Summary
La placa de crecimiento es una región cartilaginosa en los huesos largos de los niños donde se produce un crecimiento longitudinal. Cuando se lesiona, el tejido óseo puede formar y afectar el crecimiento. Describimos un modelo de rata de lesión en la placa de crecimiento que conduce al tejido óseo de reparación, permitiendo el estudio de mecanismos de reparación y estrategias de regeneración de placas de crecimiento.
Abstract
Un tercio de todas las fracturas pediátricas implican la placa de crecimiento y pueden resultar en un deterioro del crecimiento óseo. La placa de crecimiento (o physis) es el tejido del cartílago que se encuentra al final de todos los huesos largos en los niños que es responsable del crecimiento óseo longitudinal. Una vez dañado, el tejido del cartílago dentro de la placa de crecimiento puede someterse a una osificación prematura y conducir a un tejido óseo no deseado de reparación, que forma una "barra ósea". En algunos casos, esta barra ósea puede dar lugar a deformidades del crecimiento óseo, tales como deformidades angulares, o puede detener completamente el crecimiento óseo longitudinal. Actualmente no hay tratamiento clínico que pueda reparar completamente una placa de crecimiento lesionada. El uso de un modelo animal de lesión en la placa de crecimiento para comprender mejor los mecanismos subyacentes a la formación de la barra ósea e identificar maneras de inhibirla es una gran oportunidad para desarrollar mejores tratamientos para lesiones en la placa de crecimiento. Este protocolo describe cómo interrumpir la placa de crecimiento tibial proximal de la rata usando un defecto de perforación. Esta smaEl modelo animal produce confiablemente una barra ósea y puede dar lugar a deformidades de crecimiento similares a las observadas en los niños. Este modelo permite investigar los mecanismos moleculares de la formación de barras óseas y sirve como un medio para probar posibles opciones de tratamiento para lesiones en la placa de crecimiento.
Introduction
Las lesiones en la placa de crecimiento representan el 30% de todas las fracturas pediátricas y pueden resultar en un deterioro del crecimiento óseo 1 . Además de las fracturas, las lesiones en la placa de crecimiento pueden ser causadas por otras etiologías, incluyendo osteomielitis 2 , tumores óseos primarios 3 , radiación y quimioterapia 4 , y daño iatrogénico 5 . La placa de crecimiento (o physis) es una región del cartílago al final de los huesos largos de los niños que es responsable del crecimiento longitudinal del hueso. Impulsa el alargamiento óseo a través de la osificación endocondral; Los condrocitos sufren proliferación e hipertrofia y luego son remodelados por osteoblastos entrantes para formar hueso trabecular 6 . La placa de crecimiento es también una zona débil del esqueleto en desarrollo, por lo que es propenso a las lesiones. La principal preocupación con las fracturas o lesiones de placas de crecimiento es que el tejido cartilaginoso dañado dentro de la placa de crecimiento puedeE reemplazado con tejido de reparación ósea no deseado, también conocido como "barra ósea". Dependiendo de su tamaño y ubicación dentro de la placa de crecimiento, la barra ósea puede conducir a deformidades angulares o detención completa del crecimiento, una secuela devastadora para los niños pequeños que aún no han alcanzado su altura completa 7 .
Actualmente no hay tratamiento que pueda reparar completamente una placa de crecimiento dañada. Una vez que se forma la barra ósea, el clínico debe decidir si debe o no quitarla quirúrgicamente 8 . Los pacientes con al menos 2 años o 2 cm de crecimiento esquelético restante y con una barra ósea que abarca menos del 50% del área de la placa de crecimiento suelen ser candidatos para la resección de la barra ósea 8 . La extirpación quirúrgica de la barra ósea a menudo es seguida por la interposición de un injerto de grasa autóloga para prevenir la reforma del tejido óseo y para permitir que la placa de crecimiento no dañada circundante restablezca el crecimiento. Sin embargo, estasEmatic ya menudo fracasan, lo que lleva a la recurrencia de la barra ósea y el efecto negativo continuo sobre el crecimiento 9 . Existe una necesidad crítica de desarrollar tratamientos eficaces que no sólo eviten la formación de barras óseas, sino que también regeneren el cartílago de la placa de crecimiento, restaurando así la elongación ósea normal.
Los mecanismos moleculares subyacentes a la formación de barras óseas aún no se han dilucidado completamente. Una mayor comprensión de estos mecanismos biológicos podría conducir a intervenciones terapéuticas más eficaces para los niños que sufren lesiones en la placa de crecimiento. Dado que el estudio de estos mecanismos en los seres humanos es difícil, se han utilizado modelos animales, especialmente el modelo de rata de lesión en la placa de crecimiento 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . El método presentado en esteDescribe cómo un defecto de perforación en la placa de crecimiento tibial de la rata conduce a tejido de reparación predecible y reproducible que comienza la osificación tan temprano como 7 días después de la lesión y forma una barra ósea completamente madura con remodelación a los 28 días después de la lesión 10 . Esto proporciona un modelo animal in vivo en el cual estudiar los mecanismos biológicos de la formación de barras óseas, así como evaluar nuevas terapias que podrían prevenir la barra ósea y / o regenerar el cartílago de la placa de crecimiento. Por ejemplo, este modelo puede usarse para probar biomateriales condrogénicos que pueden regenerar el cartílago de la placa de crecimiento y ofrecer un tratamiento valioso para los niños que sufren lesiones en la placa de crecimiento. Las técnicas presentadas en este artículo describirán los métodos quirúrgicos utilizados para producir la lesión de la placa de crecimiento y la posterior entrega de biomateriales al sitio de la lesión. También discutiremos métodos para evaluar la formación de barras óseas y reparar el tejido.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales deben ser aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional Animal (IACUC). El protocolo animal para el siguiente procedimiento fue aprobado por la Universidad de Colorado Denver IACUC.
1. Obtener Ratas
NOTA: A menos que se deseen animales modificados genéticamente, se necesitan ratas Sprague-Dawley esqueléticamente inmaduras de 6 semanas de edad en el momento de la cirugía. Otras cepas podrían utilizarse potencialmente; Sin embargo, la mayoría de los estudios publicados se han realizado en ratas Sprague-Dawley.
2. Preparación de Suministros Quirúrgicos
- Autoclave paquetes de suministro quirúrgico que incluyen uno de cada uno de los siguientes: # 3 asa de bisturí, titular de la aguja, fórceps Adson, tijeras y el iris.
- Autoclave los portabrocas sin llave. Los mandriles de taladro pueden esterilizarse con perlas entre cirugías de animales cuando operan en múltiples animales.
NOTA: Las reglas locales de IACUC relativas al uso deSe deben respetar las herramientas médicas de varios animales. Por ejemplo, la Universidad de Colorado Denver IACUC permite un conjunto de herramientas quirúrgicas para ser utilizado en hasta 5 animales antes de su descontinuación. Además, las herramientas quirúrgicas deben ser esterilizadas térmicamente utilizando un esterilizador de talones entre animales. Se deben usar otros paquetes quirúrgicos estériles para cualquier animal adicional. - Pines Steinmann de 5 cm de autoclave, uno para cada animal.
NOTA: Para reducir el riesgo de infección, los pines Steinmann no deben usarse para múltiples animales. - Autoclave Brocas dentales de 1,8 mm, una para cada animal.
NOTA: Para reducir el riesgo de infección, las fresas dentales no deben usarse para múltiples animales. - Autoclave un aplicador de clip de herida, si corresponde. Alternativamente, se pueden usar suturas enterradas para cerrar la capa cutánea. Consulte el paso 7.3.
- Si es posible, esterilice un taladro rotatorio mediante irradiación o esterilización con gas.
- Recoge los siguientes suministros adicionales: afeitadora eléctrica,Sialas estériles de 10 ml, agujas estériles de calibre 23, compresas de alcohol isopropílico, isoflurano, pinzas, analgésicos posquirúrgicos ( por ejemplo, AINEs y buprenorfina), sutura de ácido poliglicólico 3-0, gas estéril, yoduro de povidona, Guantes quirúrgicos estériles, cuchillas de bisturí estériles # 15, pinzas de herida estériles, máquina de anestesia, esterilizador de cuentas, almohadilla de calentamiento y almohadillas absorbentes.
3. Anestesia y preparación de animales
- Anestesiar al animal introduciéndolo en una cámara de inducción de 1 a 2 litros recibiendo flujo de oxígeno de 1 l / min con isoflurano al 5% a partir de un sistema de vaporización con un sistema de barrido pasivo.
NOTA: La exposición al isoflurano al 5% debe anestesiar a las ratas de 6 semanas de edad dentro de los 5 minutos. - Mueva al animal al sitio quirúrgico y mantenga al animal bajo anestesia con isoflurano al 2 - 3% usando un cono de nariz para el resto del procedimiento. Coloque el animal en decúbito supino sobre una almohadilla de calentamiento y absorbaEnt.
NOTA: El animal no necesita ser fijado a la mesa quirúrgica. La sujeción de la pata como se especifica en los pasos siguientes es un método suficiente de estabilización.
NOTA: Todos los procedimientos subsiguientes deben realizarse con el animal bajo anestesia. 2 - 3% de isoflurano debe ser suficiente para mantener la anestesia en ratas a esta edad. Esto puede confirmarse mediante la prueba del reflejo del retiro bípedo. - Administrar analgésicos intraoperatorios de acuerdo con las políticas aprobadas institucionalmente ( por ejemplo, buprenorfina a 0,05 mg / kg y carprofeno a 5 mg / kg).
4. Preparación de la tibia para la cirugía
- Afeitar toda la pata trasera desde el maléolo medial hasta la pelvis con una afeitadora eléctrica.
- Medir y registrar la longitud tibial desde la meseta tibial anterior hasta el lado inferior del maléolo medial usando calibradores. Alternativamente, mida toda la longitud de la tibia usando rayos X o microCT 11 Sup> , 12 , 14 . Opcionalmente, medir las dimensiones de la placa de crecimiento antes de la cirugía usando rayos X o microCT.
- Limpie el sitio quirúrgico limpiando toda la pierna (s), el abdomen y los genitales con hisopos de alcohol y luego con gasa empapada de yoduro de povidona.
NOTA: Para minimizar el riesgo de infección, todos los procedimientos subsiguientes, hasta que el animal se retire de la anestesia (paso 7.4), deben realizarse en condiciones estériles. Se debe acceder a todos los materiales quirúrgicos usando una técnica estéril. El uso de un asistente quirúrgico es altamente recomendado para mantener la esterilidad durante la cirugía. - Usando guantes quirúrgicos estériles, coloque una cortina quirúrgica estéril fenestrated sobre el animal, dejando la pierna (s) expuesta a través de la fenestración central.
5. Procedimiento quirúrgico para acceder a la placa de crecimiento
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Figura 1: Visión general del procedimiento quirúrgico.
A) Ubicación de varios marcadores anatómicos utilizados para crear una lesión exitosa en la placa de crecimiento. La cápsula de rodilla está inmediatamente posterior a la rótula (blanca), separando la tibia del fémur. La placa de crecimiento tibial (rojo oscuro) se puede ver inferior a la rótula y eludir la tibia. La placa de crecimiento proximal es un plano mayoritariamente plano, excepto el cuarto anterior que forma un plano diagonal. La intersección de estos dos planos forma el ángulo de la placa de crecimiento, que se utiliza para la angulación apropiada del taladro. La inserción semitendinosa es donde se inserta el músculo cuádriceps en la tibia posterior. B) Incisión a través de la cara anterior-medial de los tejidos blandos tibiales para acceder al hueso cortical. C) Ubicación de la ventana cortical utilizando la alineación con la inserción semitendinosa distal como punto de referencia. D) EvaluaciónLa profundidad de la lesión alineando el bisel en la fresa dental con la ventana cortical.
- Hacer una incisión de ~ 1 cm a través de la piel a lo largo de la cara medial anterior de la tibia proximal usando un mango de escalpelo # 3 y una cuchilla # 15, comenzando en el extremo distal del cóndilo femoral mediano ( Figura 1A ).
- Tire de la piel contra el hueso subyacente y mantenga la pierna firmemente mientras realiza la incisión.
