Summary
Aqui, apresentamos um método para expressar e purificar S100A12 (calgranulina C). Descrevemos um protocolo para medir sua atividade antimicrobiana contra o patógeno humano H. pylori .
Abstract
As proteínas de calgranulina são mediadores importantes da imunidade inata e são membros da classe S100 da família EF-mão de proteínas de ligação de cálcio. Algumas proteínas S100 têm a capacidade de se ligar a metais de transição com alta afinidade e efetivamente seqüestrar eles longe de patógenos microbianos invasores em um processo que é denominado "imunidade nutricional". O S100A12 (EN-RAGE) liga tanto o zinco como o cobre e é altamente abundante em células imunes inatas tais como macrófagos e neutrófilos. Relatamos um método refinado para a expressão, enriquecimento e purificação de S100A12 na sua configuração ativa de ligação a metais. A utilização desta proteína em análises de crescimento e viabilidade bacteriana revela que S100A12 tem actividade antimicrobiana contra o patogénio bacteriano Helicobacter pylori . A actividade antimicrobiana baseia-se na actividade de ligação ao zinco de S100A12, que quela o zinco nutriente, privando assim H. pylori que requer zinco para crescimento e pRoliferation.
Introduction
As prote�as S100 s� uma classe da fam�ia EF-hand de prote�as de liga�o de c�cio com uma diversidade de fun�es 1 . Eles são expressos de uma forma específica de tecidos e células, e regulam um amplo espectro de funções celulares 2 , 3 . Exclusivas para proteínas de ligação ao cálcio, as proteínas S100 exibem funções intracelulares e extracelulares 4 , 5 . Dentro da célula, a ligação de Ca2 + induz uma alteração conformacional que expõe uma superfície hidrofóbica que alveja especificamente parceiros de ligação à proteína 6 . Este mecanismo intracelular regula processos importantes como proliferação celular, diferenciação e metabolismo energético. No meio extracelular, as proteínas S100 exibem duas funções 7 . Num deles, actuam como proteínas associadas a padrões moleculares associados (DAMP) e iniciam uma pró-inflamaçãoResposta imune atórica através da interação com receptores de reconhecimento de padrão 8 , 9 . Além disso, vários membros da classe de proteínas S100 sequestam metais de transição, uma função que serve para privar patógenos microbianos em um processo denominado imunidade nutricional 10 , 11 .
S100A12 (também conhecida como calgranulina C e EN-RAGE) é altamente expressa em macrófagos e neutrófilos e tem sido identificada como potencial biomarcador para doenças inflamatórias 12,13 . Além de ligar o cálcio nos seus locais EF-Hand, S100A12 tem dois locais de ligação de metais de transição de alta afinidade localizados em extremidades opostas da interface dimérica 14 , 15 . Cada sítio de ligação é constituído por três resíduos de histidina e um resíduo de ácido aspártico e pode quelar zinco ou cobre <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Recentemente, relatamos que a fome de zinco dependente de S100A12 é importante na regulação do crescimento de Helicobacter pylori e da atividade de fatores de virulência pró-inflamatórios 18 .
H. pylori infecta o estômago de cerca de metade da população humana do mundo; Tornando-se sem dúvida um dos mais bem sucedidos patógenos bacterianos [ 19] . A infecção com H. pylori pode levar a resultados significativos da doença gástrica incluindo gastrite, úlcera péptica e duodenal, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT) e adenocarcinoma gástrico invasivo (câncer de estômago). O câncer de estômago é a principal causa de morte associada ao câncer de não-cardia no mundo, eo maior fator de risco associado para câncer de estômago é a infecção por H. pylori .
H. pylori persiste no nicho gástrico apesar de um robuSt resposta imune ao patógeno, sublinhando a necessidade de uma melhor compreensão dos mecanismos imunes de controle desta infecção bacteriana 20 , 21 , 22 , 23 . A inflamação associada ao H. pylori é caracterizada por uma profunda infiltração de células polimorfonucleares, ou neutrófilos, que depositam um repertório de proteínas antimicrobianas, incluindo S100A12, no local da infecção 18 , 24 , 25 . Em um esforço para entender o complexo diálogo entre hospedeiro e patógeno, buscamos refinar a técnica para purificar S100A12 e usá-lo para estudar o efeito antimicrobiano que exerce sobre este patógeno clinicamente relevante. O protocolo abaixo descreve uma técnica melhorada para a purificação de S100A12 no seu estado biologicamente activo; Capazes de se ligar a metais nutrientes com altaE eliminando-os de microrganismos invasores. Além disso, os métodos abaixo destacam a utilidade desta proteína como um reagente crítico para estudar o mecanismo pelo qual as moléculas antimicrobianas inatas restringem o crescimento de patógenos bacterianos.
As proteínas da família S100A ganharam apreciação como um importante grupo de moléculas do sistema imune inatas que participam na sinalização imune bem como na defesa do hospedeiro 27 . O mais bem estudado destes é a calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . A calprotectina é uma proteína associada a neutrófilos que forma um heterodímero das subunidades S100A8 e S100A9 que liga metais de transição na interface dímero 31 . Verificou-se que a calprotectina possui dois locais de ligação de metal: o local 1 pode ligar Zn2 + , Mn2 + ou Fe2 + e o sítio 2 pode Se Zn2 + 31 , 32 . Numerosos relatos demonstraram que a calprotectina tem atividades antimicrobianas contra diversos agentes patogênicos incluindo Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli e H. pylori e que os efeitos inibitórios são devidos à atividade de quelação de metal da calprotectina 25,28 , 29 .
Trabalhos anteriores demonstraram que a calprotectina exerce numerosas atividades sobre H. pylori, incluindo a alteração da estrutura do lípido A na membrana externa, reprimindo o sistema de secreção tipo IV (que é um importante fator de virulência proinflamatório dentro de H. pylori ), induzindo a formação de biofilme e reprimindo Crescimento e viabilidade de H. pylori de uma forma dependente da doseClass = "xref"> 25 , 33 . Além disso, os ensaios genéticos e bioquímicos revelaram que a actividade antibacteriana da calprotectina contra H. pylori foi largamente derivada da sua capacidade para ligar o zinco nutriente 25 . H. pylori requer zinco, como foi determinado por pesquisas anteriores, que utilizou um meio quimicamente definido para determinar os requisitos de micronutrientes para este patógeno para crescer e proliferar [ 34] . Além disso, a calprotectina foi altamente abundante nos tecidos infectados com H. pylori e associada a infiltrados neutrófilos, indicando que o hospedeiro pode empregar calprotectina como estratégia antimicrobiana durante a infecção e subseqüente inflamação 25,35.
Evidências recentes de técnicas de triagem proteômica não-direcionadas sugerem que sob condições onde espécies reativas de oxigênio são abundantes, calprotecO estanho sofre modificações pós-translacionais que alteram o local de ligação da hexa-histidina, inibindo assim a actividade de ligação do metal da proteína 36 . Como tal, nós hipotetizamos que outras proteínas da família S100A entre o vasto repertório dessas moléculas poderiam potencialmente atuar como quelantes metálicos auxiliares. Seleccionou-se S100A12 para estudo adicional porque não foi identificado no referido ecrã para modificação pós-tradução, tem a capacidade de ligar o zinco e é altamente abundante em tecidos humanos derivados de indivíduos infectados com H. pylori .
O nosso trabalho indica que S100A12 pode inibir o crescimento ea viabilidade de H. pylori de uma forma dependente da dose na estirpe G27 de H. pylori , e que a actividade antimicrobiana desta proteína pode ser invertida pela adição de zinco em excesso de nutrientes. Este trabalho complementa o nosso trabalho anterior indicando S100A12 exerceram atividade antimicrobiana contra PMSS1 e 7.13 de H. pylori , demonstrando sua ampla atividade antibacteriana contra numerosos isolados clínicos e linhagens de H. pylori adaptadas ao laboratório 18 . Juntos, estes resultados confirmam a importância de S100A12 como um mecanismo para controlar o crescimento bacteriano e proliferação via imunidade nutricional. Futuros estudos desta importante interacção hospedeiro-bactéria poderiam incluir explorar a actividade de S100A12 para reduzir a carga bacteriana dentro dos tecidos do hospedeiro ou determinar a contribuição desta proteína para a sinalização imune no contexto da infecção por H. pylori .
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Protocol
1. Expressão de S100A12
- Transformar células BL21 DE3 competentes com um plasmídeo pGEMEX-S100a12 utilizando um protocolo padrão de choque térmico 18 . Adicionar 1 a 5 μL de plasmídeo a 50 μL de bactérias num tubo de microcentrífuga em gelo. Incubar durante 20 min.
- Aquecer as células a 42 ° C durante 30 s.
- Incubar as células em gelo durante 2 min.
- Adicionar 500 μL de meio SOC às células. Incubar a 37 ° C com agitação a 250 rpm num agitador orbital durante 1 h.
- Placa 150 μL da reação de transformação em meio LB-agar (suplementado com 100 μg / mL de ampicilina). Incubar durante 12-16 h a 37 ° C.
- Escolha uma colônia. Inocular 2 mL de LB (suplementado com 100 μg / mL de ampicilina).
- Incubar durante 4-6 h a 37 ° C num agitador orbital (300 rpm). A OD 600 deve ler entre 1-3 unidades de absorvância.
- Adicionar 500 μL de cultura inicial a 50 mL de ZYM-5052 autoinduCtion 26 suplementado com 100 μg / mL de ampicilina. Para melhor arejamento e máxima expressão, use um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Agitar (300 rpm) durante 24 h, a 37 ° C.
- Transferir a suspensão bacteriana para um tubo de centrífuga. Pellet as células por centrifugação (4.000 xg, 10 min) a 4 ° C.
- Decantar a mídia, registrar a amostra e armazenar a pasta celular a -80 ° C. A amostra é estável por anos.
2. Purificação de S100A12 utilizando cromatografia de baixa pressão
- Ressuspender as células em 30 mL de Tris 20 mM, pH 8,0.
- Sonicate a suspensão em gelo para lisar células. Utilize ~ 20 W de saída, 5 s ligado e 5 s fora do ciclo durante 5 min.
- Transferir a solução para tubos de centrífuga de alta velocidade. Esclarecer o lisado celular por centrifugação, 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
- Decantar o sobrenadante e transferir para um copo de polipropileno limpo de 100 mL. Arrefecer a solução colocando o copo em gelo. Adicionar uma agitaçãoR e adicionar lentamente 11,20 g de sulfato de amónio. Deixar a solução agitar sobre gelo durante mais 1 h. Isto irá criar uma solução a 60% de sulfato de amónio e precipitar a maioria das proteínas endógenas de E. coli . S100A12 permanecerá solúvel.
- Centrifugar a solução a 4 ° C, 20 000 xg durante 20 minutos para sedimentar a proteína precipitada.
- Decantar o sobrenadante e transferir para tubos de diálise (MWCO 3.500 kDa). Dializar contra 1 L de Tris 20 mM, pH 8,0 a 4 ° C. Mude o tampão de diálise duas vezes. Permitir 4 h entre as alterações.
- Cromatografia de permuta aniónica
- Realizar a cromatografia em um sistema de baixa pressão. O caudal típico é de 1 mL / min.
- Equilibrar uma coluna de 5 mL de Sepharose com 10 mL de Tris 20 mM, pH 8,0.
- Coloque os ~ 40 mL de solução de S100A12 usando a bomba de amostra (colete o fluxo através).
- Lavar a coluna com 10 mL de Tris 20 mM, pH 8.
- Desenvolver a coluna com um gradiente 0-30% (BuFfer B é Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 1 M) ao longo de 19 volumes de coluna (CV, 95 mL). Recolher fracções de 5 mL.
- Tomar uma alíquota de 10 μL de cada fracção e analisar utilizando MES SDS PAGE com coloração Coomassie. Executar o gel utilizando uma tensão constante (20 V / cm) durante 30 min.
- Pool fracções contendo S100A12. S100A12 corre a ~ 10 kDa de proteína num gel desnaturante.
- Concentrar as fracções para 5 mL utilizando um dispositivo de ultrafiltração (MWCO 10 kDa). Centrifugar a 3000 xg durante ~ 8 min. Pegue a fração superior.
- Cromatografia de exclusão de tamanho
- Equilibrar a coluna S75 com 1 CV (120 mL) de Tris 20 mM pH 8, NaCl 100 mM.
- Injectar <5 mL de fracções S100A12 concentradas (a partir da cromatografia de permuta iónica).
- Desenvolver a coluna a um caudal de 1 mL / m em 120 mL. Recolher fracções de 5 mL.
- Tomar uma alíquota de 10 μL de cada fracção e analisar utilizando SDS PAGE com coloração com Coomassie. Validar a identidade proteica usandoWestern blot ou espectrometria de massa (massa molecular calculada da subunidade monomérica 10,575.0 Da, medida 10575,4 Da).
- Frações de pool
- Medir a absorv�cia da prote�a A 280 utilizando um espectrofot�etro. Use o buffer SEC como um espaço em branco. O coeficiente de extinção calculado para o homodímero S100A12 é 5960 M -1 cm -1 .
NOTA: Rendimentos típicos são 35-45 mg de S100A12 por 50 mL de cultura. - Alíquota S100A12 em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (1 mg / tubo), congelamento rápido em azoto líquido e armazenar a -80 ° C.
- Medir a absorv�cia da prote�a A 280 utilizando um espectrofot�etro. Use o buffer SEC como um espaço em branco. O coeficiente de extinção calculado para o homodímero S100A12 é 5960 M -1 cm -1 .
