Summary
피부 종양은 모스 (Mohs) 현미경 수술 후 폐기됩니다. 임상 지원 직원이 임상 작업을 방해하지 않고 하류 실험실 응용을위한 피부 종양 ( 예 : 편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색 종) 샘플을 효과적으로 처리하고 저장할 수있는 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.
Abstract
지난 몇 년 동안 피부암 ( 예, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색 종)이 증가 해 왔습니다. 생물 의학 연구를위한 피부 종양 샘플에 대한 병행 요구가있을 것으로 예상됩니다. 그러나 조직 가용성은 생물 저장소를 확립하는 비용과 임상 조작을 방해하지 않는 임상 샘플을 입수 할 수있는 프로토콜이 없기 때문에 제한적입니다. 모스 수술 날짜에 일상적인 임상 절차에 최소한의 영향을 미치는 피부 종양 및 관련 혈액 및 타액 샘플을 수집하고 처리하기위한 프로토콜이 수립되었습니다. Mohs histotechnologist가 생검에서 입증 된 피부 악성 종양에 대한 첫 번째 모스 수술을받는 환자로부터 종양 샘플을 수집하고 가공합니다. 인접한 정상 조직은 수술 종결시 수집됩니다. 수집 할 수있는 추가 샘플은 전혈 및 협측 스왑입니다.. 정상적으로 폐기 된 조직 표본을 활용함으로써 병원에서 실험실 환경을 기반으로 여러 가지 주요 이점을 제공하는 생물 저장소가 생성되었습니다. 여기에는 광범위한 수집 된 샘플이 포함됩니다. 병리학 보고서를 포함하여 확인되지 않은 환자 기록에 대한 접근; 전형적인 기증자의 경우 추적 방문 중에 추가 샘플을 이용할 수 있습니다.
Introduction
암 및 바이오 마커 연구는 우수한 인체 조직 샘플의 공급에 의존하며, 제한된 공급으로 인해 연구 1,2 가 방해 받고 있습니다. 많은 피부 과학 연구는 인간 조직의 사용과 관련된 부적절한 공급, 다양한 품질 및 비용으로 인해 제한됩니다. 대형 전용 바이오 뱅크를 설립하는 데 드는 비용은 약 2 백만 달러로 추정되며, 이러한 비용은 인체 조직을 많은 연구자들이 사용할 수 없게 만듭니다. 또한 연구 샘플을 생성하고 저장하는 과정은 신중하게 실행하지 않으면 임상 조작에 영향을 미치고 환자 치료를 지연시킬 위험이 있습니다. 비용 효과적인 클리닉 기반의 바이오 저장소는 권장되는 모범 사례와 샘플 검증 4 , 5 , 6 에 따라 피부암 샘플에 초점을 맞추고 있습니다.
Mohs 현미경 수술 기술의 목표는 최대한 많은 건강한 조직을 보존하면서 모든 암 조직을 제거하는 것입니다. 이 절차는 종양 조직의 얇은 층을 점진적으로 제거하는 것을 포함합니다. 연속되는 각 레이어는 그의(모든 종양 조직이 제거되었는지 여부를 결정하기 위해 피부과 의사가 종양 조직을 냉동시키고 H & E 염색을 시행 한 후) 논리적으로 검사했다. 환자가 사무실에있는 동안 조직의 후속 층의 절제 및 검사가 실행됩니다. 이 기술은 SCC 9 에 대한 최상의 치료 옵션으로 간주됩니다. 이 시점에서 상처는 닫히고, 치유 및 미용 외관을 향상시키기 위해 인접한 정상 조직 (ANT)을 자주 절제합니다. 따라서 종양 제거 수술은 향후 연구를 위해 조직 학적으로 특성화 된 조직을 수집하는 데 이상적입니다.
종양 조직, 인접한 정상 조직, 타액 및 혈액 샘플을 얻기위한 조달 절차는 정상적인 직원 업무에 미치는 영향을 최소화하도록 설계되었습니다 ( 그림 1 ). 의료 보조원은 절차를 위해 환자를 준비하는 동안 혈액을 채취합니다. 모스 절차 완료 후, M ohs histotechnologist는 표본의 추가 조직 슬라이드를 준비하고 조직을 biorepository에 전송합니다. 바이오 리포지토리 구축과 관련된 비용으로는 냉동 보관 냉동고 구입, 겸손한 임상 실험실 공간 창출 및 재고 추적 프로그램 개발 등이 있습니다.
그림 1 : 샘플 수집 및 담당 직원의 순서. 환자가 체크인하고 환자의 동의를 얻으면 의료 보조원은 협측 면봉을 수집하여 혈액을 채취합니다. 피부과 의사와 의료 보조원은 종양을 절제하고 상처를 닫습니다. SCC와 ANT 표본은 각각 수집됩니다. 헌혈 기술자가 혈액을 처리하고 SCC 및 ANT 표본에 조직 배양, 보존 및 바이오 저장소로 들어가기위한 섹션을 분류합니다.ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
수집 된 샘플의 다양성은 다양한 실험 접근법을 가능하게합니다 ( 그림 2 ). 환자에게서 채취 한 샘플은 협측 면봉 (필요한 경우 타액을 수집 할 수 있음), 전혈 및 절제 된 조직입니다. 구강 내 면봉과 전혈에서 채취 한 샘플은 유전자 타이핑과 조직 일치를 위해 가공없이 저장됩니다. 미래의 분석을 위해 전혈이 백혈구 (WBC)와 혈장 분획으로 분리됩니다. 모스 처리 후, 동결 된 종양을 액체 질소에 직접 놓고 -80 ° C의 냉동고로 옮깁니다. 신선하고 실행 가능한 종양 조직 및 ANT 샘플은 이전 기술 10 , 11의 변형을 사용하여 배양 한 다음 저온 보존합니다. 수집하는 동안 각 샘플 유형의 번호는 스프레드 시트에 기록되기 전에 기록됩니다 재고 추적 프로그램은 정확한 처리를 용이하게합니다 ( 표 1 ).
도표 2 : 진료소 근거한 biorepository 견본 수집과 가공의 개관. 환자에게서 협측 면봉과 혈액 샘플을 수집하여 다운 스트림 genotyping과 조직 매칭을 위해 보관합니다. 전혈은 백혈구 (WBC) 분리 및 CTC 분석뿐만 아니라 혈장 수집 및 액체 생검 분석을 위해 추가 처리됩니다. Mohs 절차 중에 절제 한 조직을 진단 목적으로 조직 학적으로 처리 한 후 조직학 슬라이드를 면역 조직 화학 분석을 위해 실험적으로 사용할 수 있습니다. 절제 된 조직 샘플이 충분히 큰 경우, 신선한 조직의 일부를 제거하고 단백질 및 RNA 분리 및 배양 된 세포주를 확립하기 위해 절단한다.55583 / 55583fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 컬렉션 날짜 : | |||||
| 환자 1 | 환자 2 | 환자 3 | 환자 4 | 환자 5 | |
| 이니셜 및 생년월일 | |||||
| 눈 색깔 | |||||
| 샘플 유형 | |||||
| 샘플 위치 | |||||
| 타액 | |||||
| 승구멍 혈액 | |||||
| 혈장 | |||||
| 유력한 종양 | |||||
| 조직 생체 적합성 | |||||
| 종양 모스 액체 질소 | |||||
| 조직 일반 액체 질소 | |||||
| 슬라이드 |
표 1 : 샘플 수집을 기록하기위한 체크리스트. 수집 된 각 샘플과 함께 추적되고 기록 된 데이터에는 환자의 머리 글자, 생년월일, 눈색 (피부 유형의 경우), 로케티on 표본 제거. 타액 샘플 수, 혈액 수집 체적 및 수집 된 생존 및 보존 된 조직 검체 수 또한 추후 사용을위한 참고 자료로 기록됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
샘플 수집 절차의 유효성을 확인하기 위해 각 샘플 유형은 다운 스트림 어플리케이션에서 테스트되었습니다. 이전 기술 12의 수정을 사용하여, 종양 및 ANT는 단백질 및 RNA 분리에 성공적으로 사용되었으며 잠재적으로 DNA 분리에 사용될 수 있습니다. 조직 절편으로부터 확립 된 생체 외편은 현미경으로 평가되었으며, 보존 된 조직 슬라이드는 면역 조직 화학과 면역 형광 검사에 사용되었다.
여기에 설명 된 프로토콜을 따르면이 모델을 다른 피부과 진료소, 다른 종양 유형 (예 : 흑색 종)으로 확장 할 수 있습니다., 그리고 인간 암에 대한 다방면 연구를위한 인간 조직 샘플을 제공하는 기타 외과 전문 분야 및 관행. 이 프로토콜의 약간의 수정은 다른 관행에 필수적 일 수 있지만 원칙적으로이 프로토콜은 환자 치료 과정에서 수집 된 환자 샘플을 정기적으로 폐기하는 모든 수술에 적용 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
인간 조직 샘플에 대한 모든 실험은 Western IRB (WIRB Protocol # 20142461)에 의해 승인되었습니다. 이 절차에 대한 조직 수집에 대한 단일 기준은 생검에서 입증 된 SCC 진단입니다. 원래의 IRB 프로토콜에는 제외 기준이 제시되어 있지 않았지만, 혈액으로 전염 된 질병이 알려진 환자의 샘플은 사용되지 않았습니다. 피부 조직, 혈액 및 타액을 수집하기 전에 사전 동의를 얻었습니다. 중서부 기관 검토위원회 (Midwestern Institutional Review Board)는 Midwestern University (AZ # 807)에서 진료소 기반의 생물 저장소 샘플을 사용한 검증 작업을 승인했습니다.
1. 피부 종양 조직 처리
참고 : 이것은 Mohs histotechnologist가 수행해야합니다.
- RNA 및 외과 적 배양을위한 새로운 편평 세포 암종 (SCC) 조직의 가공
- 조직이 모스 외과 의사에 의해 절제 된 후, 10 ~ 50 mg (≥ 10 mm 3 참고 : 이것은 종양이 Mohs 절차의 일부인 조직 학적 평가 이전에 10-50 mg 크기의 샘플 (≥10 mm2)을 제거 할 수있을만큼 충분히 큰 경우에만 가능합니다. 종양의 크기가 최소 2mm 3 이 될만큼 크지 않은 경우 RNA 처리를 계속하지 마십시오 (5 단계 생략).
- 핀셋을 사용하여 문화 매체 (DMEM의 1 : 1 혼합물 : 햄의 F - 12, 25 MM HEPES, 100 IU / ML 페니실린, 그리고 100 μg / ML streptomycin)가 포함 된 표시된 1.5 ML 튜브로 실행 가능한 조직을 전송하고 조직은 매체에 완전히 잠겨 있습니다. 추가 처리 전에이 튜브를 4 ° C에 보관하십시오.
- RNA 분리 및 발현 분석을 위해 조직을 사용하십시오 (5 단계 참조) 및 / 또는24 시간 이내에 체외 이식편 배양 (단계 6 참조).
- 환자 (1.1.1 단계)에서 제거한 종양 샘플의 나머지 부분을 저온 유지 장치 홀더 (또는 "척") 위에 놓습니다. 모스 조직학의 완성과 실험 분석을위한 추가 histological 슬라이드의 준비를 허용하기 위해 최적 절단 온도 (OCT) 화합물에 조직을 포함, 홀더 내의 조직을 동결.
- 조직 슬라이드의 준비
- 저온 유지 장치를 사용하여 7 μm 두께의 조직 섹션을 잘라내 각 종양 샘플에 대해 두 개 (또는 그 이상)의 슬라이드를 만듭니다. 각 슬라이드에는 전체 종양의 섹션이 최대 3 개까지 포함되도록하십시오.
참고 : 두 개의 슬라이드 중 하나는 Mohs histotechnologist가 H & E로 염색하고 추가 슬라이드는 IF, IHC 또는 FISH 분석으로 처리 할 수 있습니다. - 조직을 고정하기 위해 아세톤에 슬라이드를 1-2 초 동안 놓습니다. 이 슬라이드를 건조 상태로 두십시오. H & E하지 마라.실험 프로토콜에 따라 미래 immunofluorescence (IF), immunohistochemistry (IHC), 또는 형광 in situ 하이브리드 화 (FISH) 분석에 사용되는 슬라이드를 얼룩이나 coverslip.
- 저온 유지 장치를 사용하여 7 μm 두께의 조직 섹션을 잘라내 각 종양 샘플에 대해 두 개 (또는 그 이상)의 슬라이드를 만듭니다. 각 슬라이드에는 전체 종양의 섹션이 최대 3 개까지 포함되도록하십시오.
- 모종 조직 처리
- 일단 모스 처리가 완료되면 (단계 1.1-1.2), 저온 유지 장치 챔버에서 작업하고 냉동 저울 매질에서 샘플을 꺼내어 조직을 표시된 극저온 튜브에 넣습니다.
- 조직이 해동되기 전에 표시된 바이알을 액체 질소에 넣으십시오. 시료를 단백질 및 / 또는 DNA 분석에 사용하려면 액체 질소 또는 -80 ° C의 냉동고로 몇 분 안에 옮겨 미래의 단백질 발현 및 DNA 돌연변이 분석을 위해 보관할 수 있습니다 (4-5 단계 참조) .
NOTE : post-Mohs sample에서 온전한 RNA가 필요하다면, cryo-embedding 매질에서 제거하는 동안 샘플을 얼게 유지하는 것이 중요합니다. 극도의주의를 기울이지 않은 경우이 단계에서 모스 샘플은 단백질 및 / 또는 DNA 분석을 위해 예약해야합니다.
- 새로운 ANT 처리
- 모스 종결 시점에 모스 외과 의사로부터 ANT를 구하십시오.
- 정상 조직의 꼭대기 쪽에서 SCC 샘플 (위 참조)에서 수확 한 것과 동일하거나 더 많은 양의 ANT를 제거하고 배양 배지가 들어있는 라벨이있는 1.5 mL 튜브 (DMEM : Ham 's F- 12에 25 mM HEPES, 100 IU / mL 페니실린 및 100 μg / mL 스트렙토 마이신을 보충 한 것)을 사용 하였다.
- 동일한 배양 배지에 조직을 완전히 담그고 4 ℃에서 보관합니다 (후속 처리 (4-6 단계 참조)까지).
2. 혈액, 타액 및 구강 내 면봉 처리
- venipuncture를 통해 EDTA 수집 튜브에서 약 10mL의 혈액을 얻습니다.
- 수집 튜브에서 멸균 된 15 또는 50 mL 원심 분리 튜브로 혈액을 옮긴다.. 거품을 피하면서 1.5 mL 극저온 튜브에 약 200 μL를 제거합니다. 필요한 경우이 전체 혈액 샘플을 -80 ° C에 보관하여 향후 genotyping 및 tissue matching에 사용하십시오.
- 나머지 혈액을 1000 xg에서 30 분간 회전시키고 표준 절차에 따라 혈장 분획을 수집합니다.
- 분주하여 1.5mL 극저온 튜브에서 1mL 씩 증분하고 -80 ° C에서 보관하여 향후 액체 생검 분석에 사용하십시오.
- 멸균 된 면봉을 사용하여 협측 면봉 샘플을 얻고 상온에서 멸균 된 튜브에 면봉을 보관하십시오.
- 필요한 경우 타액 샘플을 얻고 실온에서 멸균 튜브에 저장하십시오.
NOTE :이 샘플은 필요할 경우, 향후 genotyping과 tissue matching을 위해 사용될 수있다.
3. 샘플의 기록 관리
- 환자 표본 체크리스트의 정보를 바이오 저장소 데이터베이스로 전송합니다. 환자 정보 및 진단 포함환자 차트에서 코.
- 각 샘플에 대한 바코드 라벨을 인쇄하고 데이터베이스에 각각 기록하여 수집 된 각 샘플을 환자 데이터와 연결합니다.
- 샘플을 연구실로 옮기기 전에 바이오 리포 지 토리 데이터베이스에 비확인 된 샘플의 분포를 기록하십시오.
4. 단백질 분리 및 Western Blot 분석
- 각 조직 샘플 (SCC 및 / 또는 ANT)을 조직 100mg 당 프로 테아 제 억제제가 들어있는 세포 용해 완충액 500 μL가 들어있는 유리 병에 넣고 조직을 녹입니다.
참고 : 우리는 50mM Tris pH 8.0, 150mM NaCl, 0.5 % 나트륨 deoxycholate, 1.0 % NP - 40 및 0.1 % SDS로 구성된 radioimmunoprecipitation 분석 (RIPA) 버퍼를 사용했습니다. 다른 세포 용해 완충액을 사용할 수 있습니다. - 4 ° C에서 20 초 간격으로 5 분 동안 조직 균질기를 사용하여 조직을 균질화하십시오. 21,000 xg와 4 ° C에서 20 분 동안 시료를 회전시키고 단백질을 함유하는 상청액을 신선한 tu있다. 동일한 조건을 사용하여 상등액을 다시 스핀하고 최종 상등액을 신선한 튜브에 수집합니다.
- 4 ~ 20 % SDS-polyacrylamide gradient gel을 사용하여 각 시료에서 30-50 μg의 단백질을 전기 영동합니다. 원하는 경우 Coomassie Blue로 젤을 염색하여 단백질 밴드를 시각화하십시오.
- 발현 된 단백질의 웨스턴 블럿 분석이 필요한 경우 표준 프로토콜에 따라 젤의 단백질을 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막으로 옮깁니다. 전달 후 Ponceau는 원하는 경우 단백질 밴드를 시각화하기 위해 PVDF 막을 얼룩지게합니다.
- 표준 프로토콜에 따라 관심 단백질을 검출하기 위해 PVDF 멤브레인과 프로브를 차단하십시오. 서양 얼룩 분석을 위해 제조업체에서 권장하는 농도로 1 차 항체에 해당하는 2 차 항체와 함께 해당 단백질에 특이적인 1 차 항체를 사용하십시오.
- chemiluminescent 기판을 사용하여 탐침 막을 노출하고 imagi를 사용하여 막 이미지시스템.
RNA 분리 및 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR)
- 즉시 RNA 안정화 용액이 들어있는 1.5 mL 튜브에 신선한 조직 샘플 (SCC 및 / 또는 ANT)을 놓고 고정 된 조직 전이 용액이 들어있는 1.5 mL 튜브에 Mohs 조직 샘플을 넣으십시오. 조직이 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 이 샘플을 사용할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
- -80 ° C에서 RNA 샘플을 제거하고 얼음 위에서 녹입니다. 조직 50-100 MG 당 1 ML의 RNA 추출 버퍼 (페놀 / 구아니딘 thiocyanate)를 포함하는 새로운 1.5 ML 튜브에 조직을 전송하십시오.
- 조직 호 모지 나이저를 사용하여 조직을 용해시킵니다. 6 회의 균질화를 수행 한 다음 샘플 냉각 기간을 수행합니다. 각 사이클은 4 ℃에서 40 초의 균질화와 20 초의 균질화로 구성됩니다. 균질화 후, 실온에서 5 분 동안 샘플을 배양한다.
- 0.2 추가1 mL의 RNA 추출 완충액 당 1 mL의 클로로포름을 넣고 15 초 동안 손으로 튜브를 격렬히 흔드십시오. 실온에서 2-3 분 동안 품어 낸다.
- 12,000 xg와 4 ° C에서 15 분 동안 시료를 회전시킵니다. 샘플의 수성 상을 제거하고 새로운 1.5 mL 튜브에 넣으십시오.
- 수성 상에 단계 5.2에서 사용 된 RNA 추출 완충액 1 mL 당 100 mL의 이소프로판올 0.5 mL를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 항온 처리한다.
참고 : RNA 수율이 낮을 것으로 예상되는 경우 ( 즉, 시작 조직 부피가 10mg 미만인 경우), 샘플은 밤새 -80 ° C에서 침전 될 수 있습니다. 또한 RNA 추출액 500 μL 당 RNase가없는 글리코겐 5 μg을 이소프로판올 침전 단계에서 첨가하여 RNA 수율을 향상시킬 수 있습니다. - 4 ℃에서 12,000 xg에서 10 분간 시료를 회전시킨다. 뜨는을 제거하고 75 % 에탄올 1 ML로 펠렛을 씻으십시오.
- 샘플을 간단하게 볼텍스 한 다음 7,500 x 4 및 4 °로 회전시킵니다.5 분간 C로 처리 하였다. 세척을 버리고 5 ~ 10 분 동안 펠렛을 공기 건조시킵니다.
- RNase가없는 물 20 μL에 RNA 펠렛을 Resuspend.
- 원한다면 RNA 제조사의 권고에 따라 RNA 클린업 키트를 사용하여 각 RNA 샘플을 정제하십시오.
참고 :이 단계를 수행하면 작은 RNA가 샘플에서 손실됩니다.
- 원한다면 RNA 제조사의 권고에 따라 RNA 클린업 키트를 사용하여 각 RNA 샘플을 정제하십시오.
- RNA의 품질을 분석하기 위해 1.2 % 포름 알데히드 -MOPS 아가 로스 젤을 사용하여 1 μg 샘플을 전기 영동하십시오.
참고 : 대안으로, 바이오 분석기를 사용하여 샘플을 분석하여 RIN 번호 13 을 얻습니다. - 대상 mRNA (또는 miRNA)의 qPCR 분석을 위해 역전사 프로토콜을 사용하여 RNA를 cDNA에 역전사하십시오.
6. 조직 미생물 배양
- 조직을 70 % 에탄올로 침지하여 배양하기 전에 절제 된 조직을 소독하십시오.
- 슬라이드 또는 접시에 조직을 놓고 충분한 배양 배지 (DMEM : Ham & # 1 : 1 혼합물)조직을 건조시키기 위해 10 % FBS, 25 mM HEPES, 100 IU / mL 페니실린 및 100 μg / mL 스트렙토 마이신을 보충 한 F-12; 메스 블레이드를 사용하여 조심스럽게 조직을 파편 (<1 mm 3 )으로 자릅니다.
- 35 mm 조직 배양 접시에 조직 조각을 전송하고 각 조각 상단에 태아 소 혈청 (FBS)의 약 20 μL를 추가합니다.
- 접시를 20 ~ 30 분 동안 또는 거의 건조 될 때까지 문화 후드에서 열어 두십시오.
- 각 접시에 문화 매체 (10 % FBS, 25 MM HEPES, 100 IU / ML 보충의 DMEM : 햄의 F - 12 1 : 1 혼합물, 페니실린 100 μg / ML streptomycin)를 추가하고 37 ° 부화 5 % CO2에서 C. 필요에 따라 하위 문화를 배양하거나 배양 물을 복제하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
종양 및 ANT는 단백질 분리에 성공적으로 사용되고 웨스턴 블 랏팅으로 시험되었습니다. 그림 3 에서 볼 수 있듯이, 클리닉 기반 바이오 저장소에 수집 및 저장 한 환자 표본에서 피부 편평 세포 암종 마커 (Muc1 14 , FHL-1 15 및 p40 16 , 17 )를 검출 할 수 있습니다.
그림 3 : ANT와 SCC에서 추출한 단백질 분석. 총 단백질을 ANT 및 SCC 샘플로부터 분리하고, SCC에 대한 공지 된 마커의 발현을 웨스턴 블롯으로 조사 하였다. 뮤신 1 (MUC1), 인자 H 유사 -1 (FHL-1) 및 p40 (패널 B)의 대표적인 웨스턴 블롯이 제시된다. 항변이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
상기 기술을 사용하여 분리 된 RNA는 겔 전기 영동, qPCR 및 RNA 완전성 분석에 의해 시험되었다. 그림 4는 고품질의 손상되지 않은 RNA가 분리 된 2 개의 환자 샘플을 보여줍니다. RNA는 모든 다운 스트림 어플리케이션에 적합합니다.
그림 4 : 생체 분석을 이용한 RNA 무결성 분석. 겔 전기 영동에 의한 RNA 크기 및 완전성 평가 (패널 A). 리보솜 RNA의 비율과 분해 산물의 유무 (패널 B)를 포함하여 RNA 샘플의 전기 영동 트레이스를 기반으로 각 샘플에 대해 RNA 무결성 번호 (RIN)가 생성되었습니다. "10"의 RIN은 분해 산물이없는 완벽한 RNA 샘플을 나타내는 반면, "1"은 완전히 분해 된 sam. 밴드의 농도 계측 프로파일은 SCC 및 ANT 환자 조직으로부터의 대표적인 RNA 샘플에 대해 형광 유닛 (FU) 대 뉴클레오타이드 (nt) (패널 C)로 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
조직 절편에서 확립 된 생존 가능한 explants는 현미경으로 평가되었습니다 ( 그림 5A ). 종양과 ANT 샘플에서 생성 된이 explant 문화, 혼합 keratinocyte 및 fibroblast 문화입니다. 이러한 배양 물은 계대 배양되거나 미래의 세포주 개발에 사용될 수있다. 저장된 histological 슬라이드는 immunohistochemistry 및 immunofluorescence에 사용되었습니다. 그림 5B에 표시된 SCC 샘플은 SCC 18 에서 상피 - 간질 변이 마커에 대한 양성 염색을 보여줍니다.
그림 5 : SCC 절편의 외래 배양 및 IF 염색 항 -pSnail / 슬러그 이차 항체 (패널 B, 스케일 바 = 25 ㎛)로 염색 된 편평 세포 암종 조직 체외 이식편 (패널 A, 스케일 바 = 50 ㎛) 및 모스 현미경 수술의 일부로서 수집 된 조직 절편의 위상차 이미지 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
우리는 실험에 영향을 미치지 않고 조직을 RNA isolation (단계 5) 또는 explant culture (단계 6) 전에 24 ~ 48 시간 동안 4 ℃에서 보관할 수 있다는 것을 실험적으로 결정했습니다. 겔 전기 영동 또는 bioanalyzer 및 RIN 번호로 평가 한 RNA 수확량 또는 무결성은 손상되지 않습니다. 또한, explant 문화는 쉽게 4 ℃에서 티에 저장된 조직을 사용하여 얻을 수 있습니다s의 시간 길이. 이렇게하면 클리닉과 연구실간에 샘플을 전송할 때 유연성이 향상됩니다. RNA isolation과 explant culture가 임상 실험실이 아닌 연구실에서 수행되기 때문에이 기능은 병원에 기반한 바이오 저장소를 이전에 기대했던 것보다 더 견고한 모델로 만듭니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
저자의 지식에 따르면이 프로토콜은 비용 효율적이고 빠른 접근 방식으로 피부 조직 샘플을 임상 적으로 조달하는 데 주력하는 최초의 제품입니다. Mohs 미세 수술을받는 환자는 일반적으로 특정 시간대에 예정되며 수집은이 기간으로 제한됩니다. 샘플 채취에는 환자 관리에 종사하는 의료 보조원, 종양 샘플을 처리하는 모스 (Mohs) histotechnologist 및 샘플 진입 및 혈액 처리를 담당하는 지정 실험실 직원의 노력이 필요합니다.
수집 팀 ( 예 : 의료 비서, 모스 histotechnologist 및 실험실 기술자) 세 멤버 사이의 조심 조정과 함께, 우리는 기존의 의료 지원 직원이 3-5 조직 샘플의 수집과 관련된 추가 작업을 완료 할 수있는 것으로 나타났습니다 하루에 클리닉 운영에서 명백한 지체없이. 환자 동의서 받기 모스 마이크로 수술 절차와 관련된 일반적인 대기 기간 중에 협측 스왑 및 혈액 수집이 완료됩니다. 샘플을 처리하는 방법에 대한 의사 결정 외에도 모스의 histotechnologist가 담당하는 작업은 환자 샘플의 모스 처리가 끝날 때 완료되며 일반적으로 일일 일정에 약 30 분을 추가합니다. 일반적으로 병원 직원 중 한 명은 혈액 샘플을 라벨링하고 처리하고 샘플을 데이터베이스로 전송 및 입력하는 작업을 담당합니다. 처리되는 샘플의 수에 따라, 이러한 임무는 현행 의무로부터 상당한 시간을 필요로 할 수있다. 따라서 충분한 시료 채취가 가능한 경우에만 시료 채취를 수행해야합니다. 특히, 하루에 5 개 이상의 샘플을 채취하거나 환자의 혈액 샘플을 여러 개 수집하는 경우 실험실 기술자가 추가로 몇 시간 동안 노력해야합니다.
jove_content "> 수집 일에, 의료 보조원 (MA)은 조직 기증을 위해 환자의 동의를 얻으며, MA는 이후에 협측 스왑 (필요한 경우 타액)을 얻고 실험실 직원이 처리 할 수 있도록 혈액을 채취합니다. 이 견본을 수집 한 후 환자가 개입했기 때문에 환자의 관점에서 병원 방문의 나머지 부분은 변경되지 않았습니다 (후속 방문 중에 혈액을 기증해야 함). 현재 환자의 70 %가 동의합니다 혈액을 기증하는 환자의 30 %가 참여하고, 30 %의 참여가 감소했다. 현재 생검으로 입증 된 암 진단을받은 환자 만이 바이오 저장소에 포함된다. 혈액으로 전염되는 전염병으로 알려진 환자는 제외된다 .실험실 직원은 수집 팀의 다른 두 구성원과 협조 할 책임이 있으며 수집 된 샘플을 기록합니다 (표 1). 후에초기 샘플 채취, 완료된 동의서, 혈액 및 협측 면봉은 실험실 직원에게 전달되고 기증자의 머리 글자, 생년월일 및 샘플 유형과 같은 기타 관련 정보가 기록됩니다. 수집 절차 중에 각 환자와 함께 수집 된 샘플의 수와 유형을 기록 할 수 있습니다. SCC 조직 ( 그림 6 )과 ANT (그림 7)의 처리를 요약 한 흐름도는 수집 절차에서 새로운 직원을 훈련시키는 데 유용한 도구입니다.
그림 6 : SCC 샘플 처리 흐름도. 종양 절제시, 표본의 크기가 평가됩니다. 샘플이 ≤2 mm3 인 경우 전체 표본은 모스 처리에 사용되며 청결한 여백 (지표완전한 종양 제거술)이 최우선 과제입니다. Mohs 처리 후, 남아있는 모든 조직은 액체 질소로 동결되어 생물 저장소로 옮겨집니다. 시료가> 2 mm 3 인 조직을 제거 할 수있을 정도로 큰 경우이 부분을 수집하여 세포 배양 배지가 담긴 튜브에 넣고 나머지 부분은 모스 가공에 사용하고 위와 같이 보관합니다. 세포 배양 배지로 제거 된 샘플의 부분을 더 분절화하여 약 0.5 mm 3 단편을 제거하고 세포 배양 계통의 확립을 위해 사용 하였다; 나머지 조직 단편은 하류 단백질 및 유전자 발현 분석을 위해 바이오 저장소로 전달된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
er.within-page = "1"> 
그림 7 : ANT 샘플의 처리를 나타내는 플로우 차트 Mohs가 폐쇄 될 때 인접한 정상 조직 (ANT)의 일부가 제거되어 모스 외과 의사가 수집합니다. 샘플 크기가 ≤2 mm 3 인 경우, 전체 표본을 극저온 튜브에 넣고 액체 질소로 동결시킨 다음 바이오 저장소로 옮깁니다. 샘플이> 2 mm 3 인 경우 전체 표본을 먼저 세포 배양 배지가 들어있는 튜브에 넣습니다. 표본을 세포 배양 라인을 확립하는데 사용하기 위해 ~ 0.5 mm 3 단편으로 더 세분화한다. 나머지 조직 섹션은 biorepository로 전송되어 하류 단백질 및 유전자 발현 분석을 위해 저장됩니다.55583 / 55583fig7large.jpg "target ="_ blank "> 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜은 바이오 리포지토리 내의 샘플 간의 편차를 최소화하도록 설계되었습니다. 병원 직원과 병원과 모든 실험실 직원 간의 조정 및 효과적인 의사 소통은 가변성을 최소화하고 조직에서 고품질의 DNA, RNA 및 단백질의 도달을 최대화하기 위해 필수적입니다. 조직 내의 DNA와 단백질이 강건하기는하지만 RNA가 필요한 경우에는 RNA 무결성을 유지하기 위해 수집, 수송 및 가공하는 동안 조직을 차가운 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 정확한 기록 관리는 환자 샘플을 내역 및 진단과 연결하는 데 중요합니다.이 정보는 다운 스트림 어플리케이션의 결과를 분석 할 때 종종 필요합니다.
개인화 된 약 및 bio에있는 증가 관심사로마커 리서치 (marker research)에서, 최근에 다수의 생체 리포터리가 확립되었다. 이들은 일반적으로 대형 학술 센터의 병원 기반 클리닉과 연관되어 있으며 설정 및 작동 2 , 8 , 19에 상당한 비용이 소요됩니다. 일상 생활의 일부로 생성 된 피부암 샘플을위한 클리닉 기반 바이오 저장소의 개발은 다른 생물 약제보다 몇 가지 중요한 이점이 있습니다. 첫째, 단일 수집 및 샘플 처리 사이트를 사용하여 다운 스트림 어플리케이션을 손상시킬 수있는 샘플 처리의 변형을 최소화합니다. 둘째, 기증 된 샘플이 안정된 환자 집단에서 추출되므로, 식별되지 않은 의료 기록 및 환자 결과 데이터에 대한 액세스는 타의 추종을 불허합니다. 이러한 데이터는 샘플 수집시 또는 후속 방문시 환자 차트에서 바이오 리포 지 토리 데이터베이스로 익명화되고 전송 될 수 있습니다. 셋째, 충성도가 높은 환자 기반으로 clinic 기반의 바이오 리포지토리는 같은 환자의 여러 샘플을 수집 할 수 있으며, 다른 설정에서는 얻을 수없는 샘플 세트입니다. 이 프로토콜의 한계 중 하나는 Mohs 현미경 수술을 통해 얻은 피부 표본에 최적화되었으며 다른 유형의 조직이나 임상 절차를 위해 수정해야 할 수도 있다는 것입니다.
전반적으로 바이오 리포지토리의 핵심 목표 중 하나는 연구원들이 액체 생검 및 암 마커의 개발과 관련하여 광범위한 질문을 할 수 있도록하기 위해 동일한 기증자의 광범위한 샘플을 제공하는 것입니다. 특히, 종양 조직학 및 mRNA 및 단백질 수준에서의 바이오 마커의 발현을 혈장 샘플과 상관시키는 능력뿐만 아니라 환자 결과 데이터를 참조하는 능력은 유일하게 강력한 데이터 세트를 생성한다. 생물 의학 연구에서 환자 표본 부족을 완화하기 위해 클리닉 기반의 생물 저장소 모델이 활용되기를 바랍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중서부 대학 건강 과학 연구 촉진 기금, EEH 수여, Midwestern University Office of Research 및 후원 프로그램 교내 기금, KJL에게 수여되었습니다. Affiliated Laboratories 및 Affiliated Dermatology에서 추가 지원을 제공했습니다. 기술 지원을 위해 Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel 및 Ali Zaidi에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA | ThermoFisher Scientific | 02-685-2B | |
| Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades | ThermoFisher Scientific | 50-949-411 | |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | ThermoFisher Scientific | 16-100-110 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-138 | |
| Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium | ThermoFisher Scientific | NC9791321 | |
| Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound | ThermoFisher Scientific | 50-363-579 | |
| Leica CM1950 Cryostat | Leica Biosystems | 14047743909 | |
| Frosted Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-343 | |
| Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 99-900-01 | |
| Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes | ThermoFisher Scientific | 03-337-7X | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| Boca Scientific BuccalT-Swab | ThermoFisher Scientific | NC9679349 | |
| Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer | ThermoFisher Scientific | 50-195-822 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | PI78443 | |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 05-401-203 | |
| Pellet Morter Cordless Homogenizer | ThermoFisher Scientific | 12-141-3 | |
| RNAse Free Pellet Pestle | ThermoFisher Scientific | 121-141-364 | |
| Forma SteriCycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 13-998-089 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | SH30071.02 | |
| Gibco Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12-634-028 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140148 | |
| Gibco 1 M Hepes | ThermoFisher Scientific | 15-630-130 | |
| Nunc Cell Culture 35 mm with Vent | ThermoFisher Scientific | 1256591 | |
| Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 | Abnova | MAB12583 | |
| Anti-p40 (p63 delta) antibody | Abnova | ABX-144A | |
| Anti MUC-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-7313 | |
| Anti-Snail + Slug (phospho S246) | Abcam | Ab63568 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 568 Phallodin | Molecular Probes | A12380 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P36941 | |
| Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera | Zeiss | 4300009901 | |
| Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera | Olympus | IX511F3 |
References
- Baker, M. Biorepositories: Building better biobanks. Nature. 486, 141-146 (2012).
- Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
- Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
- National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
- Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
- Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
- Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
- Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
- Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
- Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
- Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
- Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
- Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
- Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
- Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
- Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
- Vaught, J. Developments in biospecimen research. Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).
