Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

doi: 10.3791/55557 Published: May 13, 2017

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה להביע ולטהר S100A12 (calgranulin C). אנו מתארים פרוטוקול למדידת פעילות אנטי מיקרוביאלית שלו נגד הפתוגן האנושי H. pylori .

Abstract

חלבונים Calgranulin הם מתווכים חשובים של חסינות מולדת הם חברי המעמד S100 של המשפחה EF יד של חלבונים מחייב סידן. כמה חלבונים S100 יש את היכולת לקשור מתכות המעבר עם זיקה גבוהה ביעילות לשלוף אותם מן הפתוג חיידקים פתוגנים בתהליך זה כינה "חסינות תזונתיים". S100A12 (EN-RAGE) מחייב הן אבץ והן נחושת, והוא שופע בתאי חיסון מולדים כגון מקרופאגים ונויטרופילים. אנו מדווחים על שיטה מעודנת לביטוי, העשרה וטיהור של S100A12 בתצורה הפעילה והמתכתבת. ניצול של חלבון זה בצמיחה חיידקים וניתוחי חיוניות מגלה כי S100A12 יש פעילות מיקרוביאלית נגד הפתוגן חיידק , Helicobacter pylori . הפעילות המיקרוביאלית מבוססת על פעילות מחייב אבץ של S100A12, אשר chelates אבץ מזין, ובכך רעב H. pylori אשר דורש אבץ לצמיחה pרוליפרציה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100 חלבונים הם מחלקה של EF יד המשפחה של סידן מחייב חלבונים עם מגוון רחב של פונקציות 1 . הם באים לידי ביטוי באופן רקמות תא ספציפי, לווסת מגוון רחב של פונקציות הסלולר 2 , 3 . ייחודי חלבונים סידן מחייב, חלבונים S100 התערוכה הן פונקציות תאיים תאיים 4 , 5 . בתוך התא, Ca 2 + מחייב גורם לשינוי קונפורמציה החושפת משטח הידרופובי כי מטרות ספציפיות חלבון מחייב שותפים 6 . מנגנון תאיים זה מסדיר תהליכים חשובים כגון התפשטות תאים, התמיינות ואנרגיה מטבוליזם. בסביבה תאית, S100 חלבונים התערוכה שתי פונקציות 7 . באחד מהם, הם פועלים כנזק הנלווה לחלבון המולקולרי (DAMP) ויוצרים פרו-דלקתהתגובה החיסונית אטורי באמצעות אינטראקציה עם קולטנים הכרה דפוס 8 , 9 . בנוסף, כמה חברים של מחלקה S100 חלבון sequester המעבר מתכות, פונקציה המשמשת להרעב פתוגנים חיידקים בתהליך המכונה החסינות התזונתיים 10 , 11 .

S100A12 (הידוע גם בשם calgranulin C ו- EN-RAGE) מתבטאת מאוד מקרופאגים ונויטרופילים ו זוהו כסימן ביולוגי פוטנציאלי למחלות דלקתיות 12 , 13 . בנוסף סידן מחייב באתרי EF-Hand שלה, S100A12 יש שני זיקה גבוהה מתכת מחייב אתרים הממוקם בקצה השני של ממשק dimer 14 , 15 . כל אתר מחייב מורכב משלושה שאריות histidine ושאריות חומצה אחת aspartic והוא יכול chelate אבץ או נחושת <Sup class = "xref"> 16 , 17 . לאחרונה, דיווחנו כי רעב אבץ תלוי S100A12 חשוב בויסות הצמיחה של הליקובקטר פילורי ופעילותם של גורמים ארסתיים דלקתיים 18 .

