Summary
אנו מתארים את השימוש של assay עיכוב נורמינידאז פנוטיפי קרינה המבוסס להעריך את הרגישות של וירוסי השפעת A ו- B לכיתה מעכבת נורמינידאז של תרופות אנטי-ויראליות.
Abstract
נורמינידאז (NA) המעכבים הם בכיתה רק של תרופות אנטי-ויראליות המאושר לטיפול וטיפול מניעי של שפעת יעיל נגד זנים במחזור כרגע. בנוסף השימוש שלהם בטיפול שפעת עונתית, מעכבי NA כבר נאגר על ידי מספר מדינות לשימוש במקרה של מגיפה. לכן חשוב לנטר את הרגישות של מחזורי נגיפי שפעת למעמד הזה של תרופות אנטי-ויראליות. ישנם סוגים שונים של מבחנים שניתן להשתמש בם כדי להעריך את הרגישות של נגיפי שפעת לבולם NA, אבל מבחני עיכוב אנזים או באמצעות מצע פלורסנט או מצע chemiluminescent הם בשימוש הנרחב ביותר ומומלץ. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של assay מבוסס פלואורסצנטי להעריך את רגישות וירוס שפעת למעכבי NA. Assay הוא מבוסס על אנזים NA בביקוע 2 '- (4-Methylumbelliferyl) -α-D- N חומצה -acetylneuraminic (MUNANAהמצע) כדי לשחרר את המוצר 4-methylumbelliferone (4-MU) ניאון. לכן, ההשפעה המעכבת של מעכב NA על נגיף שפעת NA נקבעה על בסיס הריכוז של מעכבי NA כי נדרש להפחית 50% מפעילות NA, נתון כערך 50 IC.
Introduction
Haemagglutinin (HA) ו נורמינידאז (NA) הם שני גליקופרוטאינים השטח העיקרי של שפעת ווירוסים B. HA נקשר חומצה-גלקטוז sialic של גליקופרוטאינים פני התא או glycolipids, בעוד NA משחרר וירוס על ידי ביקוע החומצה sialic מן גלקטוז על תא השטח 1. מעכבי NA הם מח' של תרופות אנטי-ויראליות שפעת שנועדו רציונלית לקשור בחוזקה לאתר NA אנזימטי הפעיל, ובכך למנוע את השחרור ואת התפשטות צאצאי וירוס. Oseltamivir ו zanamivir שני מעכבי NA כי אושרו במדינות רבות ברחבי העולם לטיפול וטיפול מניעתי של שפעת. בשנים האחרונות, שני מעכבי NA נוספים, peramivir ו laninamivir, אושרו לשימוש במספר מצומצם של מדינות. הקרנת נגיפי שפעת עבור רגישות מעכבי NA ואת ההזדהות של מוטציות המקנות עמידות חשובה בקביעה וניטור אפקeness של המעמד הזה של תרופות אנטי-ויראליות.
בשנתי ה 16 השנים האחרונות, assay עיכוב NA הקרינה המבוססת שבוצע באופן שגרתי בבית WHO שיתוף פעולת מרכז לעיון ולמחקר על שפעת, מלבורן (Melbourne WHOCCRRI) לפקח על מגמת השינוי של רגישות אנטי בקרב במחזור נגיפי שפעת. מדי שנה, יותר מ 2000 נגיפי שפעת נבדקים עבור רגישות אנטי. ברוב עונות שפעת,> 98% של וירוסים רגישים ארבעה כל מעכבי NA 2, 3, 4, אם כי במהלך 2007-2008 עונת שפעת בחצי הכדור הצפוני, חלה עלייה במספר של A עונתית לשעבר וירוסים (H1N1) שהקטין את רגישות oseltamivir 5. קבוצה זו של וירוסים, אשר הכילה את H275Y החלפת NA חומצות אמינו, התפשטה לשאר העולם עד סוף שנת 2008, מה שהופך oseltamivir inappropriאכול גלובלי לטיפול בנגיף זה. הרוב המכריע של המסתובבות כיום שפעת B, שפעת A (H3N2), וכן שפעת A (H1N1) זנים pdm09 רגישים oseltamivir, למרות אשכולות הקהילה של A (H1N1) גרסאות pdm09 המכיל את H275Y החלפת חומצת אמינו NA המקנה מופחת oseltamivir ו רגישות peramivir, דווח בחלקים שונים של העולם 6, 7.
בגלל הצורך כייל גבוה וירוס מספיק, דגימות קליניות (כולל שטיפות אף חי) חייבות להיות passaged באחת תרבית תאים או embryonated ביצי תרנגולת לפני בדיקות רגישות אנטי. את assay עיכוב NA המתוארות במאמר זה ניתן לחלק לשלושה חלקים:
קביעת טווח ליניארי עבור המוצר 4-methylumbelliferone ניאון (4-MU) על fluorometer בפרט
בשל ההבדלים האינהרנטיים בין fluorometers, tהוא מגוון ליניארי עבור המוצר הסופי, 4-MU, ואת יחידת הקרינה היחסית פלורסנט (RFU), צריך להיות הוקמה. ברגע בטווח ליניארי עבור 4-MU נקבע, אות היעד האופטימלית נבחרה, שאליו הריכוז של נגיפי השפעת מותאם ב assay פעילות NA. לאחר השלמת עבור fluorometer מסוים, זה לא אמור צורך לחזור.
