Summary
Burada, S100A12'yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz.
Abstract
Calgranulin proteinleri doğal bağışıklığın önemli aracılarıdır ve EF el ailesinin kalsiyum bağlayıcı proteinlerin S100 sınıfının üyesidir. Bazı S100 proteinleri, geçiş metallerini yüksek afinite ile bağlama kapasitesine sahiptir ve bunları, "beslenme bağışıklığı" olarak adlandırılan bir süreçte mikrobiyal patojenlere işgal etmekten alıkoyar. S100A12 (EN-RAGE), hem çinko hem de bakırı bağlar ve makrofajlar ve nötrofiller gibi doğal immün hücrelerde oldukça bol miktarda bulunur. S100A12'nin aktif, metal bağlayıcı konfigürasyonunda ekspresyon, zenginleştirme ve saflaştırma için rafine edilmiş bir metodu sunuyoruz. Bakteriyel büyüme ve canlılık analizlerinde bu proteinin kullanılması, S100A12'nin bakteri patojeni Helicobacter pylori'ye karşı antimikrobiyal etkinliğe sahip olduğunu ortaya koymaktadır . Antimikrobiyal aktivite, besleyici çinkoyu kenetleyen S100A12'nin çinko bağlanma aktivitesine dayandığından, büyüme için çinko gerektiren H.pylori'yi açlıktan besler ve proliferation.
Introduction
S100 proteinleri, çeşitli fonksiyon dizisine sahip 1 EF-el ailesi kalsiyum bağlayıcı proteinlerin bir sınıfıdır. Bunlar doku ve hücreye spesifik bir şekilde ifade edilir ve geniş bir hücre fonksiyonları yelpazesini 2 , 3 düzenler. Kalsiyum bağlayıcı proteinlere özgü olan S100 proteinleri hem hücre içi hem de hücre dışı işlevleri gösterirler 4 , 5 . Hücre içinde, Ca 2 + bağlanması özellikle protein bağlama ortakları 6 hedefleyen bir hidrofobik yüzey ortaya bir yapısal değişiklik indüklenir. Bu hücre içi mekanizma hücre proliferasyonu, farklılaşma ve enerji metabolizması gibi önemli süreçleri düzenler. Ekstraselüler çevrede, S100 proteinleri iki işlev sergilemektedir 7 . Birinde, moleküler model (DAMP) proteinlerine hasar gibi davranırlar ve bir pro-inflammayı başlatırlarKalıp tanıma reseptörleri 8 , 9 ile etkileşim yoluyla bağışıklık cevabını ileri sürmek. Ek olarak, S100 protein sınıfının birkaç üyesi, geçiş metallerini, besleyici bağışıklık 10 , 11 olarak adlandırılan bir süreçte mikrobik patojenlere aç bırakmaya hizmet eden bir işlevi saklar.
S100A12 (aynı zamanda calgranulin C ve EN-RAGE olarak da bilinir), makrofajlar ve nötrofillerde yüksek oranda eksprese edilir ve inflamatuar hastalıklar için potansiyel bir biyolojik belirteç olarak tanımlanmıştır 12,13. EF-Hand bölgelerinde kalsiyumu bağlamaya ek olarak, S100A12 dimer arayüzünün 14 , 15 karşı uçlarında bulunan iki yüksek afiniteli geçiş metali bağlama mevkisine sahiptir. Her bir bağlanma yeri, üç histidin kalıntısı ve bir aspartik asit kalıntısı içerir ve çinko veya bakır <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Yakın zamanda, S100A12'ye bağımlı çinko açlığın, Helicobacter pylori büyümesini ve pro-inflamatuar virulans faktörlerinin aktivitesini düzenleyen önemli olduğunu bildirdik.
H. pylori , dünyadaki insan nüfusunun yaklaşık yarısının karnını enfekte eder; Bunu en başarılı bakteriyel patojenlerden biri haline getirir 19 . H. pylori ile enfeksiyon gastrit, peptik ve duodenal ülser, mukoza ilişkili lenfoid doku (MALT) lenfoma ve invaziv gastrik adenokarsinoma (mide kanseri) gibi önemli gastrik hastalık sonuçlarına yol açabilir. Karaciğer kanseri, dünyada kardiyovasküler kansere bağlı ölümlerin önde gelen sebebidir ve mide kanseri için tek büyük ilişkili risk faktörü H. pylori ile enfeksidir.
H. pylori , gevrek olmasına rağmen mide nişinde devam ederBu bakteriyel enfeksiyonu kontrol altına almak için bağışıklık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç olduğunu vurguladı. H. pylori'ye bağlı inflamasyon, enfeksiyon yeri 18 , 24 , 25'de S100A12 de dahil olmak üzere antimikrobiyal proteinlerin bir repertuarını depolayan polimorfonükleer hücrelerin veya nötrofillerin derin infiltrasyonu ile karakterizedir. Ev sahibi ve patojen arasındaki karmaşık diyalogu anlamak için, S100A12'yi saflaştırma tekniğini hassaslaştırmaya ve bu tıbbi açıdan ilgili patojene uyguladığı antimikrobiyal etkiyi incelemek için kullanmaya çalıştık. Aşağıdaki protokol, biyolojik açıdan aktif durumda S100A12 saflaştırması için geliştirilmiş bir tekniğin özetini vermektedir; Besleyici metalleri yüksek oranda bağlayabilenBunları işgal altındaki mikroorganizmalara toplayıp onları şelale haline getirin. Ayrıca, aşağıdaki yöntemler, bu proteinin, doğuştan gelen antimikrobiyal moleküllerin bakteriyel patojenlerin büyümesini sınırlandırdığı mekanizmayı incelemek için kritik bir reaktif olarak kullanılmasını vurgulamaktadır.
S100A ailesindeki proteinler, konak savunmasının yanı sıra bağışıklık sinyalizasyonuna katılan doğal bir bağışıklık sistemi molekülünün önemli bir parçası olarak takdir kazanmışlardır. Bunların en iyi çalışılanı kalprotektindir (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin, dimer ara yüz 31'de geçiş metallerini bağlayan S100A8 ve S100A9 alt birimlerinin bir heterodimeri oluşturan nötrofile bağlı bir proteindir. Calprotectin'in iki metal bağlama sahasına sahip olduğu gösterilmiştir: Site 1, Zn 2+ , Mn 2+ veya Fe 2+ 'yi bağlayabilir ve Site 2, Zn 2+ 31 , 32'yi bağlayın . Calprotectinin, Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli ve H. pylori gibi çeşitli patojenlere karşı antimikrobiyal etkinlik gösterdiğini ve önleyici etkilerin calprotectin 25 , 28'in metal şelasyon aktivitesinden kaynaklandığını gösteren çok sayıda rapor var. , 29 .
Calprotectin, dış membrandaki lipit A yapısının değiştirilmesi, cag -Type IV salgılama sisteminin ( H. pylori içinde önemli bir proenflamatuar virulans faktörüdür) bastırılması, biyofilm oluşumuna neden olması ve bastırılması da dahil olmak üzere H. pylori üzerinde çok sayıda etkinlik sergilediğini gösterdi H. pylori büyümesi ve canlı dozu doza bağımlı bir şekildeClass = "xref"> 25 , 33 . Dahası, genetik ve biyokimyasal analizler, H. pylori'ye karşı calprotectin'in antibakteriyel etkisinin büyük oranda besleyici çinkoyu 25 bağlama yeteneğinden kaynaklandığını ortaya koymuştur. H. pylori , bu patojenin büyümesi ve çoğalması için mikrobesin gereksinimlerini belirlemek için kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam kullanan önceki araştırmalar tarafından belirlendiği üzere çinko gerektirir 34 . Buna ek olarak, kalprote- tein, H. pylori ile enfekte dokular içinde oldukça miktarda bulunur ve nötrofilik infiltratlarla ilişkili olup, konakçıya enfeksiyondan sonra inflamasyon sırasında kalprotektini antimikrobiyal bir strateji olarak kul- lanılabilir.
