我々は、抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザAおよびBウイルスの感受性を評価するために表現型の蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイの使用を記載しています。
ノイラミニダーゼ(NA)阻害剤は、現在、循環株に対して有効であるインフルエンザの治療および予防のために承認された抗ウイルスの唯一のクラスです。季節性インフルエンザの治療におけるそれらの使用に加えて、NA阻害剤は、パンデミックのイベントで使用するための多くの国で備蓄されています。抗ウイルス薬のこのクラスにインフルエンザウイルスの循環の感受性を監視することが重要です。そこNA阻害剤に対するインフルエンザウイルスの感受性を評価するために使用できるアッセイの異なるタイプがあるが、蛍光基質又は化学発光基質のいずれかを使用して、酵素阻害アッセイは、最も広く使用され、推奨されています。このプロトコルはNA阻害剤にインフルエンザウイルスの感受性を評価するための蛍光ベースのアッセイの使用を記載しています。 (4-メチル)-α-D- N -acetylneuraminic酸(MUNANA -アッセイは、2 '切断NA酵素に基づいています)蛍光生成物、4-メチルウンベリフェロン(4-MU)を放出する基板。したがって、インフルエンザウイルスNA上のNA阻害剤の阻害効果をIC 50値として与えられたNA活性の50%を減少させるために必要とされるNA阻害剤の濃度に基づいて決定されます。
赤血球凝集素(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)はインフルエンザA及びBウイルスの二つの主要な表面糖タンパク質です。 NAは細胞表面1上にガラクトースからシアル酸を切断することによってウイルスを放出しながら、HAは、細胞表面糖タンパク質または糖脂質のシアル酸-ガラクトースに結合します。 NA阻害剤は、合理的にすることにより、ウイルス子孫の放出と拡散を防止すること、NAの酵素活性部位にしっかりと結合するように設計されたインフルエンザウイルス薬のクラスです。オセルタミビルおよびザナミビルはインフルエンザの治療および予防のために、世界中の多くの国で承認された2つのNA阻害剤です。近年では、二つの追加NA阻害剤、ペラミビルとラニナミビルは、国の限られた数での使用が承認されています。 NA阻害剤に対する感受性と耐性を付与する変異を同定するためのインフルエンザウイルスのスクリーニングはeffectivを決定し、監視に重要です抗ウイルス薬のこのクラスのeness。
最後の16年間で、蛍光ベースのNA阻害アッセイは、インフルエンザウイルスの循環の中で、抗ウイルス感受性の変化傾向を監視するために参考とインフルエンザ研究のためのWHO協力センター、メルボルン(メルボルンWHOCCRRI)で、日常的に行われています。毎年、2,000人以上のインフルエンザウイルスは、抗ウイルス感受性について試験されています。 2007-2008北半球のインフルエンザシーズンの間、前者季節性A(H1N1)ウイルスの数の急増があったが、ほとんどのインフルエンザシーズンでは、ウイルスの> 98%が、4つのすべてのNA阻害剤2、3、4に感受性でありますそれは、オセルタミビル5に対する感受性を減少させました。 NAのアミノ酸置換H275Yを含んこのグループのウイルスは、オセルタミビルinappropriを作り、2008年末までに世界の残りの部分に広がりますこのウイルスの治療のために世界的に食べました。広大な現在のインフルエンザB循環の大部分、インフルエンザA(H3N2)、インフルエンザA(H1N1)pdm09株はオセルタミビルに感受性である、縮小オセルタミビルを与えるNAのアミノ酸置換H275Yを含むA(H1N1)pdm09変異体のもののコミュニティクラスタとペラミビルの感受性は、世界6、7のさまざまな部分で報告されています。
そのため、十分に高いウイルス力価の必要性、(動物の鼻洗浄を含む)の臨床検体は、前の抗ウイルス感受性試験に細胞培養や発育鶏卵のいずれかで継代しなければなりません。この資料に記載NA阻害アッセイは、3つのセクションに分けることができます。
特定の蛍光光度計で蛍光生成物の4-メチルウンベリフェロン(4-MU)のための直線範囲を決定します
蛍光光度計の間の固有の差異に、トン彼蛍光最終生成物、4-MU、相対蛍光単位(RFU)のための線形範囲は、確立される必要があります。 4-MUのための線形範囲が確立されると、最適な目標信号が選択され、インフルエンザウイルスの濃度はNA活性アッセイで調整されます。特定の蛍光光度計のために完了したら、これを繰り返すことする必要はありません。
ウイルスのNA活性を測定します
(4-メチル)-α-D- N -acetylneuraminic酸(MUNANA)基板連続希釈するウイルス- NA活性アッセイは、2 'の添加を伴う単純なアッセイです。 NAによってMUNANAの切断から発生する蛍光最終生成物4-MUの量は、蛍光光度計を用いて測定されます。 NA阻害アッセイで使用するための適切なウイルス希釈は、ウイルスの希釈に対して蛍光単位をプロットすることによって選択されます。生成シグモイド曲線から、直線部の中間点は、に対応しなければなりません蛍光の4-MUの線形範囲は、セクション1で決定され、セクション3で使用されるウイルスの適切な濃度を通知します。
NA阻害アッセイを使用してNA阻害剤に対するウイルスの感受性を評価します