H. pylori מדביק את הבטן של כמחצית מאוכלוסיית האדם בעולם; מה שהופך אותו ללא ספק לאחד הפתוגנים החיידקים המצליחים ביותר 19 . זיהום עם H. pylori יכול להוביל לתוצאות משמעותיות של מחלת קיבה, כולל גסטריטיס, כיב פפטי ותריסריון, רירית לימפומה לימפומה (MALT), וכן אדנוקרצינומה קיבה פולשנית (סרטן הקיבה). סרטן הקיבה הוא הגורם המוביל למוות שאינו קשור לסרטן בסרטן בעולם, וגורם הסיכון הגדול ביותר הקשור לסרטן הקיבה הוא זיהום ב- H. pylori .

H. pylori נמשכת נישה קיבה למרות robuSt התגובה החיסונית הפתוגן, מדגיש את הצורך בהבנה טובה יותר של מנגנוני החיסון של שליטה זה זיהום חיידקי 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori - דלקת נלווה מאופיינת בחדירה עמוקה של תאים פולימורפונומיים, או נויטרופילים, המפקידים רפרטואר של חלבונים אנטי-מיקרוביאליים, כולל S100A12, באתר ההדבקה 18 , 24 , 25 . במאמץ להבין את הדיאלוג המורכב בין המארח לבין הפתוגן, ביקשנו לחדד את הטכניקה לטהר את S100A12 ולהשתמש בה כדי לחקור את המיקרוביאליות שמשפיעה על הפתוגן הרלוונטי מבחינה רפואית. פרוטוקול להלן מתאר טכניקה משופרת לטיהור S100A12 במצב פעיל ביולוגית שלה; המסוגל לחייב מתכות מזין עם אפיני גבוההTy ו chelating אותם מן הפולש מיקרואורגניזמים. יתר על כן, השיטות להלן מדגישות את התועלת של חלבון זה כמגיב קריטי כדי לחקור את המנגנון שבו מולקולות מולקולות מולדות להגביל את הצמיחה של פתוגנים חיידקיים.

S100A- חלבונים משפחתיים זכו להערכה כקבוצה חשובה של מולקולות מערכת החיסון המולדת אשר משתתפים איתות החיסון וכן ההגנה המארח 27 . המחקר הטוב ביותר של אלה הוא calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin הוא נויטרופיל הקשורים חלבון אשר יוצר heterodimer של S100A8 ו S100A9 יחידות משנה אשר נקשר מתכות המעבר בממשק dimer 31 . Calprotectin הוכח להחזיק שני אתרי מחייב מתכת: אתר 1 יכול לקשור Zn 2 + , Mn 2 + , או Fe 2 + , ואת האתר 2 יכול כץ Zn 2+ 31 , 32 . דיווחים רבים הוכיחו שלקאלפרוקטין יש פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד גורמים שונים כגון Staphylococcus aureus , קנדידה אלביקנס , Acinetobacter baumannii , דלקת ריאות של קלבסילה , Escherichia coli ו- H. pylori , וכי ההשפעות המעכבות נובעות מפעולת הקלציה המתכתית של calprotectin 25 , 28 , חשוב

מחקרים קודמים הראו כי פעילות ה- Calprotectin מפעילה מספר רב של פעילויות על H. pylori, כולל שינוי השומנים מבנה בקרום החיצוני, הדחקה של מערכת הפרשת הטיפוס הרביעי (שהיא גורם ארסי פרו-דלקתני משמעותי בתוך H. pylori ), יצירת היווצרות ביופילם והדחקה H. pylori הצמיחה ואת הכדאיות באופן תלוי מינוןClass = "xref"> 25 , 33 . יתר על כן, בדיקות גנטיות וביוכימיות חשפו את הפעילות האנטיבקטריאלית של קלפרוטקטין כנגד H. pylori נבעה ברובה מיכולתה לקשור אבץ מזין 25 . H. pylori דורש אבץ, כפי שנקבע על ידי מחקר קודם אשר ניצל בינוני מוגדר כימית כדי לוודא את הדרישות micronutrient עבור הפתוגן הזה לגדול ולהתרבות 34 . בנוסף, קלפרוקטין היה שופע מאוד בתוך רקמות נגועות ב H. pylori , והוא קשור לחדירים נויטרופילים, דבר המצביע על כך שהמארח עשוי להעסיק את ה- Calprotectin כאסטרטגיה אנטי-מיקרוביאלית במהלך ההדבקה ודלקת שלאחר מכן , 25 , 35 .