קביעת פעילות NA של וירוסים
את assay פעילות NA הוא assay פשוט כי תהיה כרוכה בתוספת של 2 '- (4-Methylumbelliferyl) חומצה -α-D- N -acetylneuraminic (MUNANA) המצע כדי בדילול וירוסים באופן סדרתי. כמות פלורסנט המוצר הסופי 4-MU שנוצר מן המחשוף של MUNANA ידי NA נמדדת באמצעות fluorometer. דילול הווירוס המתאים לשימוש ב assay עיכוב NA נבחר על ידי התוויית יחידות קרינה מפני דילול וירוס. מעקום sigmoidal פיק, את נקודת האמצע של הקטע ליניארי צריכה להתאיםהטווח ליניארי 4-MU של fluorometer נקבע בסעיף 1 ויידע את הריכוז של וירוסים המתאים לשמש בסעיף 3.
רגישות וירוס הערכה למעכבי NA באמצעות assay עיכוב NA
כדי להעריך את הרגישות של וירוסים כדי מעכב NA בפרט, וירוסים על דילול נקבע בסעיף 2 מודגרת עם מגוון של ריכוזי מעכב NA. בעקבות הדגירה לאחר מכן עם MUNANA, 4-MU שנוצר על ידי וירוסים מעצורים נמדדת RFU ידי fluorometer. ההשפעה המעכבת של מעכב NA על פעילות האנזים NA של נגיף מחושבת על פי ריכוז מעכב NA נדרש להפחית 50% מהפעילות NA, נתון כערך 50 IC.
Protocol
1. קביעת טווח לינארית של פלורסנט מוצרים 4-MU על fluorometer
- הכן 10 מ"ל של 6.4 מ"מ 4-MU פתרון המניות על ידי המסת 11.3 מ"ג של 4-MU ב 5 מ"ל של אתנול מוחלט. מוסיפים 5 מ"ל של 0.9% NaCl (w / v) לפתרון המניות כדי להפוך 10 מ"ל. הכן 640 מיקרומטר עובדים פתרון על ידי דילול 1 מ"ל של 6.4 מ"מ 4-MU ב 9 חיץ assay מ"ל של 1x (33.3 מ"מ 2- (N-morpholino) ethanesulfonic חומצה (MES) ו 4 מ"מ CaCl 2, pH 6.5).
הערה: הכן את החיץ assay 2x ידי הוספת 13 גרם של MES ו- 8 מ"ל של 1 M CaCl 2 כדי 992 מ"ל של מים מזוקקים. התאם את ה- pH 6.5 באמצעות 10 M של NaOH. סנן את החיץ באמצעות מסנן יצטט תאית סטרילי של גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר. זְהִירוּת! הידרוקסיד הנתרן הוא קאוסטית ועלול לגרום לכוויות כימיות על העור והעיניים. ודא כי ציוד מגן אישי מלא שחוקה. - כן 5 מיליליטר של מגוון של ריכוזי 4-MU (כלומר, 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 40 מיקרומטר, 80 מיקרומטר, 160 & #181; M, ו 320 מיקרומטר) באמצעות דילול סדרתי כפולה של 640 מיקרומטר 4-MU באמצעות חיץ assay 1x.
- לוותר 50 μL של דילול כל סדרתי של 4-MU (כלומר, 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 40 מיקרומטר, 80 מיקרומטר, 160 מיקרומטר, 320 מיקרומטר ו 640 מיקרומטר) (שתי בארות לכל דילול) לתוך ברורה, 96 צלחת שטוחה-קרקעית באר 50 μL של חיץ assay 1x לתוך הבארות הנותרות (אשר לשמש חסרים למדוד אותות רקע).
הערה: הריכוזים הסופי של 4-MU בהיקף התגובה (50 μL 4-MU + 50 μL 300 מיקרומטר MUNANA) הם 2.5 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 40 מיקרומטר, 80 מיקרומטר, 160 מיקרומטר ו 320 מיקרומטר . - הכן פתרון המניות 2.5 מ"מ MUNANA ידי reconstituting 25 מ"ג של MUNANA ב 20 מ"ל מים מזוקקים. מערבבים 0.72 מ"ל של 2.5 מ"מ MUNANA עם 5.28 מ"ל של 1x חיץ assay להשיג פתרון עובד 300 מיקרומטר MUNANA (נפח מספיק צלחת אחת). מכסים את הצינור המכיל את עובד MUNANA 300 מיקרומטרפתרון g עם רדיד אלומיניום ולשמור על הקרח אלא להשתמש מיד. לבטל את כל חומרי שאריות.
הערה: 2.5 מ"מ MUNANA פתרון המניות ניתן לאחסן -20 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש וחובה להשתמש בו תוך מחזור אחד ההקפאה / הפשרה. 4-MU ו MUNANA פתרונות הם רגישים לאור ולכן חייב להיות מוגן מפני חשיפה לאור ממושכת. - להוסיף 50 μL של 300 מיקרומטר MUNANA היטב כל, להקיש בעדינות לתערובת, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מכסים את הצלחת עם אוטם צלחת כדי למנוע אידוי.
הערה: שלב זה הוא להסביר את קרינת הרקע ב assay עיכוב NA. - הכן את פתרון להפסיק ידי ערבוב 11 מ"ל של אתנול אבסולוטי עם 2.225 מ"ל של 0.824 M NaOH (נפח מספיק צלחת אחת).
- הוספת 100 μL של פתרון להפסיק היטב כל לעצור את התגובה לטפוח בעדינות לערבב.
- קראו את הצלחת באמצעות fluorometer עם הגדרת גל עירור של 355 ננומטר ו סביבה גל פליטה של 460 ננומטר, כמו PEr להוראות היצרן.
- חשב את אות רקע הממוצעת באמצעות אותות קרינה מכל הבארות המכילות שום 4-MU. הפחת אות רקע הממוצע הזה מכל אחד הבארות המכילות 4-MU ולחשב את האותות הממוצעים (RFU) עבור כל ריכוז 4-MU. מגרש עקום סטנדרט של RFU נגד ריכוז 4-MU (מיקרומטר), כפי שמוצג באיור 1 א; קטע ליניארי תקריב של העקומה מוצג באיור 1b.
- דמיינו את העלילה של RFU נגד ריכוז 4-MU (מיקרומטר) כדי לקבוע את טווח ליניארי האות היעד האופטימלי; הטווח ליניארי מקום שבו גדל אותות הקרינה באופן יחסי הריכוזים הגוברים של 4-MU על העלילה, ואילו אות היעד האופטימלי הוא ריכוז 4-MU שרירותי בטווח ליניארי.
הערה: טווח ליניארי האות היעד האופטימלי הם fluorometer ספציפי. לדוגמה, fluorometer בבית מלבורן WHOCCRRI יש מגוון ליניארי של 20.5-40 מיקרומטר 4-MU ו אות יעד אופטימלית של ~ 30 מיקרומטר 4-MU, אשר מתאים ~ 1500 RFU.
2. קביעת פעילות NA של וירוסים
הערה: נגיפי שפעת מתורבתים כדי טיטר מספיק מדין-דארבי כליות לכלבים (MDCK) תאים או embryonated עוף וביצים 8.
- לוותר 120 μL לכל טוב של נגיפי שפעת תרבותי חי לתוך עמודה 1 ו 60 μL של חיץ assay 1x המכיל 0.1% NP-40 לתוך 11 עמודים שנותרו של צלחת 96-היטב, U-קרקעית.
- סדרתי לבצע דילול כפול של וירוסים פני הצלחת (כלומר, להעביר 60 μL מעמודה 1 לעמודה 2 וכן הלאה, עד עמודה 11) באמצעות פיפטה רב, עוזב עמודה 12 בתור ריק המכיל חיץ assay 1x בלבד.
- עבר 50 μL מכל אחד הבארות (וירוסים בדילול ואת חסר) לתוך צלחת ברורה, 96-היטב, שטוח תחתונה.
הערה: אין צורך גטיפים פיפטה hange אם החומרים מועברים מעמודה 12 ועד עמודה 1. - להוסיף 50 μL של 300 מיקרומטר MUNANA (מוכן כמו לכל צעד 1.4) לכל גם לטפוח בעדינות את הצלחת לערבב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. מכסים את הצלחת עם אוטם צלחת כדי למנוע אידוי.
- הוספת 100 μL של פתרון להפסיק (מוכן כמו לכל צעד 1.6) לכל טוב לסיים את התגובה לטפוח בעדינות את הצלחת לערבב.
- קרא את הצלחת באמצעות fluorometer.
- השתמש בהגדרת גל עירור של 355 ננומטר ו סביבה גל פליטה של 460 ננומטר.
- קבע את אות רקע הממוצעת מבוססת על קריאות קרינת העמודה 12 ולהחסיר את אות רקע הממוצעת מכל טוב. לשרטט גרף של RFU נגד דילולים וירוס.
הערה: הערכים הרקע 100 מיקרומטר MUNANA בבית מלבורן WHOCCRRI הם בדרך כלל בין 50 לבין 120 RFU, אבל אלה יהיו שונים בהתאם fluorometer being בשימוש. - הצגת העלילה של RFU נגד דילולי וירוס כדי לקבוע את נקודת האמצע של הקטע הליניארי של העקומה עבור כל וירוס (איור 2). השתמש אות היעד האופטימלי (שנקבע בשלב 1) כנקודת התייחסות.
הערה: הוא צריך להתאים עם מגוון ליניארי 4-MU של fluorometer נקבע בסעיף 1 ותספק את הריכוז המתאים של וירוסים כדי לשמש בסעיף 3.
3. הערכת רגישות וירוס כדי NA מעכבים באמצעות מבחן NA העיכוב
- הכן מניות המאסטר של מעכבי NA בריכוזים של 300 מיקרומטר.
