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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio

Published: June 9, 2017 doi: 10.3791/55561
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,3,4
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology and neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Departments of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Il legame di guanosina trifosfato (GTP) è uno degli eventi più iniziali nell'attivazione del GCR-Receptor (GPCR). Questo protocollo descrive come caratterizzare farmacologicamente interazioni specifiche GPCR-ligand monitorando il legame dell'analogo GTP radio-etichettato, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPyS) Risposta a un ligando di interesse.

Abstract

I recettori G-Proteine-Coupled (GPCRs) sono una grande famiglia di recettori transmembranti che svolgono un ruolo critico nella normale fisiologia cellulare e costituiscono un importante obiettivo farmacologico per molteplici indicazioni, tra cui l'analgesia, la regolazione della pressione arteriosa e il trattamento delle malattie psichiatriche. Su legame vincolante, i GPCR catalizzano l'attivazione delle proteine ​​G intracellulari, stimolando l'incorporazione di guanosina trifosfato (GTP). Le proteine ​​G attivate stimolano quindi i percorsi di segnalazione che provocano risposte cellulari. La segnalazione di GPCR può essere monitorata misurando la incorporazione di GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([ 35 S] GTPγS) in proteine ​​G, di una forma radiolabelata e non idrolizzabile. A differenza di altri metodi che valutano più processi di segnalazione a valle, il binding di [ 35 S] GTPγS misura un evento prossimale nel segnale GPCR e, cosa importante, può distinguere l'agonisTs, antagonisti e agonisti inversi. Il presente protocollo descrive un metodo sensibile e specifico per studiare la segnalazione GPCR utilizzando preparazioni a membrana grezze di un GPCR archetipo, il recettore μ-opioide (MOR1). Anche se esistono approcci alternativi a frazionamento di cellule e tessuti, molti sono cost-prohibitive, noiosi e / o richiedono apparecchiature di laboratorio non standard. Il metodo presente fornisce una procedura semplice che arricchisce le membrane grezze funzionali. Dopo l'isolamento di MOR1, sono state determinate varie proprietà farmacologiche del suo agonista, [D-Ala, N-MePhe, Glyol] -enkephalin (DAMGO) e antagonista, naloxone.

Introduction

I recettori G-Proteine-Coupled (GPCRs) sono una grande famiglia di recettori della superficie cellulare responsabile di una notevole serie di processi fisiologici, tra cui analgesia, olfazione e comportamento 1 . I GPCR agiscono rilevando segnali esterni specifici e successivamente stimolando la segnalazione intracellulare. Esse pertanto rappresentano una giunzione chiave tra gli ambienti esterni e interni di una cella. A causa del ruolo critico che i GPCR svolgono in biologia, sono diventati obiettivi principali sia per la ricerca di base che per la scoperta di droga 2 , 3 .

A differenza di altre famiglie di recettori che legano ligandi discreti, i GPCRs possono legare tipi molto diversi di molecole. Mentre un GPCR può interagire con i peptidi, un altro può sentire i fotoni, le piccole molecole oi ioni 1 , 4 . Mentre i loro ligandi sono diversi, GPCRs sono unificati nel loro architetto globaleUre e funzione. I GPCR individuali sono costituiti da sette proteine ​​transmembrana a-elicoidali con terminali amino terminali extracellulari e terminali carbossilici intracellulari 5 , 6 . I GPCR sono accoppiati a complessi proteici intracellulari di proteine ​​G-eterotrimerici composti da subunità α, β e γ, che mediano diversi percorsi di segnalazione 7 . La subunità G α è una proteina legante nucleotidica guanina che è inattiva quando legata al guanosina difosfato (PIL) e attiva quando legata al guanosina trifosfato (GTP) 8 , 9 . Quando i GPCR legano i loro ligandi, subiscono una modifica conformazionale che consente di dissociare G α da G βγ , consentendo così G α di scambiare il PIL per GTP 7 . Il recettore stesso è fosforilato al suo terminale carbossilico da varie serine / treoneIne chinasi 10 , 11 e internalizzate per attenuare la segnalazione dei recettori 12 , 13 , 14 . Nel frattempo, il monomero G α attivato e il dimettore G βγ procedono ad attivare percorsi di segnalazione distinti 7 . Esistono diverse isoforme di ciascuna subunità di proteina G, e ogni isoforma si rivolge a particolari vie a valle e sistemi secondari di messaggistica. Le principali isoforme G α includono G s , G q , G i / o e G 12-13 . In genere, i GPCR individuali associano una particolare isoforma G α , collegando così uno stimolo esterno ad una risposta cellulare specifica 1 .

Caratterizzare un'interazione GPCR-ligand è fondamentale per comprendere la biologia del recettore. Poiché lo scambio di PIL / GTP è una delle prime vigilanzeNts che segue il binding ligand, monitoraggio del legame GTP può misurare l'attivazione o l'inibizione del GPCR. Analizzare più eventi a valle nella segnalazione GPCR non è spesso quantitativa o stoichiometrica, non può distinguere i full agonisti da quelli parziali e può richiedere costosi reagenti. Inoltre, un aumento del legame GTP alle proteine ​​G α è un evento quasi universale dopo l'attivazione di GPCR, il che significa che la misurazione del legame GTP è un saggio generalmente applicabile per monitorare l'attività della maggior parte dei GPCRs. La misurazione del legame GTP è un approccio semplice e rapido per monitorare la segnalazione GPCR nelle cellule che esprimono l'espressione del recettore di interesse o nel tessuto nativo. Il presente protocollo specifica un test funzionale di legame GTP utilizzando un GPCR archetipo, il recettore μ-opioide (MOR1), per determinare quantitativamente l'attività di un agonista e antagonista sulla segnalazione GPCR.

Questo protocollo indica innanzitutto come isolare le membrane grezze dalle cellule che sovrasta l'espressione MOR1. Nota thaQuesto protocollo non è limitato ai sistemi di sovraespressione e può essere applicato a molte fonti di membrana, compresi i tessuti nativi oi preparati che esprimono più recettori e proteine ​​G. Il protocollo spiega poi come misurare il legame di un analogo GTP radioattivo a queste membrane in risposta a varie concentrazioni di [D-Ala, N-MePhe, Glyol] -enkefalin (DAMGO) o naloxone, agonista e antagonista MOR1, rispettivamente. L'analogo GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPyS) non è idrolizzabile. Questa proprietà è critica perché le subunità G α presentano un'attività intrinseca di GTPase 7 e eliminerebbero il gamma fosfato etichettato su una radiochimica GTP idrolizzabile. Le membrane vengono quindi intrappolate sui filtri in fibra di vetro e lavati, dopo di che il GTP radiomarcato viene quantificato mediante conteggio a scintilla liquida. Molti parametri farmacologici possono essere derivati ​​per caratterizzareL'interazione del recettore-ligando, compresa la risposta half-maximal (EC 50 ) e il coefficiente Hill (n H ) per gli agonisti e la concentrazione inibitore half-maximal (IC50) e la costante di dissociazione di equilibrio (Kb) per gli antagonisti 16,17 , 18 .

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Protocol

1. Espressione di HA-MOR1 ricombinante nelle cellule coltivate

NOTA: seguire tutti i protocolli della cultura cellulare in un cappuccio flusso laminare sterile.

  1. Sterilizzare la cappa di flusso laminare della coltura cellulare con il 70% di etanolo e mantenere la tecnica sterile in tutta la coltura cellulare.
  2. Preparare le cellule embrionali di origine umana 293 (HEK293), media completa di Eagle Medium modificata da Dulbecco (DMEM): DMEM, pH 7,4, integrata con 2 mM L-glutammina, 1% penicillina / streptomicina e 10% siero fetale bovino (FBS ).
  3. Piattare 2,5 x 10 6 cellule HEK293 su una piastra di coltura tissutale da 10 cm in 10 ml di DMEM completo e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 fino al raggiungimento della confluenza del 70-80% (O / N).
    NOTA: Per raccogliere proteine ​​sufficienti per un esperimento completo di legame GTP, piastra almeno 3 x 10 cm di piastre di cellule.
  4. Trasfettare le cellule con HA-MOR1 usando un reagente di transfection di scelta e seguendo le istruzioni del produttore; S orientamenti. Incubare per 36-48 h.
    NOTA: Il cDNA umano MOR-1 (NCBI Sequenza di riferimento: NM_000914.4) è stato un dono generoso di Gavril Pasternak ed è stato clonato in pCMV-HA.

