu très populaire depuis qu'il a été présenté par le groupe Bonner 4. Dans ceux-ci, et les expériences les plus suivantes, les réglages de puissance laser sont fixés de manière à induire directement la DDR. Nous avons utilisé un réglage de puissance Suc suffisamment faibleh que l'activation du DDR dépend à la fois laser et psoralène. Comme indiqué plus haut, la séparation entre les adduits psoralène soutient que nous examinons la réponse à des événements individuels. Alors que le nombre de ICL qui sont formés par des agents de réticulation endogène ne sait pas, on constate que la localisation des adduits de psoralène ne tue pas les cellules, car ils sont en mesure d'éliminer les adduits de psoralène dans les 6-8 h (données non publiées) et sont présents et en bonne santé 24 h plus tard. Ainsi, cette approche est beaucoup moins toxique pour les cellules que les protocoles qui nécessitent une exposition à des agents qui introduisent des dommages de l'ADN à travers le noyau et les mitochondries.
La combinaison laser / psoralène introduire une structure de distorsion d'hélice qui activent le DDR. À cet égard , les résultats obtenus par cette approche sont applicables à toute une gamme de lésions des effets de distorsion de l' hélice, étant donné la nature en cascade du DDR, suite à l'activation de l'ATM / DNAPK / ATR 22 kinases.À cet égard, l'approche de la fibre d'ADN décrite ici pourrait être étendue à toute structure d'ADN qui peut être détectée par des moyens immunologiques ou chimiques ou biochimiques qui peuvent être affichés par fluorescence. Ceux - ci pourraient inclure des UV photoproduits 23, 24 alkylants volumineux, G quadruplex 25, et les lésions oxydatives 5.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée en partie par le programme de recherche intra-muros des NIH, l'Institut national sur le vieillissement (Z01 AG000746-08) et le Fonds de recherche anémie de Fanconi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB? Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T. Causes of genome instability. Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