עדויות חדשות מ טכניקות הקרנה proteomics unbiased עולה כי בתנאים בהם מינים חמצן תגובתי בשפע, calprotecפח עובר שינויים לאחר טרנסלוציאציה אשר משנים את האתר מחייב hexa histidine, ובכך מעכב את הפעילות מחייב מתכת של חלבון 36 . ככזה, שיערנו כי חלבונים אחרים של משפחת S100A בין הרפרטואר הרחב של המולקולות הללו עשויים לשמש ככלי עזר-מתכת עזר. בחרנו את S100A12 לצורך מחקר נוסף, משום שהוא לא זוהה במסך הנ"ל לתמורות פוסט-טרנסלציוניות, יש לו את היכולת לקשור אבץ, והוא שופע מאוד ברקמות אנושיות הנגזרות מאנשים של H. pylori- infected.

העבודה שלנו מצביעה על כך ש- S100A12 יכול לעכב את צמיחת ה- H. pylori ואת הכדאיות במינון תלוי במינון G27 של H. pylori , וכי פעילות מיקרוביאלית של חלבון זה יכולה להפוך על ידי תוספת של אבץ מזין עודף. עבודה זו משלימה את העבודה הקודמת שלנו המעידה על פעילות מיקרוביאלית של S100A12 נגד PMSS1 ו- 7.13 זנים של H. pylori , מדגים פעילות אנטיבקטריאלית רחבה נגד מבודדים קליניים רבים זנים מותאמים למעבדה של H. pylori 18 . יחד, תוצאות אלה מאשרות את החשיבות של S100A12 כמנגנון לבקרה על צמיחה וחיידקים בקטריאליים באמצעות חסינות תזונתיים. מחקרים עתידיים על אינטראקציה חשובה זו של חיידק מארח יכולים לכלול ניצול של הפעילות של S100A12 כדי להפחית את נטל החיידקים ברקמות המארחות, או לקבוע את תרומתו של חלבון זה לחיבור החיסון בהקשר של זיהום H. pylori .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. ביטוי של S100A12

  1. המרה המוסמכת BL21 DE3 תאים עם pGEMEX-S100a12 פלסמיד באמצעות תקן סטנדרטי חום ההלם 18 . הוסף 1 עד 5 μL של פלסמיד ל 50 μL של חיידקים בצינור microcentrifuge על הקרח. דגירה במשך 20 דקות.
  2. הלם חום התאים ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
  3. דגירה התאים על הקרח במשך 2 דקות.
  4. הוסף 500 μL של מדיה SOC לתאים. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד בסל"ד 250 על שייקר מסלולית עבור 1 ח.
  5. צלחת 150 μL של התגובה טרנספורמציה על בינוני LB- אגר (בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין). לדגור על 12-16 שעות ב 37 ° C.
  6. בחר מושבה אחת. לחסן 2 מ"ל של LB (בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin).
  7. דגירה עבור 4-6 שעות על 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית (300 סל"ד). OD 600 צריך לקרוא בין 1-3 ספיגת יחידות.
  8. הוסף 500 μL של תרבות Starter ל 50 מ"ל של ZYM-5052 autoinduהתקשורת ction 26 בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אמפיצילין. עבור אוורור הטוב ביותר ביטוי מקסימלי, להשתמש 250 מ"ל מבולבל בקבוק ארלנמאייר. לנער (300 סל"ד) עבור 24 שעות, על 37 מעלות צלזיוס.
  9. העברת ההשעיה חיידקי לצינור צנטריפוגות. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (4 XG, 10 דקות) ב 4 ° C.
  10. למזוג את המדיה, מדגם יומן, ואת הדבק לאחסן חנות ב -80 מעלות צלזיוס. המדגם יציב במשך שנים.

2. טיהור של S100A12 באמצעות כרומטוגרפיה בלחץ נמוך

  1. תאים Resuspend ב 30 מ"ל של 20 מ"מ טריס, pH 8.0.
  2. Sonicate ההשעיה על קרח לתאי lyse. השתמש ~ 20 W פלט, 5 על 5 ו 5 את מחזור 5 דקות.
  3. מעבירים את הפתרון צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה. להבהיר את lysate התא על ידי צנטריפוגה, 20,000 xg במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  4. למזוג את supernatant ולהעביר כוס נקי 100 מ"ל פוליפרופילן. מגניב את הפתרון על ידי הנחת כוס על הקרח. מוסיפים מערבביםR ולאט לאט להוסיף 11.20 גרם של אמוניום סולפט. אפשר פתרון לערבב על קרח במשך 1 שעות נוספות. זה תיצור פתרון 60% של אמוניום גופרתי ו להאיץ את רוב E. חלבונים אנדוגניים. S100A12 יישאר מסיס.
  5. צנטריפוגה הפתרון ב 4 ° C, 20,000 xg במשך 20 דקות כדי גלולה החלבון זירז.
  6. למזוג את supernatant ולהעביר צינורות דיאליזה (MWCO 3,500 kDa). Dialyze נגד 1 L של 20 מ"מ טריס, pH 8.0 ב 4 ° C. לשנות את המאגר דיאליזה פעמיים. אפשר 4 שעות בין השינויים.
  7. אניון חילופי כרומטוגרפיה
    1. בצע כרומטוגרפיה על מערכת לחץ נמוך. קצב זרימה אופייני הוא 1 מ"ל / דקה.
    2. לאזן עמודה 5 מ"ל Sepharose עם 10 מ"ל של 20 מ"מ טריס, pH 8.0.
    3. טען את ~ 40 מ"ל של פתרון S100A12 באמצעות משאבת מדגם (לאסוף את הזרימה דרך).
    4. לשטוף את הטור עם 10 מ"ל של 20 מ"מ טריס, pH 8.
    5. לפתח את העמודה עם שיפוע 0-30% (BuFfer B הוא 20 מ"מ טריס, pH 8.0, 1 M NaCl) על 19 כרכים טור (קורות חיים, 95 מ"ל). איסוף 5 מ"ל שברים.
    6. קח aliquot 10 μL של כל חלק ולנתח באמצעות MES SDS PAGE עם מכתים Coomassie. הפעל ג'ל באמצעות מתח קבוע (20 V / cm) למשך 30 דקות.
    7. בריכת שברים המכילים S100A12. S100A12 פועל ב ~ 10 חלבון kDa על ג'ל denaturing.
    8. מרוכזים שברים ל 5 מ"ל באמצעות מכשיר ultrafiltration (MWCO 10 kDa). צנטריפוגה ב XG 3000 במשך 8 דקות ~. קח את החלק העליון.
  8. כרומטוגרפיה הדרת גודל
    1. לאזן את העמודה S75 עם 1 קורות חיים (120 מ"ל) של 20 מ"מ טריס pH 8, 100 mM NaCl.
    2. להזריק <5 מ"ל של שברים מרוכזים S100A12 (מתוך חילופי יונים כרומטוגרפיה).
    3. לפתח את הטור בקצב זרימה של 1 מ"ל / מ מעל 120 מ"ל. איסוף 5 מ"ל שברים.
    4. קח aliquot 10 μL של כל חלק ולנתח באמצעות SDS PAGE עם מכתים Coomassie. אימות זהות חלבון באמצעותכתם המערבי או ספקטרומטריית מסה (מחושב המסה המולקולארית של יחידת משנה monomeric 10,575.0 דה, נמדד 10575.4 דה).
  9. בריכת שברים
    1. למדוד את ספיגת החלבון 280 באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש במאגר ה- SEC כחסר. מקדם הכחדה מחושב עבור S100A12 homodimer הוא 5960 M -1 ס"מ -1 .
      הערה: תשואות אופייניות הם 35-45 מ"ג של S100A12 לכל 50 מ"ל של התרבות.
    2. Aliquot S100A12 לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל (1 מ"ג / צינור), הקפאה פלאש בחנקן נוזלי לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

3. פעילות אנטי מיקרוביאלית Assays

  1. פס H. pylori זן G27 על לוחות אגר טריפטי אגר בתוספת 5% כבשים דם (צלחות אגר דם). לגדול 2-3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני.
  2. לחסן H. pylori לתוך מרק ברוסלה בתוספת 1x כולסטרול. תרבות מעללילה רועד (250 סל"ד) ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני.
  3. לדלל H. pylori 1:10 לתוך 50% מרק ברוסלה, 50% חיץ calprotectin בתוספת 1x כולסטרול ותרבות בינונית או בתוספת של 100 מיקרומטר אבץ כלוריד פלוס 0, 100 או 1000 מיקרוגרם / מ"ל ​​של S100A12 מטוהרים. תרבות לילה רועד (250 סל"ד) ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני.
  4. למחרת, לבצע דילולים סדרתי צלחת על צלחות אגר דם. אפשר מושבות חיידקים לגדול במשך 2-3 ימים על 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. למנות את המושבה להרכיב יחידות לחשב את הגידול החיידקי בנוכחות או היעדר של S100A12 ו / או אקסוגני אקס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100A12 ביטוי וטיהור

טיהור שלושה שלבים המיוצר ~ 40 מ"ג של רקומביננטי S100A12 מ 50 מ"ל של תרבות חיידקים. הצעד הראשון היה משקעים סולפט אמוניום של חלבונים אנדוגניים E. coli . צעד זה היה ואחריו anion חילופי כרומטוגרפיה ( איור 1 א ). החלבון הוא במעקב על ידי SDS-PAGE מוכתם עם כחול מבריק Coomassie ( איור 1 ב ). השלב האחרון של הליך טיהור מעורב איגום שברים המכילים S100A12 עבור כרומטוגרפיה הדרה גודל המפריד חלבונים על ידי משקל מולקולרי צורה ( איור 2 א ). S100A12 הוא homodimer (92 חומצות אמינו לכל יחידת משנה) ויש לו משקל מולקולרי כולל של כ 21 kDa. שברים שנאספו מן הכרומטוגרפיה ההדרה גודל נותחו על ידי SDS-PAGE ו דמיינו ידי מכתים קומסי ( איור 2 ב

S100A12 מדכא את הצמיחה החיידקית באמצעות פעילות קלץ אבץ

כדי לחקור את פעילות מיקרוביאלית של S100A12, ניתוחי חיוניות בקטריאלי בוצעו באמצעות טכניקות כמותיות התרבות המיקרוביולוגית ( איור 3 ). ספירה של תאים חיידקיים מגלה כי חשיפה 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של S100A12 בנוכחות או היעדר של מקור אקסוגני של אבץ מזין אינו מעכב באופן משמעותי את הכדאיות חיידקים לעומת בקרות ללא הוספת S100A12 (P> 0.05, Anova דרך אחת). עם זאת, חשיפה ל 1000 מיקרוגרם / מ"ל ​​של S100A12 ב בינוני לבדו תוצאות ירידה של פי 69 חיוניות בקטריאלי לעומת המדיום לבדו (P = 0.0193, סטודנט לא מבחן, P> 0.05 דרך אחת ANOVA); תוצאה שהופכה על ידי תוספת של מקור אקסוגני של אבץ מזין (P = 0.023, מבחן הסטודנט של t ). תוצאות אלה deMonstrate פעילות מיקרוביאלית של S100A12 תלוי בפעילות אבץ שלה.