2. Frazionamento cellulare e raccolta delle membrane

  1. Preparare i seguenti buffer di lisi:
    1. Tampone 1: 10 mM 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico (HEPES), pH 7,4; 1 mM etilen glicol-bis (β-aminoetil etere) -N, N, N ', N'-tetraacetico (EGTA); 10% di saccarosio; Cocktail inibitore della proteasi; E 1 mM dithiothreitol (DTT). Aggiungere il DTT fresco al giorno dell'isolamento della membrana.
    2. Tampone 2: 10 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2; E 1 mM DTT. Aggiungere il DTT fresco al giorno dell'isolamento della membrana.
  2. Rimuovere le cellule trasfettate dall'incubatore (fase 1.4), aspirare il mezzo e sciacquare le cellule con 5 ml di freddo fosfato-tamponato Saline (PBS). Aspirare il PBS e il liquido in eccesso dail piatto.
  3. Aggiungere 600 μl di Tampone 1 alle cellule. Utilizzando un raschiatore di celle, scollegare le celle dalla superficie del piatto e pipettare la sospensione cellulare in un tubo da microcentrifuga da 1,6 ml.
  4. Immediatamente congelare il tubo di microcentrifuga in azoto liquido. Una volta che i campioni sono congelati, scongelare i lisati sul ghiaccio o collocarli a -80 ° C per conservare a lungo termine.
  5. Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4 con tutte le piastre delle celle.
  6. Una volta che i lisati hanno scongelato, utilizzare un omogenizzatore a micro-tubo a singolo impulso per aprire le cellule. Impulsi l'omogeneizzatore 3-5 volte per 10 s, ponendo il tubo sul ghiaccio per 30 s tra impulsi.
    1. Raccogliere 20 μL come frazione di cellule intere.
  7. Centrifugare il campione rimanente per 10 min a 1.000 xg e 4 ° C. Raccogliere il surnatante e collocare in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,6 ml sul ghiaccio.
  8. Resuspendere il pellet in 100 μl di Tampone 1 e reomomogenizzare con un pestello. Impara l'homoGener 3-5 volte per 5 s, ponendo il tubo sul ghiaccio per 30 s tra impulsi.
    1. Centrifugare il campione una seconda volta per 10 min a 1.000 xg e 4 ° C. Combinare il supernatante con il surnatante dal punto 2.7.
      NOTA: il pellet rimanente contiene proteine ​​nucleari e di membrana.
  9. Centrifugare i supernatanti combinati per 20 minuti a 11.000 xg e 4 ° C. Separare il supernatante (la frazione citosolica) in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,6 ml.
  10. Resuspendere il pellet in 200 μl di Tampone 2. Homogenizzare il pellet triturandolo 3-5 volte. Centrifugare il campione per 20 minuti a 21.100 xg e 4 ° C. Aspirare il surnatante. Resuspendere il pellet contenente la frazione della membrana grezzo in 50 μl di Tampone 2.
  11. Procedere immediatamente agli esperimenti di legame GTPγS (sezione 3) o snap-freeze in azoto liquido e conservare a -80 ° C.

3. [ 35 S] GTPγS Binding NOTA: Utilizzare il protocollo di sicurezza radiochimico standard quando si utilizza [ 35 S] GTPγS e quando conduce esperimenti di binding di [ 35 S] GTPγS. Indossare guanti protettivi e un cappotto di laboratorio in qualsiasi momento. Controllare il materiale di imballaggio per perdite o crepe. Smaltire i rifiuti e reagenti in eccesso secondo protocolli istituzionali.

  1. Preparare un buffer di rilascio incompleto (IBB) mescolando 50 mM HEPES, pH 7,4; 5 mM MgCl2; 100 mM NaCl; E 1 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA) in acqua distillata.
  2. Diluire il titolo [ 35 S] GTPγS a 50 nM in 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 10 mM DTT. Formare aliquote da 500 μL e conservarle a -80 ° C. Utilizzare solo una aliquota appena scongelata immediatamente prima di iniziare l'esperimento. Scongelare le aliquote sul ghiaccio.
  3. Preparare GTPγS non marcato da etanolo, sciogliendo 1 mg di polvere di GTPγS in 177,62 μl di acqua pura per una concentrazione di 10 mM. Crea aliquote da 10 μl e li memorizza-20 ° C.
  4. Preparare il buffer di rilascio completo (CBB) completando IBB per includere una concentrazione finale di 1 mM DTT, 0,1% (wt / vol) albumina bovina serba (BSA), 10 μM PIL e 0,1 nM [ 35 S] GTPγS.
    NOTA: la CBB ora contiene GTP radiomarcato. Prendere opportune precauzioni di sicurezza durante il lavoro con soluzioni radioattive.
  5. Sciogliere la frazione della membrana dal punto 2.11 sul ghiaccio.
  6. Quantificare la concentrazione proteica della frazione della membrana mediante un test di proteina Bradford utilizzando uno spettrofotometro a 595 nm.
    1. Preparare una serie di diluizioni di standard proteici BSA con il tampone 2, alla concentrazione finale di 0, 250, 500, 750, 1500, 2500 e 5.000 μg / mL.
    2. Aggiungere 2 μL di ciascuna norma o membrana a 1 ml di reagente Bradford in una cuvetta. Mescolare accuratamente vorticando.
    3. Regolare lo spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 595 nm e in bianco utilizzando la cuvetta con 0 μg / mL proteina.
    4. Attendi 5 min e rCiascuno dei campioni e ciascuno dei campioni ad una lunghezza d'onda di 595 nm.
    5. Tracciare l'assorbanza degli standard rispetto alla concentrazione. Utilizzando la legge Beer-Lambert (A = εcl, dove ε = coefficiente di estinzione, l = lunghezza della cuvetta e c = concentrazione), calcolare la concentrazione dei campioni di membrana.
  7. Diluire le frazioni di membrana ad una concentrazione di 100 μg di proteine ​​/ mL in IBB.
    NOTA: Un piatto da 10 cm di cellule HEK293 produce tipicamente tra 1 e 3 mg di proteine ​​/ ml.
  8. Preparare le seguenti condizioni sperimentali in singoli tubi di microcentrifuga da 1,6 ml: una serie di diluizione ligandi, una condizione di attività basale per misurare il legame GTP basale e una condizione non vincolante per misurare il legame non specifico di GTP.
    1. Per la serie di diluizione ligandi, preparare una serie di diluizione del ligando di interesse in un volume finale di 100 μL di CBB. Preparare la serie di ligandi a 2x il concentrato finale desideratoons. Spazio le concentrazioni del ligando per coprire adeguatamente una gamma di risposte.
      1. Per analizzare l'effetto di DAMGO sul legame GTP attraverso MOR1, preparare DAMGO diluizioni di 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM e 2 pM in CBB Volume: 100 μL).
        NOTA: ad esempio, se il ligando di interesse ha un valore EC 50 previsto di 10 μM, preparare le diluizioni di ligandi di 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM e 2 mM. Queste cinque condizioni coprono un'ampia gamma di concentrazioni e sono 2x la concentrazione desiderata per il dosaggio.
    2. Per il legame basale, preparare un tubo solo con 100 μL di CBB.
    3. Per un legame non specifico, preparare un tubo con 99 μL di CBB integrato con 1 μL di 2 mM GTPγS non-radioterminato.
  9. Aggiungere 100 μL della soluzione di membrana diluita (punto 3.7) ad ogni condizione sperimentale.
  10. Incubare le membrane con i vari esperimentiIn 1.6 ml di microcentrifuga per 30 minuti a 25 ° C in un termomexer o su un agitatore orbitale.

4. Filtrazione a membrana

  1. Preparare il tampone di lavaggio combinando 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 5 mM MgCl2; E 50 mM NaCl in acqua distillata.
  2. Prelevare i filtri in fibra di vetro in acqua per 10 min.
    NOTA: I filtri hanno una porosità di 1 μm, un diametro di 2,1 cm e uno spessore di 675 μm.
  3. Rimuovere i campioni dal termomexer o dagli agitatori orbitali (passo 3.10). Inserire brevemente i campioni per 5 s per raccogliere ogni campione nella parte inferiore del tubo.
  4. Rimuovere il coperchio dell'apparecchio di filtrazione a vuoto. Posare i filtri presoccitati sui porti di vuoto dell'apparato. Reinserire il coperchio dell'apparecchio per formare una guarnizione a vuoto. Accendere il vuoto.
  5. Pipettare 195 μL di ogni condizione sperimentale di 200 μL su filtri per ridurre al minimo l'errore dall'assorbimento alle pareti del tubo e / o da pipettating.
  6. Lavare i filtri tre volte con 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato.

5. Conteggio liquido scintillante

  1. Posizionare 5 ml di flaconcini di scintillazione in un rack di conteggio. Aggiungere 5 ml di liquido di scintillazione a ciascuna fiala.
  2. Spegnere il vuoto (passo 4.4). Rimuovere il coperchio dell'apparecchio di filtrazione a vuoto. Usando le pinzette, raccogliete i filtri dalle porte di vuoto dell'apparecchiatura di filtrazione e lasciate cadere ogni filtro in un singolo flaconcino da 5 ml di scintillazione.
  3. Preparare una fiala con 195 μL di CBB per determinare il segnale massimo.
  4. Bloccare ogni fiala in modo sicuro. Incubare le fiale su un agitatore orbitale a 25 ° C per 10 min.
  5. Accendere il contatore di scintillazione. Programmare il contatore di scintillazione per misurare l'emissione di isotopi da 35 S per 5 min per campione utilizzando il programma di scintillazione standard associato.
  6. Premere "Start" per prendere un conteggio.
  7. Al termine del conteggio, dispensare il flaconcino contatoCome rifiuti pericolosi.