3. Ensaios de actividade antimicrobiana
- Colocar a estirpe G27 de H. pylori sobre placas de ágar de soja trípticas suplementadas com sangue de ovelha a 5% (placas de ágar sangue). Crescer 2-3 dias a 37 ° C em ar ambiente suplementado com 5% de dióxido de carbono.
- Inocular H. pylori em caldo de Brucella suplementado com 1x colesterol. Cultura sobreAgitação noturna (250 rpm) a 37 ° C em ar ambiente suplementado com 5% de dióxido de carbono.
- Diluir H. pylori 1:10 em 50% de caldo de Brucella, 50% de tampão de calprotectina mais 1x colesterol e cultura em meio isolado ou suplementado com 100 μM de cloreto de zinco mais 0, 100 ou 1000 μg / mL de S100A12 purificado. Cultura agitação durante a noite (250 rpm) a 37 ° C em ar ambiente suplementado com 5% de dióxido de carbono.
- No dia seguinte, efectuar diluições em série e placa sobre placas de agar de sangue. Deixar as colónias bacterianas crescerem durante 2-3 dias a 37 ° C em ar ambiente suplementado com 5% de dióxido de carbono. Enumerar as unidades formadoras de colónias para calcular o crescimento bacteriano na presença ou ausência de S100A12 e / ou zinco exógeno.
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Representative Results
S100A12 expressão e purificação
Uma purificação em três passos produziu ~ 40 mg de S100A12 recombinante a partir de 50 mL de cultura bacteriana. O primeiro passo foi uma precipitação com sulfato de amónio de proteínas endógenas de E. coli . Este passo foi seguido por cromatografia de permuta aniónica ( Figura 1A ). A proteína é rastreada por uma SDS-PAGE corada com Coomassie Brilliant Blue ( Figura 1B ). O último passo do procedimento de purificação envolveu a mistura de fracções contendo S100A12 para cromatografia de exclusão de tamanho que separa proteínas por peso molecular e forma ( Figura 2A ). S100A12 é um homodímero (92 aminoácidos por subunidade) e tem um peso molecular total de cerca de 21 kDa. As fracções recolhidas a partir de cromatografia de exclusão de tamanho foram analisadas por SDS-PAGE e visualizadas por coloração com Coomassie ( Figura 2B
S100A12 reprime crescimento bacteriano via atividade de quelação de zinco
Para investigar a actividade antimicrobiana de S100A12, as análises de viabilidade bacteriana foram realizadas através de técnicas de cultura microbiológica quantitativas ( Figura 3 ). A enumeração de células bacterianas revela que a exposição a 100 μg / mL de S100A12 na presença ou ausência de uma fonte exógena de zinco nutriente não inibe significativamente a viabilidade bacteriana em comparação com os controlos sem adição de S100A12 (P> 0,05, ANOVA de sentido único). No entanto, a exposição a 1000 μg / mL de S100A12 em meio sozinho resulta numa diminuição de 69 vezes na viabilidade bacteriana em comparação com o meio sozinho (P = 0,0193, Teste t de Student, P> 0,05 ANOVA de Uma Via); Um resultado que foi revertido pela adição de uma fonte exógena de zinco nutriente (P = 0,023, Teste t de Student). Estes resultadosA actividade antimicrobiana de S100A12 depende da sua actividade de sequestro de zinco.
Figura 1: Lise celular e purificação com S100A12 por cromatografia de permuta aniónica . (A) Cromatograma de purificação por permuta iónica. Traço de absorvância UV a 280 nm mostrado em azul, gradiente de sal representado em rosa, recolhidas fracções marcadas em vermelho. ( B ) gel SDS PAGE dos passos de purificação. Pistas: 1) padrão de peso molecular 2) fracção de lisado solúvel 3) pastilha de sulfato de amónio 4) sulfato de amónio sobrenadante 5-14) fracções de cromatografia Q 6-15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados de cromatografia de exclusão de tamanho da purificação com S100A12. (A) Cromatograma de resultados de exclusão de tamanho. Traço de absorvância UV a 280 nm mostrado em azul, recolhidas fracções marcadas em vermelho. ( B ) SDS PAGE gel de cromatografia de exclusão de tamanho. Pistas: 1) marcador de peso de molécula 2) carga de amostra 3-15) fracções 10-21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análises de cultura quantitativa da viabilidade bacteriana em resposta à exposição à quelação de zinco dependente de S100A12. As bactérias foram expostas a 0, 100 ou 100 μg / mL de S100A12 em meio isolado (barras cinzentas), ou meio suplementado com 100 μM de cloreto de zinco(Barras pretas). A exposição a 1000 μg / mL na ausência de uma fonte exógena de zinco nutriente resulta em inibição significativa da viabilidade bacteriana (* P <0,05, teste t de Student comparado ao meio + condição de zinco). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
É apresentado um protocolo eficiente para expressão e purificação de S100A12 humano. O sistema de expressão de E. coli é a ferramenta mais comum usada para a produção de proteínas recombinantes, particularmente quando são necessárias quantidades de mg para estudos bioquímicos e biofísicos. Um aperfeiçoamento chave do procedimento aqui descrito é o uso de meios de auto-indução 26 que aumenta o rendimento da proteína purificada por um factor de quase trinta em comparação com a expressão com meios de caldo Luria padrão 18 . Além disso, a mídia de auto-indução simplifica muito o fluxo de trabalho de expressão de proteínas. Utilizando meios de crescimento convencionais, as culturas devem ser continuamente monitorizadas para que um agente indutor possa ser adicionado durante a fase de crescimento exponencial. Não há necessidade de monitorar os tempos de duplicação ao usar mídia de auto-indução. As culturas são deixadas crescer até a saturação. Durante os estágios iniciais de crescimento com autoinduçãoEm meio, E. coli usa glicose como uma fonte de carbono. Uma vez que a glicose está esgotada, as bactérias mudam para a lactose como uma fonte de carbono que induz a expressão da proteína 26 . A composição dos meios de auto-indução é ajustada de forma exquisita para permitir o crescimento de culturas de alta densidade e, portanto, a expressão aumentada de proteína recombinante. Em nossa experiência com S100A12, meios de auto-indução aumenta muito a quantidade de proteína expressa, no entanto, cuidado que isso pode ser dependente de proteínas e deve ser verificada experimentalmente.
S100A12 é expresso na fracção citoplasmática de E. coli o que sugere que é solúvel e bem dobrado. O primeiro passo da purificação envolve a adição de uma elevada percentagem de sulfato de amónio que precipita muitas das proteínas endógenas de E. coli . Este passo alavanca a elevada estabilidade e solubilidade da família de proteínas S100. S100A12 é moderadamente acídico (pI 5,81). Assim, S100A12 é purificado adicionalmente com uma resina de permuta aniónica forte. O último passo do processo de purificação é uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho que assegura que S100A12 é monodisperso e dimérico. Este passo do protocolo é crucial, uma vez que se demonstrou que S100A12 forma oligómeros solúveis 15 e é desconhecido o que pode afectar a oligomerização na sua actividade antimicrobiana. Como os membros da classe S100 compartilham alta seqüência e homologia estrutural, suas propriedades físicas são semelhantes 27 . Assim, este método de purificação de S100A12 pode ser amplamente aplicável a todas as proteínas S100 que são expressas na fracção solúvel de E. coli.
Trabalhos anteriores demonstraram que as proteínas S100, como a calprotectina, têm actividade antimicrobiana contra patógenos bacterianos, tais como H. pylori, e que esta actividade é dependente da actividade de ligação ao zinco 25 . O agente antimicrobianoA actividade de S100A12 também é dependente de zinco, mas a inibição de crescimento demonstrada em ensaios de crescimento bacteriano revela que é necessário significativamente mais S100A12 para inibir o crescimento em comparação com outras proteínas da família S100 tais como calprotectina. Assim, é crítico utilizar concentrações mais elevadas de S100A12 do que a calprotectina para se obterem fenotipos semelhantes (inibição do crescimento ou alterações na virulência). Aplicações futuras deste protocolo poderiam ser aplicadas para determinar alterações globais na expressão de genes bacterianos, alterações metabólicas ou proteômicas em resposta ao sequestro de metal imposto por S100A12.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Departamento de Veteranos Assuntos Carreira Desenvolvimento Award 1IK2BX001701, CTSA prêmio UL1TR000445 do Centro Nacional para o Avanço Translational Sciences, o National Science Foundation Award Números 1547757 e 1400969, e NIH concessão GM05551. Seu conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente visões oficiais do Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais ou dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S100A12 Expression | |||
| Expression cells | |||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 | |
| Autoinduction medium components | |||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 | |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 | |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 | |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 | |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 | |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 | |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 | |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 | |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 | |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 | |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 | |
| Selection agent | |||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 | |
| S100A12 Purification | |||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 | |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 | |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 | |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE | |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 | |
| H. pylori Culture | |||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 | |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 | |
| Cholesterol (250x) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
References
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