- הכן 300 מיקרומטר zanamivir (משקל מולקולרי, MW = 332.32 g / mol) על ידי המסת 5.0 מ"ג של zanamivir ב 50 חיץ assay מ"ל של 2x (66.6 מ"מ MES ו 8 מ"מ CaCl 2, pH 6.5).
- הכן 300 מיקרומטר carboxylate oseltamivir (D-טרטרט; MW = 386.44 g / mol) על ידי המסת 5.8 מ"ג ב 50 מ"ל של חיץ assay 2x.
- הכןהידראט 300 מיקרומטר peramivir (MW = 382.45 g / mol) על ידי המסת 5.7 מ"ג ב 50 מ"ל של חיץ assay 2x.
- הכן 300 מיקרומטר laninamivir (MW = 346.34 g / mol) על ידי המסת 5.2 מ"ג ב 50 מ"ל של חיץ assay 2x.
הערה: מעכב NA מניות מאסטר ניתן לאחסן -20 מעלות צלזיוס למשך 12 חודשים. בדוק את MW של מעכבי NA כדי להבטיח את משקולות כרכים הנכונות משמשות כינון מחדש. Carboxylate oseltamivir הוא התרכובת הפעילה של פוספט oseltamivir prodrug. לכן, רק carboxylate oseltamivir יש להשתמש ב assay עיכוב NA.
- מתוך מניות מאסטר, להכין עבודה מניות של פי עשרה דילולים סדרתי של מעכבי NA ב 50 מבחנות צנטריפוגה מ"ל בריכוזים של 0.03 ננומטר, 0.3 ננומטר, 3 ננומטר, 30 ננומטר, 300 ננומטר, 3000 ננומטר, ו 30,000 ננומטר assay 2x חיץ (MES 66.6 מ"מ ו 8 מ"מ CaCl 2, pH 6.5); זה מיועד לשימוש על פני מבחנים מרובים.
הערה: הריכוזים הסופיים של מעכבי NA תגובת volumדואר (50 μL של דילול וירוס + 50 μL של NA מעכב + 50 μL של 300 מיקרומטר MUNANA) הם 0.01 ננומטר, 0.1 ננומטר, 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 ננומטר, 1000 ננומטר, ו 10,000 ננומטר, בהתאמה. הריכוז הסופי אינו כולל את 100 μL של פתרון להפסיק. אחסן את כל דילולים מעכבי NA ב 2-8 מעלות צלזיוס. מועד הפקיעה הוא זהה לזה של מניות מאסטר. - כן דילולי הווירוס במאגר assay 1x המכילים חומרים פעילי שטח 0.1% NP-40 בבלוק 96-עמוק היטב. השתמש דילולי וירוס מבוססים על תוצאות assay פעילות NA מסעיף 2. השתמש נפח כולל של 2 מיליליטר לכל וירוס כדי לבדוק ארבעה מעכבי NA.
הערה: כן שתי בארות (1 מ"ל לכל טוב) לכל וירוס בבלוק 96-עמוק היטב. דוגמאות של דילולים וירוס וירוס 1, 2, ו 3 מוצגים בטבלה 1. - מחלק את הנפח הנדרש מעכבי NA (המוכנים כמו לכל צעד 3.2) לתוך מאגר 8 עמוקים היטב. משם, לוותר 50 μL של NA מעכבים ב דילולים הנעים בין 0 ננומטר (2x assay בuffer בלבד) 30,000 ננומטר בשורות A ל- H בתוך צלחת ברורה, 96-היטב, שטוח תחתון.
הערה: פריסת הצלחת מתוארת באיור 3. - להוסיף 50 μL של וירוסים מבחן המדולל גם לעמודות 1-11 ו 50 μL לכל היטב חיץ assay 1x רק לעמודה 12. לטפוח בעדינות את הצלחת לערבב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. מכסים את הצלחת עם אוטם צלחת כדי למנוע אידוי.
- להוסיף 50 μL של 300 מיקרומטר MUNANA (מוכן כמו לכל צעד 1.4) לכל גם לטפוח בעדינות את הצלחת לערבב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. מכסים את הצלחת עם אוטם צלחת כדי למנוע אידוי.
- הוספת 100 μL של פתרון להפסיק (מוכן כמו לכל צעד 1.6) זה טוב לטפוח בעדינות את הצלחת לערבב.
- קרא את הצלחת באמצעות fluorometer.
- השתמש גל עירור של 355 ננומטר ו גל פליטה של 460 ננומטר, כפי שתואר לעיל.
4. חישובערכים 50 IC
הערה: v1.2 JASPR הוא עקומת הולם תוכנה המאפשרת חישוב ערכים 50 IC. התוכנה פותחה על ידי חטיבת השפעת ב- CDC, אטלנטה, ארה"ב. התוכנה מנצלת את המשוואה: x max V = V (1 - ([I] / (K i + [i]))), שבו מקס V הוא השיעור המרבי של חילוף חומרים, [I] הוא הריכוז המעכב, V הוא התגובה היותך מעוכב, ואני K הוא IC 50 עבור עקומת עיכוב.
- העתק והדבק את הנתונים הגולמיים ישודר ידי fluorometer לגיליון אלקטרוני בפורמט צלחת 12-טור (96-היטב), החל בתא A1.
הערה: נתונים גולמיים בכל צלחת עוקבות חייבים ייפרסו על ידי שורה אחת ריקה. אם כל וירוס נבדק כנגד ארבעה מעכבי NA, ולהדביק את הנתונים הגולמיים ב סט של ארבעה (עם שורה ריקה בין כל צלחת). - פתח את תוכנת CL ההולמותאיכס על הכרטיסייה "ניסוי". בחר "2-סמים אלטרנטיביים Fluoro 11 דוגמאות."
- לחץ על הלשונית "אפשרויות" וסמן "ליצור גרפים."
- לחץ על "אפשרויות" שוב ולחץ על הכרטיסייה "ניו מפתח". שמור את קובץ ה- csv "inhibition_key" באותה תיקייה כמו קובץ גיליון הנתונים הגולמיים.
- בקובץ inhibition_key, את שמות כל מדגם מתחת מזהה. כל שם מדגם חייב להיות ייחודי.
- אם ארבעה מעכבי NA נבדקו, להכניס רווחים עבור שתי שורות נוספות מתחת Oseltamivir באמצעות הקלדת "Peramivir" ו "Laninamivir." שמור את השינויים שבוצעו בקובץ inhibition_key.
- חזור אל "נ jaspr 1.2 וניגוד התאמת עקומות" החלון ובחר את קובץ הנתונים הגולמיים כמו "קובץ ניסוי" ו inhibition_key בשם "קובץ מפתח." מפעיל את הניתוח. שמור את התוצאות בפורמטים .csv ו- pdf.
הערה: התוכנה באופן אוטומטי תציב עקומת עיכוב (RFU משינוי מתחNST NA ריכוזי מעכב), כפי שמוצג באיור 4. התכנית גם מחשבת ערכי 50 IC עבור כל וירוס נגד מעכב NA בודד (איור 4). בנוסף, JASPR מציג את הערכים IC 50 ואת האות ה-רקע (S / B) יחס בפורמט גיליון אלקטרוני. ערכי הרקע יכולים להיות שונים מכון למכון תלוי fluorometer בשימוש. באותו מלבורן WHOCCRRI, ברקע ערכים עבור 100 מיקרומטר מגוון MUNANA מן 50 כדי 120 RFU. עבור ער IC 50 אמין, יחס S / B של ≥10 עדיף, אם כי יחס של פחות מ 10 הוא עדיין מקובל, במיוחד עבור וירוסים מוטנטים שיש פעילות NA מאוד נמוכה. - בדוק את ערכי IC 50 ואת הצורות העקומות שנוצרו על ידי התוכנה. כל נקודות הנתונים צריכות לנפול על או קרוב העקום; אם לא נעשה כן, לחזור על assay עיכוב NA.
הערה: לאיתור וירוסים המראים באופן חריג ערכים גבוהים 50 IC, assay צריך להיות חוזראד כדי לאשר את התוצאה.
Representative Results
באמצעות הנחיות דיווח סטנדרטיות מקבוצת עבודת WHO על מעקב של השפעת אנטי רגיש 9, את הרגישות של נגיפי שפעת לבולם NA מדווחת באמצעות תנאי עיכוב נורמלי (NI), העיכוב מופחת (RI), ועיכוב מופחת מאוד (HRI) . וירוסי NI הם אלה עם IC 50 ערכים פחות מ 10-לקפל לעומת התייחסות חציון 50 IC עבור וירוסי השפעת A (או פחות מ 5 פי לאיתור וירוסי השפעת B). וירוסי RI הם אלה עם ערכי 50 IC בין 10 ו 100 של פי מעל הפנית חציון 50 IC עבור וירוסי השפעת A (או 5 ו 50-לקפל עבור השפעת B). וירוסי HRI הם אלה עם IC 50 ערכים של 100 פי מעל פניית החציוני IC 50 וירוסי השפעת A (או מעל 50 פי לאיתור וירוסי השפעת B); ראה טבלה 2.
page = "1"> ההתייחסות החציוני IC 50 ערכים עבור pdm09 (H1N1), A (H3N2), ו- B Yamagata / B וירוסים ויקטוריה מחושבים ומעודכנת מדי שנה ב מלבורן WHOCCRRI כדי לשקף שינויים קלים בערכים 50 IC של במחזור זני שפעת לבולם NA (לוח 3). ערכי חציון 50 IC ב שפעת A (H1N1) וירוסים pdm09 הם כמעט זהים בכל ארבעת מעכבי NA, אבל zanamivir חציון laninamivir IC 50 ערכים עבור וירוסים (H3N2) הם בני 2 עד 4 גבוה פי לעומת oseltamivir ו peramivir IC 50 ערכים (לוח 3). השווי החציוני oseltamivir IC 50 וירוסים שפעת B הוא בדרך כלל 5 עד 10 גבוה פי מאשר zanamivir, peramivir, ו laninamivir 50 ערכים IC (לוח 3).