NOTA: Esto mantendrá la incisión de la piel en el lugar deseado y ayudará en la creación de una incisión limpia. No presione demasiado firmemente con el bisturí para evitar perforar la cápsula de la rodilla, lo que resultaría en sangrado profuso y dificultará los pasos restantes.
- Tire de la piel contra el hueso subyacente y mantenga la pierna firmemente mientras realiza la incisión.
- Tomar nota de los marcadores anatómicos importantes, incluyendo: 1) la placa de crecimiento, 2) el ángulo de la placa de crecimiento, 3) la cápsula de rodilla, y 4) la inserción semitendinosa ( Figura 1A ).
- Utilizando el bisturí, realice una incisión de ~ 0,5 cmE fascia y tejidos blandos en la cara medial anterior de la tibia proximal, desde la placa de crecimiento hasta la parte inferior de la incisión cutánea ( Figura 1B ).
- Disecar o raspar suavemente la fascia y los tejidos blandos de la tibia usando el bisturí ( Figura 1B ).
NOTA: Es importante quitar o raspar tanto tejido blando de la tibia como sea posible para no interferir con los pasos de perforación. - Taladrar una ventana cortical a través del hueso cortical tibial en la diáfisis con un pasador Steinmann unido a una herramienta giratoria a 10.000 RPM (baja velocidad de la herramienta rotatoria especificada en la sección de materiales). Crear la ventana cortical de tal manera que se alinea con la inserción semitendinosa distal ( Figura 1C ).
- Mantenga el taladro perpendicular a la diáfisis tibial y taladre lentamente, teniendo cuidado de no perforar a través del otro lado de la diáfisis; La ventana cortical tiene que ser sólo ~ 2 mm de profundidad y se hará cuando noSe siente resistencia.
- Como anteriormente, mantenga la pierna firmemente con la otra mano.
NOTA: Se puede usar una fresa dental para este paso. Sin embargo, si se utiliza una fresa dental, la pierna debe ser mantenida muy firmemente para hacer una ventana cortical limpia y para asegurarse de que la broza agarra y corta el hueso en el lugar deseado. Se recomienda un pasador Steinmann para este paso, dada su capacidad de corte mucho superior.
- Dab la ventana cortical con gasa, como el sangrado ligero se espera.
6. Creación de la lesión en la placa de crecimiento
- Cree una lesión en el taladro a través de la placa de crecimiento central usando una fresa dental de 1,8 mm unida a una herramienta giratoria.
NOTA: La profundidad, el ángulo y la dirección apropiados son críticos para interrumpir la placa de crecimiento central ( Figura 1C y D ). A continuación se indican las instrucciones para obtener la profundidad, ángulo y dirección apropiados.- Para medir la profundidad apropiada usando la fresa dental, begiN alineando el extremo de la fresa dental con la tibia proximal, donde el semitendinosus cruza la cápsula de rodilla ( Figura 1C ).
- Con el extremo de la fresa dental en la cápsula de rodilla, siga el eje de la fresa a lo largo del semitendinoso y tome nota de donde la fresa se alinea con la ventana cortical. Esta es la profundidad apropiada para que la fresa altere completamente la placa de crecimiento sin alterar la superficie articular ( Figura 1C ).
NOTA: La fresa dental se usa para medir la profundidad apropiada. La fresa puede marcarse con un marcador permanente en el lugar donde se alinea con la ventana cortical para hacer referencia a la profundidad durante la perforación. Sin embargo, si los marcadores anatómicos y el protocolo anterior están estrechamente referenciados, el primer bisel en las fresas dentales especificadas aquí (FG6) se alineará apropiadamente con la ventana cortical (como se ve en la Figura 1C ). - Para lograr el ángulo de perforación adecuado, sujete la herramienta giratoria en un ángulo de menos tHan 30 ° con respecto a la diáfisis tibial.
NOTA: Esta es una aproximación visual. - Para alcanzar la dirección apropiada del taladro, apunte hacia el ángulo de la placa de crecimiento ( Figura 1C ). Dibuje una línea visual a lo largo de la fresa dental hasta el ángulo de la placa de crecimiento para ayudar a crear un defecto central.