6. Analisi dei dati

  1. Inserire i dati nelle statistiche e nel software di analisi.
    1. Sottrai il legame non specifico da ciascuna delle altre misurazioni per determinare il legame specifico.
      NOTA: Il grado di legame non specifico è determinato dal campione incubato con GTPyS non radiolabelled (fase 3.8.3).
    2. Aprire le statistiche e il software di analisi e selezionare una voce del set di dati XY.
    3. Inserisci i dati specifici di binding degli esperimenti di binding di [ 35 S] GTPγS in una tabella dati nel software delle statistiche e dell'analisi. Immettere le concentrazioni agoniste, come concentrazioni molari, nella colonna "X". Immettere i conteggi 35 S associati come valori "Y".
  2. Trasformare i dati.
    1. Converti i valori X nel loro rispettivo logaritmo facendo clic su "Analizza". Selezionare "Trasforma" dal built-iN analizza.
    2. All'interno della finestra di dialogo "Trasforma", selezionare "Trasforma valori X utilizzando" e selezionare la funzione "X = log (X)". Scegliere di creare un nuovo grafico dei risultati.
    3. Fai clic su "OK".
  3. Normalizzare i valori Y.
    1. Con i risultati trasformati visualizzati, fai clic su "Analizza". Seleziona "Normalizza" dalle analisi incorporate.
    2. All'interno della finestra di dialogo "Normalizza", selezionare il pulsante di opzione per definire il 0% come "il valore più piccolo in ogni set di dati" e il 100% come "il valore più grande di ciascun set di dati". Seleziona la casella per presentare i risultati come percentuali. Seleziona la casella per creare un nuovo grafico dei risultati.
    3. Fai clic su "OK".
  4. Adattare le curve di regressione non lineare ai dati grafici. Esegui un'analisi di regressione non lineare.
    1. Con i risultati normalizzati visualizzati, fare clic su "Analizza". Dalle analisi integrate, Selezionare "Regressione non lineare (curva fit)".
    2. Se si esamina un agonista, selezionare "log (agonist) vs risposta normalizzata - pendenza variabile" dalla finestra di dialogo.
    3. Se indagando su un antagonista, "selezionare log (antagonista) contro risposta normalizzata - pendenza variabile" dalla finestra di dialogo.
    4. Fai clic su "OK".
  5. Rivedere il grafico e i risultati per assicurare che l'adattamento ei dati siano ragionevoli. Assicurarsi che la regressione corrisponda al modello generale dei dati elaborati e che i residui non siano così grandi che rendono piatta la curva dose-risposta.
    NOTA: Il software riassume i risultati della regressione non lineare e dettaglierà la concentrazione che determina la risposta half-maximal (EC 50 ), il coefficiente Hill (n H ) e la concentrazione inibitoria half-maximal (IC 50 ).
  6. Deriva la potenza del parametro agonista / antagonista.
    1. Deriva l'equatore agonistaCostanti di dissociazione del ilibrio (K b ) da uno dei seguenti esperimenti 16 , 17 , 18
      1. Valutare lo spostamento della risposta dose-risposta di un agonista in concorrenza con una concentrazione fissa di antagonista. Qui, EC 50 '= EC 50 (1 + [antagonista] / antagonista Kb ), dove EC 50 ' è la destra EC 50 sposta.
      2. Valutare [ 35 S] GTPγS legame con varie concentrazioni di antagonisti in concorrenza con una concentrazione fissa di agonista. Qui Kb = IC50 / (2 + (agonista / agonista EC 50 ) n ) 1 / n - 1, dove n è il coefficiente Hill dell'agonista.
  7. A seconda della variabilità dei dati, ripetere l'esperimento (fasi 3.8-5.6) per ciascun ligando circa 3-5 volte e mediare i risultati utilizzando una statistica e analisi softwsiamo.

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Representative Results

La frazionamento cellulare può essere usata per isolare e arricchire le proteine ​​associate alle membrane dalle proteine ​​citosoliche e nucleari. La figura 1 è una macchia Western che dimostra il contenuto delle tre frazioni primarie che possono essere raccolte durante il processo di frazionamento subcellulare. In particolare, la figura 1 mostra che la frazionamento separa separatamente le proteine ​​della membrana ( ad esempio Na + / K + ATPasi, proteine ​​disolfuro isomerasi (PDI) e HA-MOR1) dall'istone H2B e gliceraldehide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), proteine ​​nucleari e proteine ​​citosoliche, rispettivamente. Inoltre, la figura 1 mostra l'arricchimento delle proteine ​​(corsia 1 rispetto alla corsia 4) nelle rispettive frazioni subcellulari a seguito della frazionamento. Una macchia rappresentativa Ponceau dimostra un carico uguale di proteine ​​in ciascuna frazione. È importante notare che questo fractiIl protocollo di onazione non distingue tra le diverse membrane cellulari. PDI è generalmente localizzato al reticolo endoplasmatico (ER), mentre Na + / K + ATPasi è prevalentemente alla membrana plasmatica. Tuttavia, entrambe le proteine ​​sono presenti nella frazione finale della membrana grezzo ( figura 1 , corsia 4). Inoltre, mentre questo protocollo separa robusteamente le proteine ​​nucleari dalla frazione citosolica e finale della membrana ( figura 1 , corsie 2-4), la frazione arricchita per le proteine ​​nucleari contiene alcune proteine ​​della membrana ( figura 1 , corsia 2), forse dal ER.

Molti parametri farmacologici possono essere derivati ​​per caratterizzare un'interazione GPCR-ligandi mediante esperimenti di legame GTP ( Tabella 1 ). Ad esempio, la risposta half-maximal (EC 50 ) e il coefficiente Hill (n H ) di un agonista possono essere ottenuti monitorando il legame GTP inRisposta a diverse dosi dell'agonista. La Figura 3A mostra il legame GTP legato alla dose a MOR1 dopo il trattamento DAMGO. Quando i dati sono adatti a una regressione non lineare a quattro parametri, la composizione descrive un'interazione recettore-ligando con una EC 50 di 185 ± 23 nM e un coefficiente Hill di 0,46 ± 0,06. La curva di legame GTP poco profonda osservata dopo il trattamento DAMGO suggerisce una cooperatività negativa tra DAMGO e MOR1. Questo metodo può anche identificare e descrivere la farmacologia di un antagonista. Come illustra la figura 3A e B , naloxone è un antagonista MOR1. La potenza agonista (K b ) di nalossone, 97 ± 20 nM, è stata determinata variando la concentrazione di naloxone in concorrenza con una concentrazione fissa di DAMGO ( Figura 3A ). Naloxone presentava un coefficiente Hill di 0,88 ± 0,06, suggerendo un legame indipendente tra naloxone e MOR1. Se l'acDi un ligando è sconosciuto, questo dosaggio può discriminare tra un agonista, un antagonista e un agonista inverso. Se il legante è un agonista, ci sarebbe un aumento del legame GTP, come nella Figura 3A , dopo l'applicazione DAMGO. Se il ligando è un agonista inverso, ci sarebbe una diminuzione del legame di GTP rispetto al legame basale. Se il ligando è un antagonista, non esiste alcun effetto sul trattamento con il solo ligando. Se applicato in concomitanza con un agonista, un antagonista inibirà la capacità dell'agonista di stimolare il legame GTP. La figura 3A illustra l'attività antagonista di nalossone contro l'agonista DAMGO.

Figura 1
Figura 1: La frazionazione cellulare separa le proteine ​​associate a membrana, nucleari e citosoliche. ( In alto ) La corsia 1 rappresenta laProteine ​​presenti in tutta la cellula. La corsia 2 contiene proteine ​​nucleari e membrane associate durante le prime fasi di centrifugazione. La corsia 3 è la frazione citosolica separata dopo 20 minuti di centrifugazione a 11.000 x g. La corsia 4 contiene una frazione di membrana grezzo adatta per esperimenti di legame [ 35 S] GTPγS. ( In basso ) La macchia Ponceau di una membrana occidentale dimostra la carica delle proteine ​​per ogni frazione cellulare. I seguenti anticorpi sono stati utilizzati per l'immunoblotting: mouse anti-Na + / K + -ATPase (1: 1,000), mouse anti-GAPDH (1: 5,000), anti-H2B mouse (1: 2,500), anti- : 1.000) e anti-HA di ratto (1: 2.000). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
figura 2: Diagramma di flusso che descrive la frazionazione e la procedura di binding [ 35 S] GTPγS. In primo luogo, trasfettare le cellule per esprimere il GPCR di interesse. Dopo 48 h, raccogliete e frazionate le cellule per isolare il recettore (rosso) e le proteine ​​G associate (verde = G α , viola = G β e arancio = G γ ). Per eseguire esperimenti di binding GTP, aggiungere [ 35 S] GTPγS e incubare le membrane con il ligando di interesse. Per misurare l'attività della proteina G, legare le membrane a un filtro per lavare via qualsiasi radiochimica non legata e quindi quantificare il legame [ 35 S] GTPγS mediante conteggio a scintilla liquida. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Agonismo aNd Antagonismo nei μ-opioidi Receptors Definito da [ 35 S] GTPγS. ( A ) [ 35 S] GTPγS curva di risposta dose a solo DAMGO (blu) o naloxone in concorrenza con 2,5 μM DAMGO (verde). [ 35 S] Il legame di GTPγS è stato normalizzato alla stimolazione massima in ciascun esperimento ed è stato espresso in percentuale. I punti mostrati sono la media delle determinazioni triplicate e sono espressa come media ± SEM ( B ) Antagonismo di DAMGO-stimolato [ 35 S] GTPγS Legame da naloxone. [ 35 S] GTPγS L'associazione è stata quantificata dopo l'aggiunta di solo naloxone (100 μM), solo DAMGO (10 μM) o DAMGO (10 μM) in concorrenza con naloxone (100 μM). I risultati sono espressi come la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. Fare clic su luiPer visualizzare una versione più grande di questa figura.