איור 1
איור 1: תא תמוך וטיהור S100A12 ידי כרומטוגרפיה אניון החליפין . ( א ) כרומטוגרמה של טיהור יון חילופי. עקבות של ספיגה UV ב 280 ננומטר מוצג כחול, שיפוע מלח מתואר ורוד, שברים שנאספו מסומנים באדום. ( ב ) SDS PAGE ג'ל של שלבי טיהור. נתיבים: 1) תקן משקל מולקולרי 2) חלק מסיס lysate 3) אמוניום גופרתי גלולה 4) אמוניום סולפט supernatant 5-14) ש שברים כרומטוגרפיה 6-15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 איור 2: גודל chromatography ההדרה תוצאות של טיהור S100A12. ( א ) כרומטוגרמה של תוצאות הדרה גודל. עקבות ספיגת UV ב 280 ננומטר מוצג כחול, שברים שנאספו מסומנים באדום. ( ב ) SDS PAGE ג 'ל של כרומטוגרפיה הדרה גודל. נתיבים: 1) סמן משקל מולקולה 2) עומס מדגם 3-15) שברים 10-21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ניתוח כמותי של התרבות של הכדאיות חיידקים בתגובה לחשיפה קלץ אבץ S100A12 תלוי. חיידקים נחשפו 0, 100, או 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של S100A12 בינוני לבד (אפור ברים), או בינוני בתוספת 100 מיקרומטר אבץ כלוריד(ברים שחורים). חשיפה ל -1,000 מיקרוגרם / מ"ל ​​בהעדר מקור אקסוגני של אבץ מזין תוצאות בעיכוב משמעותי של הכדאיות חיידקי (* P <0.05, מבחן t של התלמיד לעומת בינוני + מצב אבץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול יעיל הן ביטוי וטיהור האדם S100A12 מוצג. מערכת ביטוי קולי קולי הוא הכלי הנפוץ ביותר המשמש לייצור חלבונים רקומביננטי, במיוחד כאשר כמויות מ"ג נדרשים מחקרים ביוכימיים וביופיסיקליים. שיפור המפתח של הנוהל המתואר כאן הוא השימוש של אוטומטי אינדוקציה מדיה 26 אשר מגדילה את התשואה של חלבון מטוהרים על ידי גורם של כמעט שלושים לעומת ביטוי עם תקן Luria-Media מדיה 18 . בנוסף, אוטומטי אינדוקציה התקשורת מאוד מפשט את העבודה ביטוי חלבון. באמצעות התקשורת צמיחה קונבנציונאלי, תרבויות יש לפקח ברציפות, כך סוכן המניע ניתן להוסיף בשלב הצמיחה מעריכי. אין צורך לפקח על פעמים הכפלה בעת שימוש אוטומטי אינדוקציה התקשורת. התרבויות מורשות לגדול לרוויה. במהלך השלבים הראשונים של צמיחה עם אוטומטי inductiעל התקשורת, E. coli משתמש גלוקוז כמקור פחמן. לאחר גלוקוז הוא מדולדל, החיידקים לעבור לקטוז כמקור פחמן אשר גורם ביטוי חלבון 26 . הרכב אוטומטי של אינדוקציה התקשורת הוא מכוון להפליא כדי לאפשר את הצמיחה של תרבויות בצפיפות גבוהה ולכן ביטוי מוגבר של חלבון רקומביננטי. מניסיוננו עם S100A12, מדיה אינדוקציה אוטומטית מגדילה באופן משמעותי את כמות החלבון לידי ביטוי, אולם אנו מזהירים כי זה עשוי להיות תלוי בחלבון צריך להיות מאומת בניסוי.