特定のNA阻害剤に対するウイルスの感受性を評価するために、セクション2で決定された希釈でウイルスは、NA阻害剤濃度の範囲と共にインキュベートします。 MUNANAとのその後のインキュベーションの後、阻害されていないウイルスによって生成された4-MUの蛍光によってRFUにおいて測定されます。ウイルスのNA酵素活性に対するNA阻害剤の阻害効果をIC 50値として与えられたNA活性を50%減少させるのに必要なNA阻害剤濃度、に従って計算されます。
NA阻害剤に対するインフルエンザウイルス感受性のグローバルなモニタリングは、現在、蛍光または化学発光NA阻害アッセイ11、12のいずれかを使用して実験室の数で行われています。蛍光アッセイ、化学発光アッセイよりも一般的に使用されます。両方のアッセイは、堅牢かつ再現性であるが、蛍光ベースのアッセイから得られたIC 50値は、13難しい2つのアッセイからのデータの直接比較を行う、しばしば化学発光ベースのアッセイよりも高いです。同じプロトコルを使用して、ある研究室から生成されたデータは、他の異なっていてもよいです。そのための研究室との間にこれらの変動により、インフルエンザ抗ウイルス感受性のサーベイランスに関するWHO作業部会は、研究室間の比較を支援するためのガイドラインを作成しました。むしろ、本ガイドラインの使用絶対IC 50値を比較するよりも中央値は、それぞれの特定の実験室で試験NIインフルエンザウイルスのIC 50のIC 50倍の差に基づいて、SA比較。 5つの協力センターからのデータを比較する能力は、グローバルインフルエンザウイルス感受性データ2、3、4年間出版物をもたらしました。パブリックドメインのインフルエンザ感受性大量のデータの可用性は、研究者が自分の研究室で生成されたもので、これらの研究からIC 50のデータを比較することができます。
同様の概念を採用し、他のNA阻害アッセイはまた、市販されています。すぐに使用できる試薬を含むこれらの市販のキットは、(NA阻害剤が含まれていない)も同様に再現可能です。試薬の大半は中に社内で行うことができるので、しかし、社内のNA阻害アッセイは、市販のキットよりも大幅に安いですより多くの量と以前にアッセイの主要なコストを占めたMUNANA基板は、現在、競争力のある価格で様々な供給源から購入することができます。薬剤ごとに1つのインフルエンザ分離株をテストするためのコストは約$ -1(USD)です。メルボルンWHOCCRRIでは、改善がアッセイの液体取扱い部品用ロボットプラットフォームの取り込み後に、社内のNA阻害アッセイに行われました。離れたウイルス希釈液の手動準備から、手順の大部分は、液体処理ロボットを用いて行われます。これは、マニュアルの取り扱いを最小限に抑えるが、それはまた、日中に実行できるアッセイの数を増加させないだけでなく。
NA阻害アッセイは非常に堅牢ですが、追加の注意を払って完了する必要がある重要なステップの数があります。まず、阻害曲線およびIC 50値をシフトすることができるNA阻害剤濃度における任意の不規則。そのため、細心の注意をする必要がありますNA阻害剤濃度を準備する際に支払いました。第二に、正確なピペットと正確インキュベーション期間はアッセイ間で一貫した結果を維持するために重要です。これは、キャリブレーションピペットとタイマーを使用することによって達成することができます。すべてのアッセイにおける対照ウイルスを含めることは、アッセイからアッセイへと長期間にわたってアッセイ性能の監視を可能にします。季節性インフルエンザウイルスのNA酵素活性はpH6.5で最適であるため、第三の、アッセイ緩衝液の正確なpHは重要です。いくつかの報告は、より低いpH条件の使用は、R292K変異14、15を含むA(H7N9)変形例として、インフルエンザ変異体の同定を改善できることを見出しました。しかしながら、アッセイ緩衝液のpHに変更はIC 50値をシフトし、これは実験室内と研究所との間でデータの比較を複雑にすることができます。他の修正と、pすることができ、トラブルシューティングerformedは、表5に列挙されています。
NA阻害剤は、現在、インフルエンザウイルスの循環に対して有効である承認された抗ウイルス薬の唯一のクラスです。他の抗ウイルスクラスは臨床使用のために利用可能になるまでは、インフルエンザウイルスの循環の抗ウイルス感受性サーベイランスだけではNA阻害剤を中心に説明します。そのため、結果の単純さと再現性、NA阻害剤へのインフルエンザウイルスの感受性を評価するためのNA阻害アッセイの使用が継続されます。
The authors have nothing to disclose.
インフルエンザの参考と研究協力センターメルボルンWHOは健康のオーストラリア政府部門によってサポートされています。
Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
96-well deep plates, 2.0mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
Single-channel pipettes (1 µL – 1000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 – 1250 µL volume) | |
Pipette tips (1 µL – 1250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
Incubator set at 37°C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |