Summary
Büyüme plakası, uzunlamasına büyümenin meydana geldiği çocuk kemiklerinde kıkırdancı bir bölgedir. Yaralandığında, kemikli doku büyümeyi oluşturabilir ve bozabilir. Onarım mekanizmalarının ve büyüme plakası yenilenme stratejilerinin incelenmesine izin veren, kemik onarım dokusuna yol açan bir büyüme plakası hasarı modelini açıklıyoruz.
Abstract
Tüm pediatrik kırıkların üçte biri büyüme plakasını içerir ve kemik büyümesinde bozulmaya neden olabilir. Büyüme plakası (veya fizis), uzunlamasına kemik büyümesinden sorumlu olan çocuklarda tüm uzun kemiklerin sonunda bulunan kıkırdak dokusudur. Hasar gördükten sonra, büyüme plakası içindeki kıkırdak dokusu prematür ossifikasyona uğrayabilir ve istenmeyen kemik onarım dokularına yol açabilir ve bu da "kemikli bar" oluşturur. Bazı durumlarda, bu kemik çubuk, açısal deformasyonlar gibi kemik büyüme bozukluklarına neden olabilir veya uzunlamasına kemik büyümesini tamamen durdurabilir. Halen yaralı bir büyüme plakasını tamir edebilecek herhangi bir klinik tedavi yok. Kemik bar oluşumunun altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak ve onu inhibe etme yollarını belirlemek için bir büyüme plakası hasarı modelini kullanarak büyüme plakası yaralanmaları için daha iyi tedavi geliştirmek için mükemmel bir fırsattır. Bu protokol, bir matkap deliği defekti kullanarak sıçan proksimal tibial büyüme plakasını nasıl bozacağını açıklamaktadır. Bu smaHayvan modeli güvenilir bir şekilde kemikli bir çubuk üretir ve çocuklarda görülen büyüme bozukluklarına benzer sonuçlara neden olabilir. Bu model, kemikli çubuk oluşumunun moleküler mekanizmalarına yönelik araştırmalara izin verir ve büyüme plakası yaralanmalarında potansiyel tedavi seçeneklerini test etmek için bir araç olarak hizmet eder.
Introduction
Büyüme plakası yaralanmaları çocukluk çağı kırıklarının% 30'unu oluşturur ve bozulmuş kemik büyümesine 1 neden olabilir. Kırıklara ek olarak, büyüme plakası yaralanmaları, osteomiyelit 2 , primer kemik tümörleri 3 , radyasyon ve kemoterapi 4 ve iyatrojenik hasar 5 dahil olmak üzere diğer etiyolojilerden kaynaklanabilir. Büyüme plakası (veya fizis), uzunlamasına kemik büyümesinden sorumlu olan çocukların uzun kemiklerinin sonundaki bir kıkırdak bölgesidir. Kemik uzamasını endokondral ossifikasyon yoluyla yönlendirir; Kondrositler çoğalma ve hipertrofiye girerler ve gelen osteoblastlar tarafından trabeküler kemik 6 oluşturmak üzere yeniden modellenirler. Büyüme plakası da gelişmekte olan iskeletin zayıf bir bölgesidir, bu da yaralanmaya eğilimlidir. Büyüme plakası kırıkları veya yaralanmaları ile ilgili en büyük sorun, büyüme plakası içindeki hasar görmüş kıkırdak dokularının bE "kemik çubuk" olarak da bilinen istenmeyen kemik onarımı dokusu ile değiştirildi. Büyüme plakasındaki büyüklüğüne ve konumuna bağlı olarak, kemik çubuk açısal deformitelere veya büyümenin tamamen durdurulmasına, hatta henüz tam boylarına ulaşamayan küçük çocuklar için yıkıcı bir sekilde yol açabilir.
Şu anda yaralı bir büyüme plakasını tamir edebilecek hiçbir tedavi mevcut değil. Kemik çubuğu oluştuktan sonra, klinisyen cerrahi olarak çıkarılmasına karar vermelidir 8 . En az 2 yıl veya 2 cm iskelet büyümesi geride kalan ve kemik çubukla büyüme plağı alanının% 50'sinden azını kapsayan hastalar genellikle kemik çubuk rezeksiyonu için adaylardır. Kemik çubuğunun cerrahi olarak çıkarılması, kemikli dokunun yeniden düzenlenmesini önlemek ve çevredeki yaralı büyüme plakasının büyümeyi düzeltmesine izin vermek için genellikle bir otolog yağ grefti yerleştirilir. Ancak, bu teknikler problEmatik ve sıklıkla başarısız olur ve kemik bar tekrarlamasına ve büyümeye olumsuz etkide bulunmaya devam eder 9 . Kemik bar oluşumunu önlemenin yanı sıra büyüme plakası kıkırdağını yeniden üreten, böylece normal kemik uzatmasını geri kazandıran etkili tedavilerin geliştirilmesine kritik bir ihtiyaç vardır.
Kemik bar oluşumunun altında yatan moleküler mekanizmalar henüz aydınlatılmamıştır. Bu biyolojik mekanizmaların daha iyi anlaşılması büyüme plakası yaralanmalarından muzdarip çocuklar için daha etkili terapötik girişimlere yol açabilir. Bu mekanizmaları insanlarda incelemek zordur, hayvan modelleri, özellikle büyüme plakası hasarı sıçan modeli kullanılmıştır. 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Burada sunulan yöntemKağıtta, fare tibial büyüme plakasındaki bir matkap deliği kusurunun, hasardan sonra en erken 7 gün içinde ossifikasyona başlamasını ve yaralanmadan sonraki 28 gün içinde yeniden şekillendirilmesiyle tamamen olgun bir kemik çubuğu oluşturduğu öngörülebilir ve tekrarlanabilir onarım dokusuna nasıl yol açtığı açıklanmaktadır. Bu, kemikli çubuk oluşumunun biyolojik mekanizmalarının incelenmesinde ve kemik çubuğunu önleyebilecek ve / veya büyüme plakası kıkırdakını yenileyebilecek yeni tedavileri değerlendirebilecek küçük bir hayvan in vivo modelini sağlar. Örneğin, bu model, büyüme plakası kıkırdağını yeniden canlandırabilir ve büyüme plakası yaralanmalarına maruz kalan çocuklar için değerli tedavi sunabilen kondrojenik biyomalzemeleri test etmek için kullanılabilir. Bu yazıda sunulan teknikler, büyüme plakası hasarını üretmek için kullanılan cerrahi yöntemleri ve biyomalzemelerin yaralanma bölgesine teslim edilmesini anlatacaktır. Ayrıca kemik çubuk oluşumunu değerlendirmek ve dokuyu onarmak için yöntemleri tartışacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvansal prosedürler yerel Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Aşağıdaki prosedür için hayvan protokolü Colorado Denver IACUC Üniversitesi tarafından onaylandı.
1. Sıçanları Elde Edin
NOT: Genetiği değiştirilmiş hayvanlar arzu edilmedikçe, ameliyat sırasında 6 haftalık, iskelet bakımından olgunlaşmamış Sprague-Dawley farelerine ihtiyaç duyulmaktadır. Diğer suşlar potansiyel olarak kullanılabilir; Bununla birlikte, yayınlanan çalışmaların çoğunluğu Sprague-Dawley sıçanlarında yapılmıştır.
2. Cerrahi Malzemelerin Hazırlanması
- Aşağıdakilerden her birini içeren otoklav cerrahi besleme paketleri: # 3 neşter kulp, iğne tutucu, Adson forseps ve iris makası.
- Anahtarsız matkap uçlarını otoklavlayın. Matkap mandreni, birden fazla hayvanda çalışırken hayvan ameliyatları arasında boncukla sterilize edilebilir.
NOT: Steril cerrahi kullanımıyla ilgili yerel IACUC kurallarıBirden fazla hayvana ait araçlara uyulmalıdır. Örneğin, Colorado Denver Üniversitesi IACUC, kesilmeden önce 5 hayvana kadar bir cerrahi alet seti kullanılmasına izin verir. Ayrıca, cerrahi aletler, hayvanlar arasında bir boncuk sterilizatör kullanılarak ısı ile sterilize edilmelidir. Ek hayvanlar için ilave steril cerrahi paketler kullanılmalıdır. - Otoklav 5 cm Steinmann pimleri, her hayvan için bir adet.
NOT: Enfeksiyon riskini azaltmak için, Steinmann pimleri birden fazla hayvan için kullanılmamalıdır. - Otoklav 1.8 mm çapında diş hekimleri, her hayvana bir tane.
NOT: Enfeksiyon riskini azaltmak için diş fırçaları birden fazla hayvan için kullanılmamalıdır. - Varsa, bir yara kırpma aplikatörü otoklavlayın. Alternatif olarak, gömülü dikişler kutanöz tabakayı kapatmak için kullanılabilir. Bkz. Adım 7.3.
- Mümkünse, bir döner matkabı ışınlama veya gaz sterilizasyonu kullanarak sterilize edin.
- Aşağıdaki ek malzemeleri toplayın: elektrikli tıraş makinesi, steRil 3-0 poliglikolik asit dikişleri, steril gazlı bez, povidon iyot, steril salin, steril 10 mL enjektörler, steril 23-gauge iğneler, izopropil alkol çubukları, isofluran, kaliperler, cerrahi sonrası analjezikler ( örn., NSAID'ler ve buprenorfin) Steril cerrahi örtüler, steril cerrahi eldivenleri, steril # 15 bistüriye bıçakları, steril yara klipsleri, anestezi makinesi, boncuk sterilizatörü, ısıtma yastığı ve emici tabanlıklar.
3. Anestezi ve Hayvanların Hazırlanması
- Hayvanı, pasif temizleme sistemi ile buharlaştırıcı bir sistemden% 5 izofluran ile 1 L / dakika oksijen akışı alan 1 ila 2 L'lik bir indüksiyon hücresine sokarak anestezi uygulayın.
NOT:% 5 izofluran'a maruz kalma, 6 haftalık fareleri 5 dakika içinde anestezi altına almalıdır. - Hayvanı ameliyathaneye taşıyın ve hayvanı, işlemin geri kalan kısmı için bir burun konisi kullanarak% 2-3 izofluran ile anestezi altında tutun. Hayvancı yatağı bir ısıtma pedi üzerine yerleştirin ve bir emiciEnt underpad.