את assay עיכוב NA הוא assay פנוטיפי שאינו מספק מידע על associ שינויים גנטייםated עם RI או HRI. לכן, חשוב כי ניתוח גנטי מבוצע בעקבות זיהוי של וירוסים עם RI או HRI. באותו מלבורן WHOCCRRI, הגן של וריאנטים NA מנותח באמצעות רצף סנגר ו-סידור Pyro. רשימה מייצגת של החלפות חומצת אמינו ניתן למצוא את הגן NA של וירוסים עם גרסאות RI ו HRI מוצגת בטבלה 4. רשימה מקיפה של החלפות חומצת האמין שיכול לשנות את רגישות NAI זמינה גם באתר ארגון הבריאות העולמי 10.
איור 1: RFU נגד ריכוז 4-MU. (א) עקומת תקן של RFU נגד 4-MU ריכוז (מיקרומטר). התיבה המקווקות מראה את הטווח ליניארי של 4-MU עבור fluorometer. אותות הקרינה מעל הטווח ליניארי ניתן רוויים, ולכן, כל יםשינויים בקניון קרינה לא יזוהו על ידי fluorometer. (ב) תקריב סעיף ליניארית של עקומת רמת 1a איור לצורך זיהוי של "אות היעד האופטימלי." Fluorometer בבית מלבורן WHOCCRRI יש מגוון ליניארי של 2.5-40 מיקרומטר 4-MU ו אות יעד אופטימלית של ~ 30 מיקרומטר 4-MU, אשר מתאימה ~ 1500 RFU. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: דוגמה של עקומות הפעילות NA של נגיפי שפעת. שווי הרקע הממוצע של 50.61 RFU כבר מופחת כל נקודת דילול על עקומות פעילות NA. החצים מצביעים על דילול וירוס מתאים לשימוש ב assay עיכוב NA עבור כל וירוס. עבור הכנה קלה יותר aration של דילולים וירוס, אחד יכול לבחור לבצע דילול 1/100 וירוס 3 במקום דילול 1/96. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: פלייט פריסה עבור ההתקנה של assay עיכוב NA. כל צלחת כוללת את הטור האחרון, אשר משמש כביקורת שלילית שאינו מכיל וירוס אבל חיץ assay 1x בלבד (AB), מעכב NA, MUNANA, ולהפסיק פתרון. הערה: JASPR משתמשת קריאות מעמודת 12 כל צלחת כדי לקבוע את האות הריקה הממוצעת המשמשת לחישוב הערכים 50 IC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
לשמור-together.within-page = "1"> 
איור 4: דוגמא עקומה עיכוב וערך 50 IC של A (H1N1) pdm09, A / פרה / 82/2015. תוכנת JASPR מציגה את עקומת העיכוב כפי פלואורסצנטי (RFU) נגד הריכוז גדל והולך (ננומטר) של מעכב NA, עם כל לנכון נקודה בתוך העקומה. בהתבסס על עקומת העיכוב, הערך 50 IC נחוש כמו ריכוז מעכב NA כדי להפחית 50% מפעילות NA הווירוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| וִירוּס | דילול וירוס נדרש | נפח assay חיץ 1x (μL) | פעילי שטח-אמפר-NP-40 (10%) (מ"ל) | נפח וירוס (מ"ל) |
| 1 | 1/20 | 940 | 10 | 50 |
| 2 | 1/40 | 965 | 10 | 25 |
| 3 | 1/100 | 890 | 10 | 10 |
טבלה 1: הכנת דילולים וירוס וירוס 1, 2, ו 3 ב assay עיכוב NA.
| סוג וירוס / תת / בשושלת | עיכוב רגיל | עיכוב מופחת | עיכוב מופחת מאוד |
| (NI) | (RI) | (HRI) | |
| A (H1N1) pdm09 | <10 לקפל | 10-100 לקפל | > 100 לקפל |
| A (H3N2) | &# 60; 10 לקפל | 10-100 לקפל | > 100 לקפל |
| B Yamagata ו- B ויקטוריה | <5 לקפל | 5-50 לקפל | > 50 לקפל |
לוח 2: אנטי WHO קבוצת העבודה המליצה הנחיות לסיווג רגישות וירוס שפעת למעכבי NA.
| סוג וירוס / תת / בשושלת | N | Zanamivir | Oseltamivir | Peramivir | Laninamivir |
| חציון (טווח) IC 50 ננומטר | חציון (טווח) IC 50 ננומטר | חציון (טווח) IC 50 ננומטר | חציון (טווח) IC 50 ננומטר | ||
| A (H1N1) pdm09 | 1326 | 0,42 (0.1-3.43) | <td> 0.36 (0.01-3.48)0,19 (0.07-1.60) | 0,55 (0.05-2.29) | |
| A (H3N2) | 1654 | 0.9 (0.11-4.0) | 0,38 (0.01-3.65) | 0,33 (0.12-3.06) | 1,38 (0.01-9.38) |
| B Yamagata ו- B ויקטוריה | 1115 | 2.2 (1.24-10.72) | 15,12 (2.39-70.75) | 1,36 (0.57-6.67) | 2,89 (1.62-9.15) |
טבלה 3: 50 IC חציון ו IC 50 בטווח של עיכוב נורמלי (NI) וירוסים מ 2015 נגזר על WHO CCRRI, מלבורן.