Yansız proteomik tarama tekniklerinden elde edilen son bulgular, reaktif oksijen türlerinin bol olduğu koşullar altında, kalprotecKalay, hekza-histidin bağlanma yerini değiştiren, dolayısıyla proteinin metal bağlanma aktivitesini inhibe eden translasyon sonrası modifikasyonları gerçekleştirir 36 . Bu nedenle, bu moleküllerin geniş repertuarındaki diğer S100A ailesindeki proteinlerin potansiyel olarak yardımcı metal-kıskaçlayıcılar olarak işlev görebileceğini varsaydık. Daha sonraki çalışma için S100A12'yi seçtik çünkü söz konusu translasyon sonrası modifikasyon ekranı üzerinde tanımlanmadı, çinkoyu bağlama kapasitesine sahipti ve H. pylori ile enfekte olmuş kişilerden türetilen insan dokularında oldukça bol miktarda bulunur.
Çalışmalarımız, S100A12'nin, H. pylori'nin G27 suşunda H. pylori büyümesini ve yaşayabilirliğini doza bağımlı bir şekilde inhibe edebildiğini ve bu proteinin antimikrobiyal aktivitesinin fazla besleyici çinko ilavesiyle tersine çevrilebileceğini gösteriyor. Bu çalışma, S100A12'nin PMSS1 ve 7.1'e karşı antimikrobiyal etkinlik gösterdiğini gösteren önceki çalışmamızı tamamlamaktadır3 suşu H. pylori , sayısız klinik izolelere ve laboratuara uyarlanmış H. pylori suşlarına karşı geniş antibakteriyel etkisini göstermektedir. Birlikte, bu sonuçlar S100A12'nin besleyici bağışıklık yoluyla bakteri gelişimini ve proliferasyonunu kontrol eden bir mekanizma olarak önemini teyit eder. Bu önemli konak-bakteriyel etkileşimin gelecekteki çalışmaları arasında, konukçu dokulardaki bakteri yükünü azaltmak veya H. pylori enfeksiyonu bağlamında bu proteinin bağışıklık sinyalizasyonuna katkısını belirlemek için S100A12 aktivitesini kullanmak yer alabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. S100A12'nin ifadesi
- Yetkili BL21 DE3 hücrelerini standart bir ısı şok protokolü kullanarak pGEMEX-S100a12 plazmid ile değiştirin 18 . Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde bakteri 50 mcL plazmid 1 ila 5 mcL ekleyin. 20 dakika inkübe edin.
- Isı hücreleri 42 ° C'de 30 saniye boyunca şoklanır.
- Hücreleri 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Hücrelere 500 μL SOC ortamı ekleyin. 1 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda 250 dev / dak'da çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edin.
- LB-agar ortamında (100 ug / mL ampisilin ile takviye edilmiş) 150 μL transformasyon reaksiyonu plakası. 12-16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Bir koloni seç. 2 mL LB (100 μg / mL ampisilin takviyeli) aşılayın.
- Orbital çalkalayıcıda (300 dev / dak.) 37 ° C'de 4-6 saat inkübe edin. OD 600 , 1-3 absorbans birimi arasında okunmalıdır.
- 50 mL ZYM-5052 autoindu'ya başlangıç kültürü 500 mcL ekleyinCtion media 26 , 100 μg / mL ampisilin ile takviye edilmiştir. En iyi havalandırma ve maksimum ekspresyon için, 250 mL'lik şaşkın bir Erlenmeyer şişeyi kullanın. 37 ° C'de 24 saat boyunca çalkalayın (300 rpm).
- Bakteri süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 4 ° C'de santrifüj (4,000 xg, 10 dakika) ile peletleyin.