ligand EC 50 o IC 50 (nM) N H K b (nM)
DAMGO 185 ± 23 0,46 ± 0,06
naloxone 420 ± 87 0,88 ± 0,06 97 ± 20

Tabella 1: Parametri farmacologici di attività DAMGO e Naloxone nei Receptori μ-opioidi. La risposta half-maximal (EC 50 ) e il coefficiente Hill (n H ) per DAMGO sono state derivate da binding di [ 35 S] GTPγS in risposta a dosi variabili di DAMGO. La concentrazione inibitore semi-massimale(IC 50 ) e la costante di dissociazione di equilibrio (Kb) per il nalossone sono state determinate dall'effetto della concorrenza tra naloxone e 2.5 μM DAMGO sul legame di [ 35 S] GTPγS. I risultati sono espressi come la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti.

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Discussion

Il presente protocollo descrive due metodi separati ma complementari: un approccio semplice per frazionare cellule e tessuti in compartimenti larghi ma distinti e un mezzo per indagare la segnalazione di GPCR misurando il legame di [ 35 S] GTPγS.

La frazionamento cellulare efficace ha una vasta gamma di applicazioni, che vanno dall'estrazione e dall'arricchimento delle proteine, alla valutazione della localizzazione subcellulare delle proteine, allo studio della farmacologia dei recettori. Anche se esistono approcci alternativi per frazionamento di cellule e tessuti, il protocollo qui presentato è relativamente più economico, più veloce e più semplice. A differenza dei metodi più consolidati, tuttavia, questo metodo non è in grado di separare separatamente le proteine ​​associate alla membrana plasmatica da altri compartimenti membranosi, come endosomi o ER. Va anche notato che mentre il protocollo sopra usa un sistema di sovraespressione transitorio per generare membrane cellulari contenenti il ​​GPCR diInteresse, questo protocollo è compatibile con sistemi di sovraespressione stabili, nonché con tessuto animale o umano 19 .

La preparazione del campione è fondamentale per massimizzare la resa e la purezza delle frazioni. È particolarmente importante assicurare un'omogeneizzazione completa e minimizzare i tempi di transizione tra le fasi di centrifugazione. Utilizzando un homogenizzatore / pestello di pellet per interrompere completamente la membrana cellulare aumenta significativamente la resa della membrana grezzo nella frazione cellulare finale. Se la resa della membrana è troppo bassa, le due soluzioni più semplici sarebbero quella di scalare la coltura cellulare iniziale e / o di omogeneizzare il pellet di cellule ancora qualche volta. Se le frazioni individuali mostrano un elevato grado di impurità, ridurre i tempi di transizione tra centrifugazione e separazione. Non lasciare che i campioni si posizionino dopo la centrifugazione, poiché le proteine ​​possono diffondersi nel campione e ridurre la purezza della frazione.

Filtro-basato [ 35 S] GTPγS è un metodo rapido e quantitativo per misurare l'attivazione delle proteine ​​G usando il recettore associato. La misurazione del legame GTP consente una misurazione più quantitativa dell'attività GPCR rispetto a quanto generalmente è possibile durante il monitoraggio dei processi a valle. Tuttavia, ci sono due limitazioni critiche al metodo descritto qui. Soprattutto, la quantitazione [ 35 S] GTPγS basata su filtrazione non è ugualmente fattibile con tutte le isoforme 20 , 21 di G. In generale, questo metodo è limitato a G i / o- collegati GPCR come MOR1 22 . I recettori G s e G q tendono ad essere meno sensibili. Ciò è probabilmente dovuto alla combinazione dell'abbondanza inferiore di G s / G q e del loro tasso di cambio nucleotidico relativamente più lento, rendendo difficile distinguere il legame [ 35 S] GTPγS rispetto allo sfondo. Questa limitazione è stata affrontata prima E dove si usano le tecniche di cattura di anticorpi G-proteine 20 . Alcuni gruppi hanno scoperto che l'eliminazione del PIL dalla reazione migliora il rapporto segnale-rumore per i recettori G s- o G q- collegati 23 . La seconda limitazione è la sensibilità alla membrana agli agonisti lipofili o ai tensioattivi. Gli esami [ 35 S] GTPγS richiedono complessi funzionali del recettore-G-proteina e l'aggiunta di molecole lipofili nel sistema di reazione può interrompere la struttura delle membrane o di questi complessi. Se questa è una preoccupazione potenziale, può essere vantaggioso verificare se il reagente di interesse interferisce con il legame di [ 35 S] GTPγS in un sistema già ben caratterizzato, come nella stimolazione MOR1 mediata da DAMGO. Altre condizioni da considerare per ottimizzare includono il pH del buffer di legame, le concentrazioni di Mg 2+ e NaCl, la concentrazione proteica e il tempo di incubazione 23 ,Ef "> 24.

Questo protocollo si è concentrato su un GPCR ben caratterizzato, i farmaci MOR1 e quelli ben caratterizzati, DAMGO (agonista) e naloxone (antagonista), che agiscono sulla MOR1. Tuttavia, uno dei vantaggi di questa tecnica è che può essere utilizzato per caratterizzare i ligandi sconosciuti come agonisti, antagonisti o agonisti inversi, a seconda di come il legante modula il legame GTP. Durante la progettazione degli esperimenti, è fondamentale l'utilizzo di una gamma di concentrazioni del legante di interesse e di essere consapevoli dell'intervallo di risultati: gli agonisti causano un aumento del legame GTP rispetto alla linea di base, gli agonisti inversori causeranno una diminuzione del legame GTP rispetto a Baseline, e gli antagonisti avranno poco a nessun effetto quando aggiunti in isolamento sul binding basale di GTP.

In sintesi, questo protocollo descrive una tecnica per eseguire la frazionamento subcellulare, raccogliere preparazioni a membrana grezzo e indagare l'attivazione di GPCR misurando [ 35 S] GTPγS legame. Queste tecniche possono essere facilmente adattate a una varietà di modelli di cellule e tessuti per studiare la farmacologia di una delle più importanti famiglie di recettori.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da National Institutes of Health grant DA-000266 e dal programma di addestramento del medico scientifico T32 (CV, NWZ e PCS). Gli autori vorrebbero anche riconoscere somersault18: 24 (somersault1824.com) per la Biblioteca di Scienza e Illustrazioni Mediche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine Thermo Fisher Scientific 10313021 Warm in a 37°C water bath before use
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081 Warm in a 37°C water bath before use
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Warm in a 37°C water bath before use
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070 Warm in a 37°C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 16000044 Warm in a 37°C water bath before use
Cell culture 10 cm plate Sigma-Aldrich CLS430167
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
1.6 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) Thermo Fisher Scientific BP152-1
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 2900
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DO632
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific BP358-1
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028-1
Pellet pestles motor Sigma-Aldrich Z359971
Pestles Bel Art F19923-0001
Bovine serum albumin (BSA) Affymetrix 10857
[35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS)  Perkin Elmer NEG030H
nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS)  Sigma-Aldrich 89378
guanosine diphosphate (GDP) Sigma-Aldrich 51060
Bradford reagent Bio-Rad 5000006
UV/VIS spectrophotometer Beckman Coulter DU640
spectrophotometer cuvettes USA Scientific 9090-0460
orbital shaker Thermo Fisher Scientific 2314
thermomixer Eppendorf 535027903
glass fiber filters  GE Healthcare Life Sciences 1821-021
vacuum filtration apparatus Millipore Corporation XX2702550
desktop microcentrifuge Eppendorf 65717
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
scintillation fluid  Ecoscint A LS-273
scintillation counter vials Beckman Coulter 592690
scintillation vial lids Beckman Coulter 592928
Prism 6 GraphPad Software PRISM 6
ATP1A1 antibody Developmental Studies Hybridoma a6F 1:1000 in 3% BSA
GAPDH antibody EMD Millipore CB1001 1:5000 in 3% BSA
H2B antibody Cell Signaling 2934S 1:2500 in 3% BSA
PDI antibody Cell Signaling 3501S 1:1000 in 3% BSA
HA antibody Roche 11867423001 1:2000 in 3% BSA

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References

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Biochimica Edizione 124 Frazionamento cellulare preparazione delle membrane GPCR agonista antagonista legame GTPγS farmacologia μ-opioid receptor
Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio
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Vasavda, C., Zaccor, N. W., Scherer, … More

Vasavda, C., Zaccor, N. W., Scherer, P. C., Sumner, C. J., Snyder, S. H. Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding. J. Vis. Exp. (124), e55561, doi:10.3791/55561 (2017).

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