NOT: Hayvanın ameliyat masasına sabitlenmesi gerekmez. Aşağıdaki basamaklarda belirtildiği şekilde bacak tutulması, yeterli stabilizasyon yöntemidir.
NOT: Daha sonraki tüm işlemler hayvanla anestezi altında yapılacaktır. Bu yaştaki sıçanlarda% 2-3 izofluran, anesteziyi korumak için yeterli olmalıdır. Bu, iki aşamalı geri çekilme refleksinin test edilmesi ile doğrulanabilir. - İntraoperatif analjezikleri, kurumsal olarak onaylanmış politikalara ( örn . 0.05 mg / kg buprenorfin ve 5 mg / kg karprofen) uygun olarak uygulayın.
4. Cerrahi için Tibia'nın hazırlanması
- Tüm arka bacak (lar) ı medial malleolden pelvise elektrikli bir tıraş makinesi ile tıraş edin.
- Kalibreyi kullanarak ön tibial platodan medial malleolusun alt tarafına kadar tibialin uzunluğunu ölçün ve kaydedin. Alternatif olarak, tüm tibial uzunluğunu X ışını veya mikroCT 11 Sup> , 12 , 14 . İsteğe bağlı olarak, X-ray veya microCT kullanılarak cerrahi öncesi büyüme plakası boyutlarını ölçün.
- Tüm bacak (lar), karın ve genital bölgeyi alkollü çubuklarla ve daha sonra povidon iyotla ıslatılmış gazlı bezle silinerek cerrahi alanı temizleyin.
NOT: Enfeksiyon riskini en aza indirgemek için, hayvanlar anesteziden çıkarılıncaya kadar (adım 7.4) tüm sonraki prosedürler, steril koşullar altında yapılmalıdır. Tüm cerrahi materyallere steril teknik kullanılarak erişilmelidir. Ameliyat boyunca sterilliği korumak için bir cerrahi asistanın kullanılması çok önemlidir. - Steril cerrahi eldivenler giyerek, fenere steril bir cerrahi örtüyü hayvanın üzerine yerleştirin, bacak (lar) merkezi fenestrasyona maruz bırakın.
5. Büyüme Plakasına Ulaşmak İçin Cerrahi Prosedür
_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
Şekil 1: Cerrahi Prosedürüne Genel Bakış.
A) Başarılı bir büyüme plakası hasarı yaratmak için kullanılan birkaç anatomik belirteçin yeri. Diz kapsülü, tibianın femurdan ayrıldığı diz kapağının hemen arkasında (beyaz). Tibia büyüme plakası (koyu kırmızı) diz kapağının altında görülebilir ve tibi kapatmaz. Proksimal büyüme plakası, diyagonal bir düzlem oluşturan ön çeyrek hariç, çoğunlukla düz bir düzlemdir. Bu iki düzlemin kesişimi, uygun matkap açılışı için kullanılan büyüme plakası açısını oluşturur. Semitendinosus yerleştirilmesi, kuadriseps kasının posterior tibia içerisine yerleştirildiği yerdir. B) Kortikal kemiğe erişmek için tibial yumuşak dokuların anterior-medial yönden kesilmesi. C) Kortikal pencerenin distal semitendinosus yerleştirme referans noktası olarak hizalanmasını kullanarak yerleştirilmesi. D) DeğerlendirmeYaralanma derinliğini, diş fırçasındaki eğimi cortical pencere ile hizalayarak.
- Medial femur kondilinin distal ucundan başlayarak # 3 bistüri sapı ve # 15 bıçağı kullanarak proksimal tibianın medial-anterioru boyunca cilt boyunca ~ 1 cm'lik bir insizyon yapın ( Şekil 1A ).
- Deriyi altta yatan kemiğe karşı sıkıca çekin ve kesi yaparken bacağınızı sıkıca tutun.
NOT: Bu cilt insizyonunu istenilen yerde tutacak ve temiz bir insizyon oluşturulmasına yardımcı olacaktır. Diz kapsülünü delmekten kaçınmak için omurga ile çok sıkı bastırmayınız, bu da bol miktarda kanama ile sonuçlanacak ve kalan adımları zorlaştıracaktır.
- Deriyi altta yatan kemiğe karşı sıkıca çekin ve kesi yaparken bacağınızı sıkıca tutun.
- 1) büyüme plakası, 2) büyüme plakası açısı, 3) diz kapsülü ve 4) semitendinosus yerleştirilmesi ( Şekil 1A ) gibi önemli anatomik belirteçleri not edin.
- Neşteri kullanarak, ~ 0.5 cm'lik bir insizyon yapın.E fascia ve yumuşak dokuları proksimal tibianın medial-anterior kısmında, büyüme plakasından cilt insizyonunun tabanına ( Şekil 1B ) çıkarın.
- Disiğin cübpe yardımıyla fascia ve yumuşak dokuları tibia'dan hafifçe ayırın veya kazının ( Şekil 1B ).
NOT: Sondaj adımlarına müdahale etmemek için mümkün olduğunca tibiadan çok yumuşak doku çıkarmak veya kazmak önemlidir. - Dinamik diyafizde tibial kortikal kemiğin içinden 10.000 RPM'de bir döner alete bağlı Steinmann pimi ile (materyal bölümünde belirtilen döner aletin düşük hızı) kortikal bir pencere açınız. Korteks penceresini, distal semitendinosus yerleştirilmesi ile hizalanacak şekilde oluşturun ( Şekil 1C ).
- Matkabı tibial diyafiz dikey olarak tutun ve diyafizin diğer tarafından geçirmemeye özen göstererek yavaşça delin; Kortikal pencere sadece ~ 2 mm derinlikte olmalı ve yok olduğunda yapılmalıdırDireniş hissediliyor.
- Yukarıdaki gibi, diğer elinizle bacağınızı sıkıca tutun.
NOT: Bu adım için bir diş fırçası kullanılabilir. Bununla birlikte, bir dental burun kullanılıyorsa, bacak temiz bir korteks penceresi oluşturmak için ve buranın kemiğin istenen yerde kavranmasını ve kesilmesini sağlamak için sıkıca tutulmalıdır. Üstün kesme kabiliyeti göz önüne alındığında, bu adım için bir Steinmann pimi önerilir.
- Hafif kanamalar beklendiğinden, korteks penceresini gazlı bezle ıslatın.
6. Büyüme Plakası Zedelenmesinin Oluşturulması
- Dönen bir alete takılı olan 1.8 mm'lik bir diş fırını kullanarak merkezi büyüme plakası aracılığıyla delik deliği yaralanması oluşturun.
NOT: Doğru derinlik, açı ve yön merkezi büyüme plakasını bozmakta kritiktir ( Şekil 1C ve D ). Uygun derinlik, açı ve yön elde etmek için talimatlar aşağıda verilmiştir.- Diş burunu kullanarak uygun derinliği ölçmek için, begiDiş burunun ucunu, semitendinosus diz kapsülünü geçtiği proksimal tibi ile hizalayarak ( Şekil 1C ).
- Diz kapsülündeki diş burun ucuyla, semitendinoz boyunca bur şaftını takip edin ve burun kortikal pencereyle hizalandığına dikkat edin. Burun, eklem yüzeyini bozmadan büyüme plakasını tamamen bozmak için uygun derinliktir ( Şekil 1C ).
NOT: Dental bur, uygun derinliği ölçmek için kullanılır. Delme sırasında derinlik referans alınması için korteks penceresiyle hizalandığı yerde kalıcı bir markörle işaretlenebilir. Bununla birlikte, anatomik belirteçler ve yukarıdaki protokollere yakından bakıldığında, burada belirtilen diş burçları üzerindeki ilk eğim (FG6), kortikal pencereyle uygun şekilde hizalanacaktır ( Şekil 1C'de görüldüğü gibi). - Uygun matkap ucu elde etmek için döner aleti daha az bir açıda tutunTibia diafizine göre 30 ° dir.
NOT: Bu görsel bir yaklaşımdır. - Uygun matkap yönüne ulaşmak için, büyüme plakası açısını hedefleyin ( Şekil 1C ). Merkezi bir kusur yaratmaya yardımcı olması için büyüme plakası açısına diş çubuğu boyunca görsel bir çizgi çizin.
- Dönme aletini, korteks penceresine girmeden önce 10,000 RPM'ye (malzeme bölümünde belirtilen döner aletin düşük hızı) kadar açın.
- Döner aleti uygun bir açı ve yönde iken korteks penceresine girin ve bur işaretleyicisi korteks penceresine hizalanana kadar döner aleti itin. Doğru derinlik elde edildikten sonra, döner aleti çıkarın.
NOT: Temiz bir yaralanma yaratmak için büyüme plakasındaki boşlukla en az zaman kullanarak büyüme plakası parçalanmasını tek bir hızlı harekette gerçekleştirin. Bu, veri analizi için önemlidir.
- Kanamanın beklendiği gibi, kortikal pencereyi gazlı bezle 30 saniye boyunca boşaltın.
- Bur uzunluğunu tekrar ölçerek yaranın uygun derinliğini sağlayın (adım 6.1.2).
- Burayı matkap ucu içine yerleştirin (döner aleti kapatın) ve işaretli ucu korteks penceresiyle hizalayın ( Şekil 1D ).
- Derinlik yetersizse, döner aracı açın ve istediğiniz derinliğe itin.
NOT: Sondaj işleminin ikinci turu ideal değilse de, büyüme plakasını tamamen bozmak kemik çubuğun gelişiminde büyük önem taşır. - 10 mL'lik bir şırınga ve 23 ölçerlik bir iğne kullanarak ~ 3 mL'lik steril salinle matkap ucu durulayın.
- Yarayı gazlı bezle kurutun.
7. Hasar Sonrası İşlemler
- Bir biyomalzeme esaslı büyüme plakası muamelesini değerlendirirken, biyomateryali uygun ölçülerde bir iğne (biyomateryal viskozitesine bağlı olarak 18 ila 26 gauge) kullanarak hasar alanına sondaj pisti boyunca enjekte edin.
NOT: Büyüme plakası hasarının hacmi ~ 3 & #181; L ve matkap ucu hacmi ~ 20 mcL'dir. Büyüme plakası hasarına ve matkap ucuna enjekte edilebilecek maksimum malzeme hacmi 20 ila 25 μL arasındadır. - Kemeri 3-0 poliglikolik asit sütürlerle dikerek yarayı kapatın. Altta yatan kemiğin izole edilmesi için korteks penceresinin üzerine kemik mumu uygulayın (isteğe bağlı).