- Ortamı süzün, numuneyi alın ve -80 ° C'de hücre pastasını saklayın. Numune yıllarca istikrarlıdır.
2. Düşük Basınçlı Kromatografi Kullanılarak S100A12'nin Saflaştırılması
- 30 mL 20 mM Tris, pH 8.0 içinde süspansiyon hücreleri.
- Hücreleri lize etmek için süspansiyonu son haline getirin. ~ 20 W çıkış, 5 sn açık ve 5 sn kapalı 5 sn kapalı kullanın.
- Çözümü yüksek hızlı santrifüj tüplerine aktarın. Hücre lisatını 4 ° C'de 30 dakika süreyle 20,000 xg santrifüjle açıklayın.
- Yüzey maddeyi boşaltın ve temiz bir 100 mL polipropilen beherine aktarın. Çözeltiyi buz üzerinde bırakarak soğutun. Bir karıştırma ba ekleyinR karıştırın ve yavaş yavaş 11.20 g amonyum sülfat ekleyin. Çözeltinin buz üzerinde bir saat daha karıştırmasına izin verin. Bu,% 60 amonyum sülfat solüsyonu oluşturacak ve E. coli endojen proteinlerinin çoğunu çöktürecektir. S100A12 çözünebilir durumda kalır.
- Çözeltiyi 4 ° C'de, 20.000 xg'de 20 dakika boyunca santrifüjden geçirerek çöktürülmüş proteinin pelet haline getirin.
- Süpernatantı boşaltın ve diyaliz borusuna aktarın (MWCO 3,500 kDa). 4 ° C'de 1 L 20 mM Tris, pH 8.0 karşısında dialize edin. Diyaliz tamponunu iki kez değiştir. Değişiklikler arasında 4 saat izin ver.
- Anyon değişim kromatografisi
- Düşük basınçlı bir sistemde kromatografi uygulayın. Tipik akış hızı 1 mL / dak'dır.
- 5 mL Sepharose sütununu 10 mL 20 mM Tris, pH 8.0 ile dengeleyin.
- ~ 40 mL S100A12 çözeltisini örnek pompayı kullanarak yükleyin (akışı toplayın).
- Kolonu 10 mL 20 mM Tris, pH 8 ile yıkayın.
- Sütunu% 0-30 gradyan ile geliştirin (BuFfer B, 20 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCI'dir) 19 sütun hacmi (CV, 95 mL) üzerinde. 5 mL'lik fraksiyonları toplayın.
- Her fraksiyonun 10 mcL kısımlarını alın ve Coomassie boyası ile MES SDS PAGE kullanarak analiz edin. 30 dakika süreyle sabit voltaj (20 V / cm) kullanarak jel çalıştırın.
- S100A12 içeren havuz fraksiyonları. S100A12, bir denatüre edici jel üzerinde ~ 10 kDa protein ile çalışır.
- Bir ultrafiltrasyon cihazı (MWCO 10 kDa) kullanarak fraksiyonları 5 mL'ye konsantre edin. ~ 8 dakika boyunca 3000 xg'de santrifüjleyin. En üstteki kesimi alın.
- Ebat-eksklüzyon kromatografisi
- S75 sütununu 1 CV (120 mL) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl ile dengeleyin.
- <5 mL konsantre S100A12 fraksiyonlarını enjekte edin (iyon değişim kromatografisinden).
- Kolonu, 120 mL üzerinde 1 mL / m'lik bir akış hızında geliştirin. 5 mL'lik fraksiyonları toplayın.
- Her fraksiyonun 10 uL'lik bir alikotu alın ve Coomassie boyası ile SDS PAGE kullanarak analiz edin. Kullanarak protein kimliğini doğrulayınBatı leke veya kütle spektrometresi (10.575.0 Da monomerik alt biriminin hesaplanmış moleküler kütlesi, 10575.4 Da ölçülmüştür).
- Havuz fraksiyonları
- Bir spektrofotometre kullanarak A 280 proteininin absorbansını ölçün. SEC tamponunu boş olarak kullanın. S100A12 homodimeri için hesaplanan sönüm katsayısı 5960 M -1 cm " 1'dir.
NOT: Tipik verim 50 mL kültür başına 35-45 mg S100A12'dir. - Parçacık S100A12 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (1 mg / tüp) aktarılır, sıvı nitrojende flash dondurulur ve -80 ° C'de saklanır.
- Bir spektrofotometre kullanarak A 280 proteininin absorbansını ölçün. SEC tamponunu boş olarak kullanın. S100A12 homodimeri için hesaplanan sönüm katsayısı 5960 M -1 cm " 1'dir.
3. Antimikrobiyal Aktivite Testleri
- % 5 koyun kanı (kan agar plakaları) ile takviye edilmiş tamponlu soya agar plakalarına H. pylori suşu çizdirin. Oda havasındaki 37 ° C'de% 5 karbon dioksit ile desteklenmiş 2-3 gün büyütün.
- H. pylori'yi 1x kolestrol ile desteklenmiş Brucella suyu içine aşılayın. Üzerinde kültürOda havasında 37 ° C sıcaklıkta gece sallayarak (250 dev / dak.)% 5 karbon dioksit ile takviye edilmiştir.
- H. pylori 1: 10'u% 50 Brucella suyu,% 50 kalprotein tamponu artı 1x kolesterol ve kültür ortamında tek başına veya 100 uM çinko klorür artı 0, 100 veya 1000 μg / mL arıtılmış S100A12 ile takviye haline getirin. Kültür oda sıcaklığında gece boyunca 37 ° C'de çalkalanarak (250 rpm)% 5 karbon dioksit ile takviye edildi.
- Ertesi gün, seri seyreltmeler yapın ve kan agar plakalarına koyun. Bakteri kolonilerinin oda havasında 37 ° C'de 2-3 gün boyunca% 5 karbon dioksit ile takviye edilmesine izin verin. S100A12 ve / veya eksojen çinko varlığında veya yokluğunda bakteri üremesini hesaplamak için koloni oluşum birimlerini numaralandırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S100A12 ifade ve saflaştırma
Üç aşamalı bir saflaştırma 50 mL bakteri kültüründen ~ 40 mg rekombinant S100A12 üretti. İlk adım, endojen E. coli proteinlerinin amonyum sülfat çökeltilmesiydi. Bu aşamayı anyon değişim kromatografisi izledi ( Şekil 1A ). Protein, Coomassie Brilliant Blue ile boyanan bir SDS-PAGE ile izlenir ( Şekil 1B ). Saflaştırma prosedürünün son adımı proteinleri molekül ağırlığı ve şekli ile ayıran boyut dışlama kromatografisi için S100A12 ihtiva eden fraksiyonları bir araya getirmektir ( Şekil 2A ). S100A12 bir homodimer olup (altbirim başına 92 amino asittir) ve yaklaşık 21 kDa'lık bir toplam moleküler ağırlığa sahiptir. Boy-dışlama kromatografisinden toplanan fraksiyonlar SDS-PAGE ile analiz edildi ve Coomassie boyama ile görüntülendi ( Şekil 2B
S100A12 çinko şelasyon aktivitesi ile bakteri üremesini engeller
S100A12'nin antimikrobiyal aktivitesini araştırmak için, niceliksel mikrobiyolojik kültür teknikleri ile bakteri canlılığı analizleri yapıldı ( Şekil 3 ). Bakteri hücrelerinin sayımı, ekzojen bir besin kaynağı çinkosu varlığında veya yokluğunda 100 μg / mL S100A12'ye maruz bırakmanın, S100A12 eklenmemiş kontrollere kıyasla (P = 0.05, Tek yönlü ANOVA) bakteri canlılığını önemli ölçüde inhibe etmediğini ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, tek başına ortamda 1000 μg / mL S100A12'ye maruz kalma, tek başına ortamla karşılaştırıldığında bakteri yaşayabilirliğinde 69 kat azalma ile sonuçlanır (P = 0.0193, Öğrenci t Testi, P> 0.05 Tek Yönlü ANOVA); Bunun sonucunda ekzojen bir besin çinkosu kaynağı eklenmesiyle tersine döndü (P = 0.023, Student's t Testi). Bu sonuçlar deMonstrat S100A12'nin antimikrobiyal aktivitesi, çinko tutma etkinliğine bağlı.