- Encienda la herramienta giratoria a 10.000 RPM (velocidad baja de la herramienta giratoria especificada en la sección de materiales) antes de entrar en la ventana cortical.
- Con la herramienta giratoria en un ángulo y dirección apropiados, entre en la ventana cortical y empuje la herramienta giratoria hasta que el marcador de la fresa se alinee con la ventana cortical. Una vez que se ha alcanzado la profundidad adecuada, retire la herramienta giratoria.
NOTA: Realice la interrupción de la placa de crecimiento en un movimiento rápido, usando un tiempo mínimo con la fresa en la placa de crecimiento para crear una lesión limpia. Esto es importante para el análisis de datos.
- Dab la ventana cortical con gasa para ~ 30 s, como se espera sangrado.
- Asegure la profundidad apropiada de la lesión midiendo nuevamente la longitud de la fresa (paso 6.1.2).
- Inserte la fresa en el taladro (con la herramienta rotativa apagada) y alinee la fresa marcada con la ventana cortical ( Figura 1D ).
- Si la profundidad es inadecuada, gire la herramienta giratoria y presione la profundidad deseada.
NOTA: Aunque una segunda ronda de perforación no es ideal, la interrupción total de la placa de crecimiento es primordial para el desarrollo de la barra ósea. - Enjuague la pista de perforación con ~ 3 ml de solución salina estéril usando una jeringa de 10 ml y una aguja de calibre 23.
- Seque la herida con gasa.
7. Procedimientos posteriores a la lesión
- Si se evalúa un tratamiento de placa de crecimiento a base de biomaterial, inyectar el biomaterial a través de la pista de perforación en el sitio de la lesión utilizando una aguja de tamaño adecuado (calibre de 18 a 26, dependiendo de la viscosidad del biomaterial).
NOTA: El volumen de la lesión en la placa de crecimiento es ~ 3 & #181; L, y el volumen de la pista de perforación es ~ 20 μL. El volumen máximo de material que se puede inyectar en la lesión de la placa de crecimiento y la pista de perforación está entre 20 y 25 μL. - Cierre la herida suturando la fascia con suturas de ácido poliglicólico 3-0. Aplique cera ósea sobre la ventana cortical para aislar el hueso subyacente (opcional).
- Cierre la incisión de la piel con suturas enterradas o clips de herida.
NOTA: Los clips de la herida se recomiendan, ya que el animal arañará el sitio de lesión y puede abrir la herida. - Retire el animal de la anestesia con isoflurano, colóquelo sobre una manta de calentamiento y vigírelo hasta que esté despierto.
- Para reducir el riesgo de infección, coloque el animal en una nueva jaula que contenga ropa de cama seca en autoclave.
- Permitir que el animal soportar el peso post-operatorio.
- Vigilar el animal cada 12 h durante 72 h después de la cirugía para comprobar si hay signos de infección, asegurarse de que los clips de la herida permanecen en su lugar y administrar postoperativ(Por ejemplo, buprenorfina a 0,05 mg / kg cada 12 h durante 36 h y carprofeno a 5 mg / kg cada 24 h durante 72 h).
- Retire los clips de la herida 10 - 14 días después de la cirugía bajo anestesia.
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Representative Results
El éxito de la lesión en la placa de crecimiento utilizando este método implica la interrupción del centro de la placa de crecimiento tibial sin alterar la superficie del cartílago articular. Se ha informado que el tejido de reparación ósea comienza aproximadamente a los 7 días después de la lesión y se desarrolla completamente 28 días después de la lesión 13 , tal como se visualiza mediante micro tomografía computarizada (micro TC) ( Figura 2 ). Aunque estos puntos de tiempo se eligieron aquí para mostrar el inicio y la maduración de la formación ósea sobre la base de datos publicados previamente, otros puntos de tiempo se pueden utilizar para investigar las diversas etapas del proceso de reparación, desde el día 1 a 6 meses después de la cirugía 17 . La Tabla 1 da una visión general de la formación de volumen óseo dentro de placas de crecimiento de rata lesionadas quirúrgicamente 28 días después de la cirugía de tres ejecuciones independientes proporcionando (1) la fracción de volumen óseo dentro de toda la placa de crecimiento y (2) la boNe fracción de volumen dentro de la zona de tejido de reparación sólo 15 . Los datos se informan como el porcentaje medio ± la desviación estándar e indican que se obtuvieron resultados similares entre las ejecuciones independientes. La varianza entre las diferentes series se analizó mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y no mostró diferencias estadísticamente significativas entre las series, lo que sugiere la reproducibilidad del modelo. Se utilizó la hematoxilina azul Alcian (ABH) con contraste de naranja G / Eosina 18 para mostrar histológicamente una variedad de tejidos de reparación en diferentes etapas de formación de barra ósea ( Figura 2 ). Usando esta mancha histológica, se pueden identificar y cuantificar diferentes tipos de tejido de reparación, incluyendo mesénquima, cartilaginosas, trabéculas óseas y médula ósea 16 .
Pueden surgir varios problemas al seguir incorrectamente los procedimientos anteriores. Un insuficiente Nt no perturbarán la placa de crecimiento, lo que resultará en poca o ninguna formación de barra ósea. La interrupción de la superficie del cartílago articular crea una lesión mayor que puede introducir cartílago articular en el sitio de la lesión de la placa de crecimiento, lo que complica el proceso de cicatrización ( Figura 3A ). Interrumpir la placa de crecimiento en un ángulo o dirección inadecuada da como resultado una lesión no central ( Figura 3B ). En este caso, la formación de barra ósea seguirá ocurriendo, aunque será lateral o medial a la ubicación deseada. En general, el tejido de reparación formado después de la lesión en la placa de crecimiento puede analizarse de diversas maneras, incluyendo microCT, PCR cuantitativa, tinción histológica e inmunohistoquímica. Además de las mediciones histológicas y moleculares, la longitud de los miembros y las mediciones de la placa de crecimiento proporcionan una medida importante del crecimiento del hueso entero. Se ha reportado que las extremidades afectadas experimentan una reducción del crecimiento en comparación con las extremidades de control no lesionadas> 13. Longitud de la extremidad se puede medir en diferentes momentos a lo largo del curso del estudio utilizando microCT imágenes para investigar la longitud de las extremidades discrepancias [ 14] . Ejemplos de puntos de tiempo utilizados anteriormente incluyen 28 días y 56 días después de la lesión. Mediciones de la placa de crecimiento, incluyendo la altura total, las alturas zonales, y la formación de la correa, también puede proporcionar información importante sobre el proceso de reparación de tejidos [ 13 , 14 , 15] . Idealmente, se deben tomar las longitudes de las extremidades y las mediciones de la placa de crecimiento antes de la cirugía para tener un valor basal. Para dilucidar más los mecanismos biológicos o para probar la eficacia de un tratamiento, los grupos de control apropiados deben ser diseñados e incluir miembros no afectados y extremidades que se sometieron a cirugía pero no se tratan.
Los biomateriales también se pueden probar en este modelo de lesión de la placa de crecimiento. Como ejemplo, un chiTosan microgel 19 se inyectó en el sitio de la lesión de la placa de crecimiento, como se describe en el paso 7.1, y se ve claramente en el sitio de lesión en la Figura 4 . El análisis subsiguiente puede implicar la determinación de los efectos del biomaterial sobre la composición del tejido de reparación, la longitud de la extremidad y las mediciones de la placa de crecimiento, como se discutió anteriormente.
Figura 2. Disrupción exitosa de la placa de crecimiento y formación de barras óseas.
La formación de barras óseas se observa a los 7 días después de la lesión con microCT y se confirma a través de la tinción con hematoxilina azul Alcian (ABH). La barra ósea está completamente madura el día 28 después de la lesión, como se observa con la tinción con microCT y ABH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Resultados potenciales de la perforación incorrecta.
A) El taladrar demasiado lejos a través de la tibia puede alterar la superficie articular, lo que complica el proceso de cicatrización y puede conducir a resultados no concluyentes. B) La angulación incorrecta de la broca puede conducir a una lesión de la placa de crecimiento no central. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Tratamiento de una lesión de placa de crecimiento con un biomaterial.
La tinción con ABH muestra el microgel de quitosano en la placa de crecimiento lesionada.
| Métrico | Ejecutar 1 | Ejecutar 2 | Ejecutar 3 | Valor de p |
| Fracción de volumen óseo dentro de toda la placa de crecimiento | 9,76 +/- 3,81% | 10,52 +/- 4,06% | 11,93 +/- 2,04% | 0,5493 |
| Fracción de volumen óseo dentro de la zona de tejido de reparación | 41,5 +/- 8,33% | 46,08 +/- 10,12% | 46,77 +/- 8,14% | 0,5128 |
Tabla 1. Datos de fracciones de volumen óseo.
Los datos se obtuvieron a partir de imágenes de micro CT a los 28 días después de la lesión en ratas no tratadas de tres series independientes.
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Discussion
Un modelo de animal de lesión de placa de crecimiento se suma mucho a nuestra comprensión de los mecanismos biológicos de esta lesión, lo que potencialmente conduce a intervenciones terapéuticas más eficaces para los niños que sufren de lesiones en la placa de crecimiento. Para crear con éxito una barra ósea y estudiar su formación in vivo utilizando el modelo presentado en este trabajo, es crítico interrumpir la placa de crecimiento mediante la perforación a una profundidad suficiente, sin interrumpir el cartílago articular. La variación en la implantación quirúrgica entre los animales y, en menor medida, la variación en los marcadores anatómicos puede conducir a resultados problemáticos. Recomendamos practicar los procedimientos descritos anteriormente sobre animales cadáveres para asegurar el éxito de la lesión en la placa de crecimiento antes de realizar el procedimiento para estudios con animales vivos. Aunque los animales cadáveres carecen de flexibilidad tisular y no sangran, el procedimiento de lesión en la placa de crecimiento y las características anatómicas de estos animales serán similares a los de animales vivos. FurtAdemás, la placa de crecimiento tibial cadavérica se puede diseccionar fácilmente, ya que la epífisis se separa de la metáfisis mediante la aplicación de una fuerza ligera y se puede observar la ubicación del taladro. Este análisis rápido permite modificaciones técnicas para conocer la profundidad y la angulación apropiadas del taladro en animales cadáveres, sin necesidad de imágenes.
Cabe señalar que existen otros modelos animales de lesión de la placa de crecimiento. Un defecto transfisario similar se ha realizado en el ratón y llevó a la formación de barras óseas 20 . A pesar de su menor tamaño, también puede usarse para estudiar los mecanismos involucrados en la formación de barras óseas. Coleman et al . Informó sobre otro modelo de rata válida de lesión de la placa de crecimiento, donde un defecto transfisario central se creó en el fémur distal mediante la perforación a través del cartílago articular [ 21] . Este enfoque también condujo a la formación de una barra ósea y las desigualdades longitud de los miembros, como en laModelo presentado aquí. Otros modelos animales de lesión y tratamiento con placa de crecimiento han incluido conejos 22 , cerdos 23 y ovinos 24 . Mientras que los modelos más grandes de lesiones animales pueden representar más de cerca lesiones clínicas, el modelo de rata es útil para la investigación sobre los mecanismos biológicos de las lesiones fisarias. Por ejemplo, el modelo de rata presentado aquí se ha utilizado ampliamente para investigar mecanismos moleculares de lesión fisaria y el proceso de formación de barras óseas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Además, el modelo de rata puede usarse para probar varios tratamientos fisiológicos antes de pasar a modelos animales más grandes. Sin embargo, un reto de este modelo de rata de lesión de placa de crecimiento es que la perforación se realiza dentro del hueso, maEs imposible observar dónde se encuentra el taladro dentro de la placa de crecimiento. Por lo tanto, la interrupción exitosa de la placa de crecimiento en animales vivos sólo puede confirmarse utilizando técnicas de imagen en el momento de la cirugía o evaluando la formación de barras óseas entre 7 y 28 días después de la cirugía. Con la práctica, se puede lograr un alto grado de éxito en la obtención de la formación de barras óseas, pero los estudios tempranos pueden dar lugar a una serie de animales que carecen de formación de una barra ósea, ya sea debido a una placa de crecimiento no dañada oa una insuficiente interrupción del crecimiento plato.
Otra limitación de este modelo es que las lesiones en el taladro no representan lesiones normales de la placa de crecimiento en los niños, que generalmente ocurren debido a la fractura 25 . Las fracturas dentro de la placa de crecimiento se pueden clasificar utilizando el sistema de clasificación Salter-Harris 26 . Las fracturas de placa de crecimiento de tipo III y tipo IV contribuyen más comúnmente a las lesiones fisiológicas queA la formación de barras óseas. El tipo de lesión de la placa de crecimiento que aquí se presenta se relaciona más estrechamente con una lesión de la placa de crecimiento de tipo VI, una clase rara de lesión en la que la fisis se elimina mediante un trauma o una herida de punción. Sin embargo, dado que los mecanismos fisiopatológicos que subyacen a la formación de la barra ósea después de la lesión de la placa de crecimiento siguen siendo esquivos, el modelo de la rata sigue siendo importante para descubrir este proceso con el fin de desarrollar nuevas opciones de tratamiento para los niños que sufren de todos los tipos de lesiones en la placa de crecimiento. El método descrito aquí confiablemente crea una barra ósea y puede usarse para estudiar múltiples aspectos del proceso de reparación de lesiones en la placa de crecimiento in vivo 17 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 . También se ha demostrado que este modelo de rata da como resultado un crecimiento tibial reducido después de la placa de crecimiento enEl jurado 13 , lo que lo convierte en un modelo animal aún más interesante para probar nuevas opciones de tratamiento que conducen a la regeneración de la placa de crecimiento y la potencial restauración de la elongación ósea.
En conclusión, este artículo detalla los métodos para crear un modelo de lesión de placa de crecimiento con el que investigar la formación de barras óseas y los tratamientos potenciales para lesiones de la placa de crecimiento in vivo. Este modelo de rata permite estudios relativamente baratos y rápidos, dado que una barra ósea está completamente madura 28 días después de la lesión en la placa de crecimiento. Además de desarrollar nuestra comprensión de los mecanismos moleculares de la formación de barras óseas in vivo , este modelo puede utilizarse para probar biomateriales que inhiben la formación de barras óseas y fomentar la regeneración del cartílago de la placa de crecimiento.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo financiero del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de premio R03AR068087, el Fondo de Enriquecimiento Académico de la Escuela de Medicina de la Universidad de Colorado y el Centro Gates de Medicina Regenerativa . Este trabajo también fue apoyado por NIH / NCATS Colorado CTSA Grant número UL1 TR001082. Los contenidos son de exclusiva responsabilidad de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel handle | McKesson | MCK42332500 | |
| Needle holder | Stoelting | RS-7824 | |
| Adson tissue forceps | Sklar | 50-3048 | |
| Iris Scissors | Sklar | 47-1246 | |
| Rotary Tool | Dremel | 7700 | Variable speed rotary tool |
| Keyless Rotary Tool Chuck | Dremel | 4486 | |
| Dental Burs | Dental Burs USA | FG6 | Round carbide bur, ≤2mm |
| Steinmann pins | Simpex Medical | T-078 | |
| Hair clippers | Wahl | 5537N | |
| 3-0 PGA surutes | Oasis | MV-J398-V | |
| Sterile gauze 2 x 2" | Covidien | 441211 | |
| Povidone Iodine | McKesson | 922-00801 | |
| Sterile saline | Vetone | 510224 | |
| 10 mL luer lock syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 23 gauge needle | Becton Dickinson | 305145 | |
| Isopropyl alcohol pads | Dynarex | 1113 | |
| Isoflurane | IsoFlo | 30125-2 | |
| Caliper | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Carprofen | Rimadyl | 27180 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals Inc | NDC 42023-179 | |
| Fenestrated Surgical Drape | McKesson | 25-517 | |
| Surgical Gloves | Uline | S-20204 | |
| #15 Scalpel Blade | Aven | 44044 | |
| 9 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Reflex clip applier | World Precision Instruments | 500345 | |
| Absorbant underpads | McKesson | MON 43723110 | |
| Tec 3 Iso Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| Germinator 500 | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Warm water recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| Absorbent Underpads | Medline Industries | MSC281230 |
References
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