| אמינו החלפת חומצה | סוג / תת / בשושלת | IC 50 שיתוף מתקפל שינויmpared להפנות ערכי IC 50 החציוני. | |||
| Zanamivir | Oseltamivir | Peramivir | Laninamivir | ||
| H275Y | A (H1N1) pdm09 | 1 | 557 (HRI) | 123 (HRI) | 2 |
| E119V | A (H3N2) | 1 | 63 (RI) | 1 | 1 |
| H134Y | B ויקטוריה | 1 | 4 | 76 (HRI) | 2 |
| N151T | B ויקטוריה | 4 | 4 | 42 (HRI) | 1 |
| G104E | B ויקטוריה | 1220 (HRI) | 87 (HRI) | 17,724 (HRI) | 701 (HRI) |
| E105K | B ויקטוריה | 3 | 5 (RI) | 59 (HRI) | 2 |
| I222T | B ויקטוריה | 2 | 7 (RI) | 8 (RI) | 3 |
| H273Y | B Yamagata | 1 | 230 (HRI) | 377 (HRI) | 2 |
| D197N | B Yamagata | 4 | 7 (RI) | 32 (RI) | 3 |
טבלה 4: רשימה מייצגת של החלפות חומצת אמינו קשורות עיכוב מופחת (RI) או עיכוב מופחת מאוד (HRI) למעכבי NA.
| בְּעָיָה | סיבות אפשריות) | פתרונות) |
| אין או פעילות NA נמוכה | אין וירוס היה תשואת וירוס נוכחית או נמוכה. | חייבת להיות מתורבתת דגימה קלינית שורות תאים (כלומר מהדין-דארבי תאי כליות לכלבים) או ביצי תרנגולת embryonatedכדי עומס נגיף גבוה יותר לשימוש assay עיכוב NA. |
| יש וירוסים מוטנטים חלק בפעילות NA נמוך מאוד למרות בעומס וירוס גבוה. | השתמש ריכוז וירוס מסודר לבדיקה. תחתון חיץ pH assay (pH למשל 5.3) ניתן להשתמש. עם זאת, יש להיזהר בהשוואת הנתונים. | |
| אין או פעילות NA נמוך ב assay עיכוב NA | אין וירוס נוסף. | Re-לדלל את הנגיף. ודא וירוס מתווסף ישירות למאגר assay 1x. |
| דילול וירוס שגוי שמש. | חזור על assay פעילות NA. | |
| זמן דגירה מספיק. | להבטיח את זמן הדגירה אחריו. | |
| נקודות נתונים ליפול מחוץ עקומת 50 IC | זיהום צולב של NA מעכב של ריכוז גבוה. | ודאו הטיפים אינם באים במגע עם inhibi NATor כאשר מחלק וירוסים מדולל לתוך 96 הצלחת היטב. |
| אם 8 מאגר באר עמוק שמש, להשליך מחדש לוותר על NA מעכב בריכוזים לתוך מאגר באר עמוק 8 טרי. | ||
| ההיקף המעכב NA או MUNANA או הווירוס בדילול לא נוסף פחות לבאר כל אחד. | חזור על assay עם טפטפת רב ערוצית מכויל. ודא נפח שווה של כל ריאגנט הוא חלק לתוך זה גם. | |
| ערכים גבוהים באופן חריג 50 IC | ריכוז גבוה מדי של וירוס נוסף. | חזור על assay פעילות NA ו assay עיכוב NA. |
| מדגם מבחן הכיל תערובות של שפעת A ו- B. השפעת | בצעו בזמן אמת PCR לזיהוי נוכחות של תערובות וירוס. | |
| זיהום בקטריאלי במדגם | וירוס תרבות במצב סטרילי עם הנוכחות של אנטיביוטיקה. | |
| אותות קרינת רקע גבוה | מצע MUNANA עלול להיפגם עם זמן. | השתמש אצווה חדשה של MUNANA subtrate. |
| איתור של קרינת מבארות שכנות. | השתמש שחורות 96-גם צלחות שטוחות תחתונות |
טבלה 5: פתרון בעיות עבור בעיות פוטנציאליות ב assay עיכוב NA.