Şekil 1: Anyon değiştirme kromatografisi ile hücre lizisi ve S100A12 saflaştırması . ( A ) İyon değişimi saflaştırma işleminin kromatogramı. UV emicili 280 nm'de mavi renkte gösterilen iz, tuz değişimi pembe olarak gösterilir, kırmızı parçalarla işaretlenmiş fraksiyonlar toplanır. ( B ) saflaştırma adımlarının SDS PAGE jeli. Şeritler: 1) moleküler ağırlık standardı 2) çözünür lizat fraksiyonu 3) amonyum sülfat pelet 4) amonyum sülfat süpernatan 5-14) Q kromatografi fraksiyonları 6-15. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: S100A12 saflaştırmasının boyut dışlama kromatografısi sonuçları. ( A ) Boyut dışlama sonuçlarının kromatogramı. 280 nm'de UV absorpsiyon izi mavi ile gösterilir, toplanan kesirler kırmızı olarak işaretlenmiştir. ( B ) boyut dışlama kromatografısinin SDS PAGE jeli. Şeritler: 1) molekül ağırlığı markörü 2) örnek yük 3-15) fraksiyonları 10-21. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: S100A12'ye bağlı çinko şelasyona maruz kalma durumuna yanıt olarak bakteri canlılığının niceliksel kültür analizleri. Bakteriler, yalnızca ortamda (gri çubuklar) 0, 100 veya 100 ug / mL S100A12'ye maruz bırakıldı veya 100 uM çinko klorid ile desteklenmiş ortam(Siyah çubuklar). Ekzojen bir besin çinkosu kaynağı bulunmadığında 1000 μg / mL'ye maruz kalma, bakteri canlılığının önemli ölçüde inhibe edilmesine neden olur (* P <0.05, Student t'nin orta + çinko koşuluyla karşılaştırılması). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsan S100A12'nin ekspresyonu ve saflaştırılması için etkili bir protokol sunulmuştur. E. coli ekspresyon sistemi, özellikle biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için mg miktarları gerektiğinde rekombinant proteinlerin üretimi için kullanılan en yaygın araçtır. Burada tarif edilen prosedürün anahtar geliştirilmesi, standart Luria besiyeri ortamı 18 ile ekspresyona kıyasla saflaştırılmış proteinin verimini neredeyse otuz kadar arttıran otomatik endüksiyon medyasının 26 kullanılmasıdır. Ek olarak, otomatik endüksiyon medyası, protein ifadesi iş akışını büyük ölçüde basitleştirir. Konvansiyonel büyüme ortamı kullanıldığında kültürler üstel büyüme evresi boyunca indükleyici bir ajan eklenebilecek şekilde sürekli olarak izlenmelidir. Otomatik endüksiyonlu ortam kullanırken katlama sürelerinin izlenmesine gerek yoktur. Kültürlerin doygun hale gelmesine izin verilir. Otomatik inducti ile büyümenin ilk aşamalarındaOrtamda, E. coli karbon kaynağı olarak glikoz kullanır. Glikoz tüketildiğinde, bakteriler, protein ekspresyonunu indükleyen karbon kaynağı olarak laktoza geçiş yapar 26 . Otomatik indüksiyon ortamının kompozisyonu, yüksek yoğunluklu kültürlerin büyümesine ve dolayısıyla rekombinant proteinin artmış ekspresyonuna izin vermek için zarifçe ayarlanmıştır. S100A12 deneyimlerimizde, otomatik indüksiyon ortamı, eksprese edilen protein miktarını büyük oranda artırır, ancak bunun proteine bağımlı olabileceği ve deneysel olarak doğrulanması gerektiğini düşünüyoruz.