- Gömülü dikişler veya yara klipsleri ile deri kesiini kapatın.
NOT: Hayvan yaralanma yerinde çizilecek ve yarayı açabileceğinden yara klipsleri önerilir. - Hayvanı izofluran anesteziden çıkarın, onu bir ısınan battaniye üzerine koyun ve uyanana kadar izleyin.
- Enfeksiyon riskini azaltmak için hayvanı, kuru, otoklavlanmış yatak içeren yeni bir kafese yerleştirin.
- Ameliyat sonrası hayvanın kilo almasına izin verin.
- Hayvan her 12 saatte ameliyattan 72 saat sonra, enfeksiyon işaretlerini kontrol etmek, yara klipslerinin yerinde kalmasını sağlamak ve postoperativ uygulamak için kontrol edin( Örn. Buprenorfin 0,05 mg / kg'de her 12 saatte 36 saat; karprofen 5 mg / kg'da her 24 saatte 72 saat).
- Anestezi altında ameliyattan 10-14 gün sonra yara klipslerini çıkartın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemi kullanarak başarıyla büyüme plakası yaralanması, eklem kıkırdak yüzeyini bozmadan tibial büyüme plakasının merkezinin bozulmasını içerir. Kemik tamir dokusunun yaralanmadan yaklaşık 7 gün sonra başladığı bildirilmiştir ve hasar sonrası 28 gün sonra tam olarak gelişmiştir (mikro bilgisayarlı tomografi (mikro CT) ile görselleştirildiğinde) ( Şekil 2 ). Her ne kadar bu zaman noktaları, önceden yayınlanmış verilere dayanılarak kemik oluşumunun başlangıcını ve olgunlaşmasını göstermek için seçilmiş olsa da, ameliyat sonrası 1. ila 6. aylar arasındaki onarım sürecinin çeşitli evrelerinde araştırılmak üzere başka zaman noktaları kullanılabilir. Tablo 1 , (1) tüm büyüme plakası içinde kemik hacmi fraksiyonu ve (2) kemik hacmi fraksiyonunun sağlanmasıyla ameliyattan 28 gün sonra ameliyat sonrası yaralanan sıçan büyüme plakaları içindeki kemik hacmi oluşumuna genel bir bakış sunar.Ne onarımı doku alanı içindeki hacim fraksiyonu sadece 15 . Veriler, ortalama ± standart sapma olarak rapor edilir ve bağımsız çalıştırmalar arasında benzer sonuçların elde edildiğini gösterir. Farklı çalışmalarda farklılık, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile analiz edildi ve modeller arasında tekrarlanabilirlik olduğunu düşündüğünde, koşular arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığını gösterdi. Turuncu G / Eozin kontrast 18 ile Alcian blue hematoxylin (ABH), kemik çubuk oluşumunun farklı evrelerinde çeşitli tamir dokularını histolojik olarak göstermek için kullanıldı ( Şekil 2 ). Bu histolojik boyayı kullanarak, mezenkimal, kıkırdasöz, kemikli trabeküller ve kemik iliği dahil olmak üzere farklı onarım dokusu türleri tanımlanabilir ve nicelleştirilebilir 16 .
Yukaridaki prosedürleri hatalı takip ederek çeşitli problemler ortaya çıkabilir. Yetersiz biri Nt matkap derinliği, büyüme plakasını bozmaz, bu da kemik çubuk oluşumunu çok az veya hiç sağlamaz. Eklem kıkırdağı yüzeyinin bozulması eklem kıkırdağı büyüme plakası hasar alanına ekleyebilen daha büyük bir hasar oluşturarak iyileşme sürecini zorlaştırır ( Şekil 3A ). Büyüme plakasını uygun olmayan bir açı veya yönde bozmak merkezi olmayan bir yaralanmaya neden olur ( Şekil 3B ). Bu durumda, kemik çubuk oluşumu istenen yere yanal veya medial olmasına rağmen yine de ortaya çıkacaktır. Genel olarak, büyüme plakası hasarından sonra oluşan doku onarımı, mikroCT, kantitatif PCR, histolojik boyama ve immünohistokimya da dahil olmak üzere çeşitli şekillerde analiz edilebilir. Histolojik ve moleküler ölçümlere ek olarak ekstremite uzunluğu ve büyüme plakası ölçümleri, tüm kemik büyümesinin önemli bir ölçüsüdür. Etkilenen bacaklarda yaralanmamış kontrol ekstremitelerine kıyasla büyüme azalması görüldüğü bildirilmiştir> 13. Koltuk altı uzunluğu tutarsızlıklarını araştırmak için, mikroCT görüntüleri kullanarak, çalışma boyunca farklı zaman noktalarında bacak uzunluğu ölçülebilir. Daha önce kullanılan zaman noktalarının örneklerine yaralanmadan 28 gün ve 56 gün dahildir. Toplam yükseklik, zon yükseklikleri ve bağ oluşumu da dahil olmak üzere büyüme plakası ölçümleri, doku onarımı işlemi 13 , 14 , 15 hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. İdeal olarak, ekstremite uzunlukları ve büyüme plakası ölçümleri, ameliyattan önce temel değere sahip olmalıdır. Biyolojik mekanizmaları daha da aydınlatmak veya bir tedavinin etkinliğini test etmek için uygun kontrol grupları tasarlanmalı ve cerrahi müdahale edilmeden etkilenmemış ekstremiteler ve ekstremiteler kullanılmalı ve tedavi edilmedi bırakılmalıdır.
Biyomalzemeler, bu büyüme plakası hasar modelinde de test edilebilir. Bir örnek olarak, bir chiTosan mikrojel 19 , aşama 7.1'de tarif edildiği gibi büyüme plakası hasar bölgesine enjekte edildi ve açıkça Şekil 4'teki yaralanma yerinde görülüyor. Sonraki analiz, daha önce de tartışıldığı gibi, biyomateryalin onarım doku kompozisyonu, ekstremite uzunluğu ve büyüme plakası ölçümleri üzerindeki etkilerinin belirlenmesini içerebilir.
Şekil 2. Başarılı Büyüme Tabakının Kesilmesi ve Kemikli Bar Oluşumu.
Kemik bar oluşumu yaralanmadan 7 gün sonra mikroCT ile görülür ve Alcian blue hematoxylin (ABH) boyaması ile doğrulanır. Kemik bar mikroCT ve ABH lekelenmesiyle görüldüğü gibi yaralanma sonrası 28 güne kadar tamamen olgunlaşır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3. Hatalı Sondajın Potansiyel Sonuçları.
A) Tibia üzerinden çok fazla delik açılması eklem yüzeyini bozabilir, bu da iyileşme sürecini zorlaştırır ve sonuçsuz sonuçlar doğurabilir. B) Matkapın yanlış angülasyonu merkezi büyüme plakası yaralanmasına neden olabilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4. Bir Büyüme Tabak Hasarının bir Biyomateryal ile Tedavisi.
ABH boyaması yaralı büyüme plakasındaki chitosan mikrojelini gösterir.
| Metrik | Koş 1 | Koş 2 | Koş 3 | P-değeri |
| Tüm büyüme plağı içindeki kemik hacmi fraksiyonu | 9.76 ± 3.81% | 10.52 ± 4.06% | 11.93 ± 2.04% | 0,5493 |
| Tamir dokusu alanındaki kemik hacmi fraksiyonu | 41.5 ± 8.33% | 46.08 ± 10.12% | 46.77 ± 8.14% | 0,5128 |
Tablo 1. Kemik Hacim Kesir Verileri.
Veriler, yaralanmadan 28 gün sonra, üç bağımsız çalıştırılamayan muamele edilmemiş fareler üzerindeki mikro BT görüntülerinden elde edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir büyüme plakası yaralanması hayvan modeli, bu yaralanmanın biyolojik mekanizmaları konusundaki anlayışımıza büyük ölçüde katkıda bulunur ve böylelikle büyüme plakası yaralanmalarından mustarip çocuklar için daha etkili terapötik müdahalelere yol açar. Başarılı bir şekilde bir kemik çubuk oluşturmak ve bu çalışmada sunulan modeli kullanarak in vivo oluşumunu incelemek için, eklem kıkırdak bozmadan, yeterli bir derinliğe delme ile büyüme plakası bozmak için önemlidir. Hayvanlar arasındaki cerrahi uygulamadaki değişiklikler ve daha az oranda anatomik belirteçlerdeki farklılıklar, sorunlu sonuçlara neden olabilir. Canlı hayvan çalışmaları için prosedürü uygulamadan önce başarılı büyüme plakası hasarını sağlamak için kadavra hayvanları için yukarıda özetlenen prosedürleri uygulamayı öneririz. Kadavra hayvanları doku esnekliği eksikliği ve kanaması olmazken, büyüme plakası hasar prosedürü ve bu hayvanlar üzerindeki anatomik özellikler canlı hayvanlara benzer olacaktır. furtBununla birlikte, kadavra tibial büyüme plakası kolaylıkla parçalanabilir, çünkü epifiz hafif kuvvet uygulayarak metafizden ayrılır ve delik deliğinin yeri gözlemlenebilir. Bu hızlı analiz, teknik değişikliklerin, görüntülemeye gerek kalmadan kadavracı hayvanlar üzerinde uygun matkap derinliğini ve açılımını öğrenmesini sağlar.
Büyüme plakası hasarının diğer hayvan modellerinin var olduğuna dikkat edilmelidir. Benzer bir transfizeal defekt farede gerçekleştirildi ve kemikli bar oluşumuna yol açtı. Daha küçük boyutuna rağmen kemik çubuk oluşumunda yer alan mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Coleman ve ark . Eklem kıkırdağı 21 aracılığıyla delici olarak distal femurda merkezi bir transfizeal defekt yaratılmış büyüme plakası yaralanmasına ilişkin geçerli başka bir sıçan modelini bildirdi. Bu yaklaşım aynı zamanda kemikli çubuk ve ekstremite uzunluğu eşitsizliklerinin oluşmasına yol açtı.Burada sunulan model. Büyüme plakası hasarına ve tedavisine ilişkin diğer hayvan modellerinde tavşanlar 22 , domuzlar 23 ve koyun 24 bulunmuştur . Daha büyük hayvan yaralanması modelleri klinik yaralanmaları daha yakından temsil ederken, sıçan modeli fital yaralanmalarının biyolojik mekanizmaları üzerine araştırmalar için yararlıdır. Örneğin, burada sunulan sıçan modeli fitüz hasarının moleküler mekanizmalarını ve kemik bar oluşum süreci 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16'yı araştırmak için kapsamlı bir şekilde kullanılmıştır. Ayrıca sıçan modeli, daha büyük hayvan modellerine geçmeden önce çeşitli fital tedavilerini test etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, büyüme plakası hasarına ilişkin bu sıçan modelinin meydan okuması, sondajın kemik içinde yapıldığıdır.Kral, sondaj deliğinin büyüme plakası içindeki yerini gözlemlemek imkansız. Dolayısıyla, canlı hayvanlar üzerindeki büyüme plakasının başarıyla bozulması ancak ameliyat sırasında görüntüleme teknikleri kullanılarak veya cerrahi sonrası 7 ila 28 gün arasında kemik bar oluşumunun değerlendirilmesi ile teyit edilebilir. Uygulama ile kemikli bar oluşumunda yüksek derecede başarı elde edilebilir ancak erken çalışmalar, yaralı bir büyüme plakası ya da büyümenin yetersiz bozulması nedeniyle kemikli bir çubuk oluşumundan yoksun birkaç hayvanın ortaya çıkmasına neden olabilir plaka.
Bu modelin bir başka kısıtlaması, delik deliği yaralanmalarının çocuklarda normal büyüme plakası yaralanmalarını temsil etmemesi, ki bunlar çoğunlukla kırık nedeniyle meydana gelmektedir25. Büyüme plakasındaki kırıklar, Salter-Harris sınıflandırma sistemi 26 kullanılarak sınıflandırılabilir. Tip III ve tip IV büyüme plakası kırıkları, en yaygın olarak, başta gelen fızık yaralanmalaraKemik bar oluşumuna. Burada sunulan büyüme plakası yaralanma tipi, fizyumun bir travma veya delinme yarası ile çıkarıldığı nadir bir yaralanma sınıfı olan tip VI büyüme plakası hasarıyla yakından ilgilidir. Bununla birlikte, büyüme plakası yaralanmasından sonra kemik çubuk oluşumunun altında yatan patofizyolojik mekanizmalar zor olduğundan, sıçan modeli, büyüme plakası yaralanmalarının her birinden muzdarip çocuklar için yeni tedavi seçenekleri geliştirmek için bu işlemi ortaya çıkarmak için önemini korumaktadır. Burada açıklanan yöntem güvenilir bir şekilde kemikli bir çubuk oluşturur ve in vivo 17 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 büyüme plakası hasar onarım sürecinin çok yönlerini incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu sıçan modelinin, büyüme plakasından sonra tibial büyümede azalmaya neden olduğu gösterilmiştirJüri 13 , büyüme plak yenilenmesine ve kemik uzamasının potansiyel restorasyonuna yol açan yeni tedavi seçeneklerini test etmek için daha ilginç bir hayvan modeli yapıyor.
Sonuç olarak, bu yazıda , in vivo büyüme plakası yaralanmaları için kemikli bar oluşumunu ve potansiyel tedavilerini araştırmak için bir büyüme plakası yaralanması modeli yaratma yöntemleri ayrıntılarıyla anlatılmaktadır. Bu sıçan modeli, bir kemik çubuğun büyüme plakası hasarından 28 gün sonra tamamen olgunlaşması nedeniyle nispeten ucuz ve hızlı çalışmalara izin verir. Kemik bar oluşumunun moleküler mekanizmalarının in vivo moleküler mekanizmalarına dair anlayışımızı geliştirmeye ek olarak, bu model, kemikli bar oluşumunu inhibe eden ve büyüme plakası kıkırdak rejenerasyonunu teşvik eden biyomalzemeleri test etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, R03AR068087 numaralı ödül, Colorado Üniversitesi Tıp Fakültesi Akademik Zenginleştirme Fonu ve Rejeneratif Tıp için Gates Merkezi altında Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Ulusal Artrit ve Kas İskelet ve Cilt Hastalıkları Ulusal Destek Enstitüsünün fon desteğini onayladılar. . Bu çalışma NIH / NCATS Colorado CTSA Hibe Numarası UL1 TR001082 tarafından da desteklenmiştir. İçeriğin içeriği yazarların sorumluluğundadır ve resmi NIH görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel handle | McKesson | MCK42332500 | |
| Needle holder | Stoelting | RS-7824 | |
| Adson tissue forceps | Sklar | 50-3048 | |
| Iris Scissors | Sklar | 47-1246 | |
| Rotary Tool | Dremel | 7700 | Variable speed rotary tool |
| Keyless Rotary Tool Chuck | Dremel | 4486 | |
| Dental Burs | Dental Burs USA | FG6 | Round carbide bur, ≤2mm |
| Steinmann pins | Simpex Medical | T-078 | |
| Hair clippers | Wahl | 5537N | |
| 3-0 PGA surutes | Oasis | MV-J398-V | |
| Sterile gauze 2 x 2" | Covidien | 441211 | |
| Povidone Iodine | McKesson | 922-00801 | |
| Sterile saline | Vetone | 510224 | |
| 10 mL luer lock syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 23 gauge needle | Becton Dickinson | 305145 | |
| Isopropyl alcohol pads | Dynarex | 1113 | |
| Isoflurane | IsoFlo | 30125-2 | |
| Caliper | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Carprofen | Rimadyl | 27180 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals Inc | NDC 42023-179 | |
| Fenestrated Surgical Drape | McKesson | 25-517 | |
| Surgical Gloves | Uline | S-20204 | |
| #15 Scalpel Blade | Aven | 44044 | |
| 9 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Reflex clip applier | World Precision Instruments | 500345 | |
| Absorbant underpads | McKesson | MON 43723110 | |
| Tec 3 Iso Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| Germinator 500 | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Warm water recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| Absorbent Underpads | Medline Industries | MSC281230 |
References
- Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. J Pediatr Orthop. 10 (6), 713-716 (1990).
- Browne, L. P., et al. Community-acquired staphylococcal musculoskeletal infection in infants and young children: necessity of contrast-enhanced MRI for the diagnosis of growth cartilage involvement. AJR Am J Roentgenol. 198 (1), 194-199 (2012).
- Weitao, Y., Qiqing, C., Songtao, G., Jiaqiang, W. Epiphysis preserving operations for the treatment of lower limb malignant bone tumors. Eur J Surg Oncol. 38 (12), 1165-1170 (2012).
- Butler, M. S., Robertson, W. W., Rate, W., D'Angio, G. J., Drummond, D. S. Skeletal sequelae of radiation therapy for malignant childhood tumors. Clin Orthop Relat Res. (251), 235-240 (1990).
- Shapiro, F. Longitudinal growth of the femur and tibia after diaphyseal lengthening. J Bone Joint Surg Am. 69 (5), 684-690 (1987).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Dodwell, E. R., Kelley, S. P. Physeal fractures: basic science, assessment and acute management. Orthopaedics and Trauma. 25 (5), 377-391 (2011).
- Khoshhal, K. I., Kiefer, G. N. Physeal bridge resection. J Am Acad Orthop Surg. 13 (1), 47-58 (2005).
- Hasler, C. C., Foster, B. K. Secondary tethers after physeal bar resection: a common source of failure. Clin Orthop Relat Res. (405), 242-249 (2002).
- Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22 (2), 417-426 (2004).
- Chen, J., et al. Formation of tethers linking the epiphysis and metaphysis is regulated by vitamin d receptor-mediated signaling. Calcif Tissue Int. 85 (2), 134-145 (2009).
- Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).
- Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. The potential role of VEGF-induced vascularisation in the bony repair of injured growth plate cartilage. J Endocrinol. 221 (1), 63-75 (2014).
- Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).
- Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49 (4), 904-912 (2011).
- Su, Y. W., et al. Neurotrophin-3 Induces BMP-2 and VEGF Activities and Promotes the Bony Repair of Injured Growth Plate Cartilage and Bone in Rats. J Bone Miner Res. , (2016).
- Zhou, F. H., Foster, B. K., Sander, G., Xian, C. J. Expression of proinflammatory cytokines and growth factors at the injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 35 (6), 1307-1315 (2004).
- Sayers, D., Volpin, G., Bentley, G. The demonstration of bone and cartilage remodelling using alcian blue and hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry. 63 (1), 59-63 (1988).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. J Pediatr Orthop. 20 (6), 802-806 (2000).
- Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).
- Lee, S. U., Lee, J. Y., Joo, S. Y., Lee, Y. S., Jeong, C. Transplantation of a Scaffold-Free Cartilage Tissue Analogue for the Treatment of Physeal Cartilage Injury of the Proximal Tibia in Rabbits. Yonsei Med J. 57 (2), 441-448 (2016).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156 (2), 128-134 (2012).
- Hansen, A. L., et al. Growth-plate chondrocyte cultures for reimplantation into growth-plate defects in sheep. Characterization of cultures. Clin Orthop Relat Res. (256), 286-298 (1990).
- Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications In Brief: Salter-Harris Classification of Pediatric Physeal Fractures. Clin Orthop Relat Res. , (2016).
- Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries Involving the Epiphyseal Plate. The Journal of Bone & Joint Surgery. 83 (11), 1753 (2001).
- Chung, R., Foster, B. K., Zannettino, A. C., Xian, C. J. Potential roles of growth factor PDGF-BB in the bony repair of injured growth plate. Bone. 44 (5), 878-885 (2009).
- Fischerauer, E., Heidari, N., Neumayer, B., Deutsch, A., Weinberg, A. M. The spatial and temporal expression of VEGF and its receptors 1 and 2 in post-traumatic bone bridge formation of the growth plate. J Mol Histol. 42 (6), 513-522 (2011).
- Chung, R., Cool, J. C., Scherer, M. A., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of neutrophil-mediated inflammatory response in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. J Leukoc Biol. 80 (6), 1272-1280 (2006).
- Chung, R., et al. Roles of Wnt/beta-catenin signalling pathway in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 52 (2), 651-658 (2013).
- Zhou, F. H., Foster, B. K., Zhou, X. F., Cowin, A. J., Xian, C. J. TNF-alpha mediates p38 MAP kinase activation and negatively regulates bone formation at the injured growth plate in rats. J Bone Miner Res. 21 (7), 1075-1088 (2006).
- Arasapam, G., Scherer, M., Cool, J. C., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of COX-2 and iNOS in the bony repair of the injured growth plate cartilage. J Cell Biochem. 99 (2), 450-461 (2006).