Discussion
הניטור הגלובלי של רגישות וירוס שפעת למעכבי NA הוא הנערך כיום על ידי מספר המעבדות באף פלורסנט או עיכוב chemiluminescent NA מבחני 11, 12. את assay ניאון הוא יותר נפוץ מאשר assay chemiluminescent. למרות מבחני שניהם חזקים ודיר, הערכים 50 IC המתקבל assay הקרינה המבוססת נוטים להיות גבוהים יותר מאשר assay מבוסס chemiluminescence, עושים השוואה ישירה של הנתונים משני המבחנים 13 הקשה. אפילו עם השימוש באותו הפרוטוקול, נתונים המופקים מן המעבדה אחד עשויים להשתנות מאדם אחר. בגלל הווריאציות הללו בין מעבדות, קבוצת העבודה WHO על מעקב של רגישות אנטי שפעת מיוצר קו מנחה לסייע השוואות בין-מעבדה. במקום להשוות את הערכים 50 IC המוחלטים, שימוש במסמך זהsa השוואה על בסיס ההפרש לקפל 50 IC לחציון IC 50 של נגיפי שפעת NI נבדק בכל מעבדה בפרט. היכולת להשוות נתונים מהחמישה מרכזי הפעולה הביאה לפרסום השנתי של נתוני רגישות אנטי הגלובלית שפעת 2, 3, 4. הזמינות של הכמות הגדולה של נתונים רגישים שפעת ברשות הרבה מאפשרת לחוקרים להשוות IC 50 נתונים ממחקרים אלה עם שפיק במעבדות שלהם.
מבחני עיכוב NA אחרים שפועלים קונספט דומה זמינים גם מסחרי. ערכות המסחריות אלה המכילים חומרים כימיים מוכנים לשימוש (NA מעכבים לא כלול) ולייצר פחות. עם זאת, assay עיכוב NA בתוך הבית הוא זול משמעותית מאשר ערכות מסחריות, כי הרוב המכריע של ריאגנטים יכול להתבצע בתוך הבית בכמויות גדולות יותר ואת מצע MUNANA, שבעבר היווה את העלות העיקרית של assay, כעת ניתן לרכוש ממקורות שונים במחירים תחרותיים. עלות בדיקה לבודד שפעת אחד לכל תרופה היא כ 1 $ (דולר). באותו מלבורן WHOCCRRI, שיפורים נעשו על assay עיכוב בתוך הבית NA לאחר ההתאגדות של פלטפורמה רובוטית עבור רכיבי טיפול הנוזל של assay. מלבד הכנה ידנית של דילולים וירוס, רוב הנהלים מבוצעים באמצעות רובוט לטיפול-נוזלי. לא רק זה למזער טיפול ידני, אבל זה גם מגדיל את מספר המבחנים שניתן להפיק בכל יום.
למרות assay עיכוב NA הוא חזק מאוד, ישנם מספר צעדים קריטיים שצריכים להסתיים עם טיפול נוסף. ראשית, כל חריגה בריכוזי מעכב NA יכול להסיט את עקומות עיכוב וערכי 50 IC; לפיכך, תשומת לב קפדנית צריכה להיותכאשר שלם הכנה ריכוזי מעכב NA. שנית, תקופות pipetting ו דגירה מדויקת מדויקות הם קריטיות בשמירת תוצאות עקביות על פני מבחנים; זו יכולה להיות מושגת על ידי שימוש טפטפות וטיימרים מכוילים. הכללתו של וירוסים מלאה בכל assay גם מאפשרת ניטור של ביצועי assay מ assay כדי assay ולאורך תקופות זמן ארוכות. שלישית, משום פעילות אנזים NA של נגיפי שפעת עונתיים היא אופטימלית ב- pH 6.5, ה- pH הנכון של חיץ assay חשוב. כמה דיווחים מצאו כי שימוש תנאי pH נמוכים יותר עשויים משפר את זיהוי של וריאנטים שפעת, כגון גרסת A (H7N9) המכילה את מוטצית R292K 14, 15. עם זאת, שהשינוי pH של חיץ assay יעבור את הערכים 50 IC, וזה עלול לסבך את ההשוואה של הנתונים בתוך מעבדות ובין מעבדות. שינויים אחרים ופתרון בעיות שיכולות להיות performed מפורטים בטבלה 5.
מעכבי NA הם בכיתה רק של תרופות אנטי-ויראליות אשרו כי כרגע יעילים נגד במחזור נגיפי שפעת. עד כיתות אנטי אחרות הופכות להיות זמינות לשימוש קליני, מעקב הרגישות אנטי מחזורי נגיפיי שפעת יתמקד מעכבי NA לבד. בגלל הפשטות ואת השחזור של תוצאות, השימוש של assay עיכוב NA להעריך את רגישות וירוס שפעת למעכבי NA ימשיך.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
את מלבורן WHO שיתוף פעולת מרכז לעיון ולמחקר על השפעת נתמכת על ידי המשרד הממשלתי אוסטרלי בריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
| 2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
| 2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
| 4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
| 2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
| Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
| Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
| Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
| 96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
| 96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
| 8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
| 96-well deep plates, 2.0 mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
| Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
| Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
| Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume) | |
| Pipette tips (1 µL - 1,250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
| Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
| Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
| Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
| Incubator set at 37 °C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
| Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
| Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
| Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
| Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
| JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |
References
- Moscona, A. Neuraminidase inhibitors for influenza. N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).
- Hurt, A. C., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).
- Meijer, A., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).
- Takashita, E., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).
- Lackenby, A., et al. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe. Euro Surveill. 13 (5), (2008).
- Hurt, A. C., et al. Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza. N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).
- Takashita, E., et al. Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan. Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).
- Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
- Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012. Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).
- A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from: http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1 (2016).
- Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).
- Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).
- Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from: https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data (2016).
- Sleeman, K., et al. R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses. Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).
- Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en. J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).