S100A12, E. coli'nin sitoplazmik fraksiyonunda eksprese edilir ve bu da çözünür ve iyi katlanmış olduğunu gösterir. Saflaştırmanın ilk basamağı, endojen E. coli proteinlerinin çoğunu çökerten yüksek oranda bir amonyum sülfat eklenmesini içerir. Bu adım, S100 protein ailesinin yüksek kararlılığını ve çözünürlüğünü arttırır. S100A12 orta derecede asidiktir (pI 5.81). Böylece S100A12 daha güçlü bir anyon değişim reçinesi ile saflaştırılır. Saflaştırma işleminin son basamağı, S100A12'nin monodispers ve dimerik olmasını sağlayan bir boyut uzaklaştırma kromatografısi sütunudur. S100A12'nin çözünür oligomerler 15 oluşturduğu gösterildiğinden protokolün bu adımı çok önemlidir ve oligomerizasyonun antimikrobiyal aktivitesi üzerindeki etkisinin ne olduğu bilinmemektedir. S100 sınıfının üyeleri yüksek dizi ve yapısal homoloji paylaştığından, fiziksel özellikleri benzerdir. Dolayısıyla, S100A12'nin bu saflaştırma yöntemi, E. coli'nin çözünür fraksiyonunda eksprese edilen tüm S100 proteinlerine genel olarak uygulanabilir .
Önceki çalışma, calprotectin gibi S100 proteinlerinin, H. pylori gibi bakteriyel patojenlere karşı antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğunu ve bu aktivitenin çinko bağlanma aktivitesine 25 bağlı olduğunu göstermiştir. AntimikrobikS100A12'nin ial aktivitesi çinkoya da bağımlıdır, ancak bakteriyel büyüme deneylerinde gösterilen büyüme inhibisyonu, kalprotektin gibi diğer S100 ailesinden alınan proteinlere kıyasla büyümeyi inhibe etmek için önemli miktarda S100A12'nin gerekli olduğu ortaya koymaktadır. Bu nedenle, benzer fenotipleri (virülansta büyüme inhibisyonu veya değişiklikleri) elde etmek için calprotectinden daha yüksek konsantrasyonlarda S100A12 kullanılması kritiktir. Bu protokolün gelecekteki uygulamaları, S100A12'nin dayattığı metal ayrıştırma yanıtında bakteriyel gen ekspresyonunda, metabolomik ya da proteomik değişikliklerde küresel değişiklikleri belirlemek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Acknowledgments
Bu araştırma, Gaziler İşleri Kariyer Geliştirme Ödülü 1IK2BX001701, Ulusal Bilimsel Araştırma Vakfı İleri Düzeyde Ulusal Merkezi'nden CTSA ödülü UL1TR000445, Ulusal Bilim Kurumu Ödül Numaraları 1547757 ve 1400969 ve NIH hibe GM05551 tarafından desteklendi. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Transaksiyonel Bilimler Geliştirme Ulusal Merkezi veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S100A12 Expression | |||
| Expression cells | |||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 | |
| Autoinduction medium components | |||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 | |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 | |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 | |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 | |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 | |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 | |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 | |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 | |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 | |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 | |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 | |
| Selection agent | |||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 | |
| S100A12 Purification | |||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 | |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 | |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 | |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE | |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 | |
| H. pylori Culture | |||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 | |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 | |
| Cholesterol (250x) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
References
- Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
- Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).
- Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).
- Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
- Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).
- Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).
- Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).
- Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
- Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).
- Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).
- Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).
- Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).
- Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).
- Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).
- Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).
- Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).
- de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).
- Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).
- Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).
- Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
- Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).
- Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).
- Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).
- Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).
- Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
- Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).
- Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).