S100A12 מתבטאת בשבר cytoplasmic של E. coli אשר מציע כי הוא מסיס מקופל היטב. הצעד הראשון של טיהור כרוך הוספת אחוז גבוה של אמוניום סולפט אשר משקעים רבים של אנדוגניים E. חלבונים coli . צעד זה ממנף את היציבות הגבוהה ואת המסיסות של משפחת S100 של חלבונים. S100A12 הוא חומצי בינוני (pI 5.81). כך S100A12 הוא מטוהרים נוספת עם שרף חילופי אניון חזק. השלב האחרון בתהליך הטיהור הוא עמודה כרומטוגרפית של אי-הכללת גודל המבטיחה ש- S100A12 הוא מונודיספריס ודימריק. שלב זה של פרוטוקול חיוני כמו S100A12 הוכח טופס oligomers מסיס 15 וזה לא ידוע מה להשפיע אוליגומריזציה על פעילות מיקרוביאלית שלה. מאז חברי בכיתה S100 לשתף רצף גבוה הומולוגיה מבנית, התכונות הפיזיות שלהם דומים 27 . לפיכך, שיטה זו של טיהור של S100A12 עשוי להיות מיושם באופן רחב על כל חלבונים S100 אשר באים לידי ביטוי בחלק מסיס של E. coli.

עבודה קודמת הוכיחה כי לחלבוני S100, כגון calprotectin, יש פעילות מיקרוביאלית נגד פתוגנים חיידקיים כגון H. pylori, וכי פעילות זו תלויה בפעילות מחייב אבץ 25 . המיקרוIal הפעילות של S100A12 הוא גם תלוי אבץ, אך עיכוב הצמיחה הוכיח מבחני הצמיחה חיידקי מגלה כי באופן משמעותי יותר S100A12 נדרש כדי לעכב את הצמיחה לעומת אחרים S100 משפחה חלבונים כגון calprotectin. לכן, חשוב להשתמש בריכוז גבוה יותר של S100A12 מאשר calprotectin כדי להשיג פנוטיפים דומים (עיכוב צמיחה או שינויים ארסיות). יישומים עתידיים של פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לקבוע את השינויים הגלובליים ביטוי גנטי ביטוי חיידקי, metabolomic, או proteomic בתגובה תגובה המתכת שהוטלו על ידי S100A12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי המחלקה לענייני יוצאי צבא קריירה פרס פיתוח 1IK2BX001701, CTSA פרס UL1TR000445 מהמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, הקרן הלאומית למדע פרסים 1547757 ו 1400969, ומענק NIH GM05551. התוכן שלה הם באחריותם הבלעדית של המחברים ואינם מייצגים בהכרח דעות רשמיות של המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום או המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250x) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
  2. Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (2), e0115828 (2015).
  3. Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290, (18), 11771-11784 (2015).
  4. Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268, (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
  5. Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13, (3), 2893-2917 (2012).
  6. Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76, (2-3), 324-333 (1998).
  7. Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15, (2), 96-109 (2015).
  8. Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
  9. Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41, (4), 821-842 (2011).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14, (2), 218-224 (2010).
  11. Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290, (31), 18991-18998 (2015).
  12. Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12, (6), e1005705 (2016).
  13. Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88, (1), 41-49 (2010).
  14. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, (Pt 5), 859-867 (2003).
  15. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391, (3), 536-551 (2009).
  16. Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60, (6), 581-592 (2003).
  17. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7, (2), 1338-1348 (2016).
  18. Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83, (7), 2944-2956 (2015).
  19. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136, (6), 1863-1873 (2009).
  20. Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32, (3), 264-273 (2001).
  21. Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338, (8776), 1175-1176 (1991).
  22. Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13, (1), 2-9 (2012).
  23. de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42, (2), 219-240 (2013).
  24. Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51, (3), 577-586 (2007).
  25. Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10, (10), e1004450 (2014).
  26. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  27. Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59, (8), 792-801 (2016).
  28. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319, (5865), 962-965 (2008).
  29. Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10, (2), 158-164 (2011).
  30. Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11, (3), 227-239 (2012).
  31. Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (10), 3841-3846 (2013).
  32. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11, (10), 765-771 (2015).
  33. Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6, (6), e01349-e01315 (2015).
  34. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44, (5), 1650-1658 (2006).
  35. Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22, (5), 461-464 (2008).
  36. Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290, (15), 9896-9905 (2015).
הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).More

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter