Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Création d'un biorepository basé sur une clinique

Published: May 29, 2017 doi: 10.3791/55583
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3, 1
1Affiliated Dermatology & Affiliated Laboratories, Midwestern University Osteopathic Postdoctoral Training Institute, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Arizona College of Osteopathic Medicine, Midwestern University, 3Biomedical Sciences Program, College of Health Sciences, Midwestern University

Summary

Les tumeurs cutanées sont souvent éliminées suite à la chirurgie micrographique de Mohs. Un protocole est décrit ici qui permet au personnel de soutien clinique de traiter et de stocker efficacement les échantillons de tumeur cutanée ( p. Ex., Carcinome épidermoïde, carcinome basique et mélanome) pour des applications en laboratoire en aval sans interférer avec les opérations cliniques.

Abstract

L'incidence du cancer de la peau ( p. Ex., Carcinome épidermoïde, carcinome basocellulaire et mélanome) a augmenté au cours des dernières années. On s'attend à ce qu'il y ait une demande parallèle pour les échantillons de tumeurs cutanées pour des études de recherche biomédicales. La disponibilité des tissus, cependant, est limitée en raison du coût de l'établissement d'un biorepository et du manque de protocoles disponibles pour l'obtention d'échantillons cliniques qui n'interfèrent pas avec les opérations cliniques. Un protocole a été établi pour collecter et traiter la tumeur cutanée et les échantillons de sang et de salive associés qui ont un impact minimal sur les procédures cliniques de routine à la date de la chirurgie de Mohs. Les échantillons de tumeurs sont recueillis et traités à partir de patients subissant leur première couche de chirurgie de Mohs pour des tumeurs malignes cutanées éprouvées par biopsie par l'histotechnologiste de Mohs. Le tissu normal adjacent est recueilli au moment de la fermeture chirurgicale. Des échantillons supplémentaires qui peuvent être collectés sont des écouvillons sanguins et buccales. En utilisant des échantillons de tissus qui sont normalement rejetés, un biorepository a été généré qui offre plusieurs avantages clés en étant basé dans la clinique par rapport au paramètre de laboratoire. Ceux-ci incluent une large gamme d'échantillons collectés; Accès aux dossiers de patients identifiés, y compris les rapports de pathologie; Et, pour le donneur typique, accéder à des échantillons supplémentaires lors des visites de suivi.

Introduction

La recherche sur le cancer et les biomarqueurs repose sur une offre d'échantillons de tissus humains de qualité, et une offre limitée a entravé la recherche 1 , 2 . De nombreuses études dermatologiques sont limitées par l'offre insuffisante, la qualité variable et les coûts associés à l'utilisation du tissu humain. Le coût de l'établissement d'une importante biobanche dédiée a été estimé à environ deux millions de dollars 3 , et ces coûts mettent l'utilisation des tissus humains hors de la portée de nombreux chercheurs. En outre, le processus de génération et de stockage d'échantillons de recherche pose le risque d'affecter les opérations cliniques et de retarder les soins aux patients, si cela n'est pas soigneusement exécuté. Un biorepository basé sur une clinique rentable a été établi qui se concentre sur les échantillons de cancer de la peau selon les meilleures pratiques recommandées et la validation des échantillons 4 , 5 , 6 .

7 , 8 .

L'objectif de la technique de la chirurgie micrographique de Mohs est de s'assurer que tout le tissu cancéreux est éliminé tout en préservant autant de tissus sains que possible. La procédure implique l'élimination progressive de couches minces de tissu tumoral. Chaque couche successive est son(Après avoir critisé le tissu tumoral et réalisé une coloration H & E) par un dermatologue pour déterminer si tous les tissus cancéreux ont été enlevés. L'excision et l'examen des couches subséquentes de tissus sont exécutés alors que le patient reste dans le bureau. Cette technique est considérée comme la meilleure option de traitement pour SCC 9 . À ce stade, la plaie est fermée et, pour améliorer la guérison et l'apparence esthétique, le tissu normal adjacent (ANT) est souvent excisé. Ainsi, cette procédure chirurgicale pour éliminer une tumeur est idéale pour la collecte de tissu histologiquement caractérisé pour des études futures.

La procédure de passation des marchés pour l'obtention de tissus tumoraux, des tissus normaux adjacents, de la salive et du sang a été conçue pour avoir un impact minimal sur les tâches normales du personnel ( figure 1 ). Les assistants médicaux effectuent les tirages sanguins tout en préparant le patient pour la procédure. Après l'achèvement de la procédure Mohs, le M Oh histotechnologist prépare des diapositives histologiques supplémentaires du spécimen et transfère le tissu au biorepository. Les coûts associés à l'établissement du biorepository comprennent l'achat de congélateurs à cryoconservation, la création d'un espace de laboratoire clinique modeste et le développement d'un programme de suivi des stocks.

Figure 1
Figure 1: Séquence de la collecte des échantillons et du personnel responsable. Lors de l'enregistrement des patients et de l'obtention du consentement du patient, l'assistant médical collecte un prélèvement buccal et effectue un prélèvement sanguin. Le dermatologue et l'assistant médical excises la tumeur et ferment la plaie, au cours duquel les échantillons SCC et ANT sont collectés, respectivement. Un technicien de laboratoire spécialisé traite le sang et les sections des spécimens SCC et ANT pour la culture tissulaire, la préservation et l'entrée dans le biorepository.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La diversité des échantillons collectés permet une variété d'approches expérimentales ( figure 2 ). Les échantillons recueillis auprès du patient sont des écouvillons buccaux (la salive peut également être recueillie si nécessaire), du sang entier et du tissu excisé. Les écouvillons buccaux et un échantillon de sang entier sont sauvegardés, sans traitement, pour le génotypage et l'appariement des tissus. Le sang entier est séparé en globules blancs (WBC) et les fractions de plasma pour des analyses futures. Après le traitement de Mohs, la tumeur congelée est placée directement dans de l'azote liquide et transférée à un congélateur de -80 ° C. Les tissus tumoraux frais et viables et les échantillons ANT sont cultivés en utilisant des modifications des techniques précédentes 10 , 11 puis cryoconservées. Pendant la collecte, le nombre de chaque type d'échantillon est enregistré sur une feuille de calcul avant l'entrée dans Le programme de suivi des stocks pour faciliter un traitement précis ( tableau 1 ).

Figure 2
Figure 2: Résumé de la collecte et du traitement des échantillons biologiques à base de clinique. Un prélèvement buccal et un échantillon de sang sont recueillis auprès du patient et stockés pour le génotypage en aval et l'appariement des tissus. Le sang entier est ensuite traité pour l'isolement des globules blancs (WBC) et l'analyse CTC, ainsi que pour la collecte plasma et l'analyse de la biopsie liquide. Le tissu excisé pendant la procédure Mohs est traité histologiquement à des fins diagnostiques, après quoi les diapositives histologiques peuvent être utilisées expérimentalement pour d'autres analyses immunohistochimiques. Pourvu que l'échantillon de tissu excisé soit suffisamment grand, une partie de tissu frais est enlevée et sectionnée pour l'isolement de protéines et d'ARN et pour l'établissement de lignées cellulaires cultivées.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Date de collecte:
Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5
Initiales et date de naissance
Couleur des yeux
Échantillon type
Emplacement de l'échantillon
Salive
WTrou sang
Plasma
Tumoral viable
Tissu Normal Viable
Tumeur Mohs Nitrogen Liquide
Tissue Normal Nitrogen Liquide
Diapositives

Tableau 1: Liste de contrôle pour enregistrer les collections d'échantillons. Les données suivies et enregistrées avec chaque échantillon recueilli comprennent les initiales du patient, la date de naissance et la couleur des yeux (pour la typage de la peau), ainsi que la localisationSur l'enlèvement de l'échantillon. Le nombre d'échantillons de salive, les volumes de collecte de sang et le nombre de spécimens de tissus viables et conservés collectés sont également consignés comme références pour les allocations aux utilisations ultérieures. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Pour valider les procédures de collecte des échantillons, chaque type d'échantillon a été testé dans les applications en aval. En utilisant des modifications des techniques précédentes 12 , la tumeur et l'ANT ont été utilisés avec succès dans l'isolement des protéines et de l'ARN et peuvent éventuellement être utilisés pour l'isolement de l'ADN. Les explants viables établis à partir des sections de tissu ont été évalués par microscopie, tandis que des diapositives histologiques stockées ont été utilisées pour l'immunohistochimie et l'immunofluorescence.

En suivant le protocole décrit ici, il est possible d'étendre ce modèle à d'autres cliniques de dermatologie, à d'autres types de tumeurs (comme le mélanome), Et d'autres spécialités et pratiques chirurgicales pour fournir des échantillons de tissus humains pour la recherche à multiples facettes sur les cancers humains. De légères modifications de ce protocole sont susceptibles d'être nécessaires pour d'autres pratiques, mais, en principe, ce protocole s'applique à toute pratique chirurgicale qui répète systématiquement les échantillons de patients recueillis au cours du traitement du patient.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les expérimentations sur des échantillons de tissus humains ont été approuvées par l'IRB de l'Ouest (protocole WIRB n ° 20142461). Le critère unique pour la collecte des tissus pour ces procédures est un diagnostic éprouvé par biopsie de SCC. Aucun critère d'exclusion n'a été décrit dans le protocole IRB original, mais les échantillons de patients atteints d'une maladie transmissible transmissible par le sang connue n'ont pas été utilisés. Le consentement éclairé a été obtenu avant la collecte des tissus cutanés, du sang et de la salive. Midwestern Institutional Review Board a approuvé le travail de validation avec des échantillons de biorepository basés sur la clinique à Midwestern University (AZ # 807).

1. Traitement des tissus tumoraux cutanés

REMARQUE: ceci doit être réalisé par un histotecchiste de Mohs.

  1. Traitement du tissu de carcinome à cellules squameuses fraîches (SCC) pour l'ARN et la culture explicite
    1. Une fois que le tissu a été excisé par le chirurgien Mohs, récoltez 10 à 50 mg (≥ 10 mm 3 NOTE: Ceci n'est possible que si la tumeur est suffisamment grande pour permettre l'élimination d'un échantillon de 10 à 50 mg (≥ 10 mm 2 ) avant l'évaluation histologique, qui fait partie de la procédure Mohs. Si la tumeur n'est pas suffisamment grande pour permettre un retrait d'au moins 2 mm 3 , ne pas procéder au traitement pour l'ARN (passer l'étape 5).
    2. Transférer le tissu viable sur un tube de 1,5 ml étiqueté contenant un milieu de culture (mélange 1: 1 de DMEM: F-12 de jambon, 25 mM d'HEPES, 100 UI / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine) en utilisant une pince à épiler et assurez-vous que Le tissu est complètement immergé dans le milieu. Conservez ce tube à 4 ° C avant un traitement supplémentaire.
    3. Utilisez le tissu pour l'analyse de l'isolement et de l'expression de l'ARN (voir étape 5) et / ou l'établissementD'une culture d'explant (voir étape 6) dans les 24 h.
    4. Placez le reste de l'échantillon de tumeur qui a été retiré du patient (étape 1.1.1) sur un porte-tissu cryostat (ou "mandrin"). Incorporer le tissu dans un composé de température de coupe optimale (OCT), en gelant le tissu dans le support, pour permettre l'achèvement de l'histologie de Mohs et pour la préparation de diapositives histologiques supplémentaires pour l'analyse expérimentale.
  2. Préparation des diapositives histologiques
    1. Couper les sections de tissu de 7 μm d'épaisseur en utilisant un cryostat et créer deux (ou plus) diapositives pour chaque échantillon de tumeur. Assurez-vous que chaque diapositive contient jusqu'à trois sections de la tumeur complète.
      REMARQUE: L'une des deux diapositives sera colorée en utilisant H & E par l'auteur histotecnologique de Mohs, et la ou les glissières supplémentaires peuvent être traitées avec des analyses IF, IHC ou FISH.
    2. Placez les lames dans de l'acétone pendant 1-2 s pour réparer le tissu. Réglez ces glissières de côté pour sécher. Ne pas H & ELa tache ou la lamelle couvre la diapositive pour être utilisée pour l'immunofluorescence future (IF), l'immunohistochimie (IHC) ou l'analyse par hybridation in situ fluorescente (FISH), selon le protocole expérimental.
  3. Traitement du tissu post-Mohs
    1. Une fois que le traitement de Mohs a été complété (étapes 1.1-1.2), travaillez dans la chambre du cryostat et évacuez l'échantillon à partir du milieu de cryo-incorporation et placez le tissu dans un tube cryogénique étiqueté.
    2. Placez le flacon marqué dans de l'azote liquide avant que le tissu ne soit décongelé. Si des échantillons doivent être utilisés pour des analyses de protéines et / ou d'ADN, ils peuvent être transférés dans de l'azote liquide ou un congélateur de -80 ° C en quelques minutes pour être stockés pour une future analyse de la protéine et de la mutation de l'ADN (voir les étapes 4-5) .
      REMARQUE: Si l'on désire l'ARN intact à partir de l'échantillon post-Mohs, il est essentiel de garder l'échantillon congelé lors du retrait du milieu de cryo-incorporation. Si les soins extrêmes ne sont pas exercés àCette étape, l'échantillon post-Mohs devrait être réservé pour l'analyse des protéines et / ou de l'ADN.
  4. Traitement de l'ANT frais
    1. Au moment de la fermeture de Mohs, obtenez ANT du chirurgien Mohs.
    2. Supprimez une quantité égale ou supérieure de ANT telle que récoltée à partir de l'échantillon SCC (voir ci-dessus) du côté apical du tissu normal et transférez-le à un tube de 1,5 ml étiqueté contenant du milieu de culture (mélange 1: 1 de DMEM: Ham- 12 complété par 25 mM d'HEPES, 100 UI / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine) à l'aide d'une pince à épiler.
    3. Plonger complètement le tissu dans le même milieu de culture et conserver à 4 ° C jusqu'à un traitement ultérieur (voir étapes 4-6).

2. Traitement du sang, de la salive et du prélèvement buccal

  1. Obtenir environ 10 ml de sang dans les tubes de collecte EDTA par ponction veineuse.
  2. Transférer le sang des tubes de collecte vers un tube de centrifugeuse stérile de 15 ou 50 mL. Retirer environ 200 μL dans un tube cryogénique de 1,5 ml, en évitant les bulles; Conserver cet échantillon de sang entier à -80 ° C, pour être utilisé pour le génotypage futur et l'appariement des tissus, si nécessaire.
    1. Faites passer le sang restant à 1000 xg pendant 30 minutes et suivez les procédures standard pour collecter la fraction plasmatique.
    2. Aliquoter le plasma dans des incréments de 1 ml dans des tubes cryogéniques de 1,5 ml et stocker à -80 ° C pour une utilisation lors des futures analyses de biopsies liquides.
  3. Utilisez un écouvillon stérile pour obtenir un échantillon d'écouvillon buccal et rangez l'écouvillon dans un tube stérile à température ambiante.
  4. Si nécessaire, obtenir un échantillon de salive et stocker dans un tube stérile à température ambiante.
    REMARQUE: Ces échantillons peuvent être utilisés pour le génotypage futur et l'appariement des tissus, si nécessaire.

3. Conservation des échantillons

  1. Transférer les informations de la liste de contrôle des échantillons de patients à la base de données biorepository. Inclure l'information du patient et le diagnosticNosis du tableau des patients.
  2. Imprimez les étiquettes avec un code à barres pour chaque échantillon et enregistrez chacun dans la base de données pour lier chaque échantillon collecté aux données du patient.
  3. Enregistrez la distribution des échantillons identifiés dans la base de données biorepository avant de transférer les échantillons au laboratoire de recherche.

4. Isolation des protéines et analyse Western Blot

  1. Placez chaque échantillon de tissu (SCC et / ou ANT) dans un flacon contenant 500 μL de tampon de lyse cellulaire contenant des inhibiteurs de protéase par 100 mg de tissu pour lyser le tissu.
    NOTE: Nous avons utilisé un tampon de dosage de radioimmunoprécipitation (RIPA), composé de 50 mM de Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,5% de désoxycholate de sodium, 1,0% de NP-40 et 0,1% de SDS. D'autres tampons de lyse cellulaire peuvent être utilisés.
  2. Homogénéiser les tissus en utilisant un homogénéisateur de tissu pendant 5 min dans des intervalles de 20 s à 4 ° C. Faire passer les échantillons à 21 000 xg et 4 ° C pendant 20 min et collecter le surnageant contenant de la protéine dans un tu fraisêtre. Ré-tourner le surnageant en utilisant les mêmes conditions et collecter le surnageant final dans un tube frais.
  3. Electrophorèse 30-50 μg de protéines de chaque échantillon en utilisant un gel gradient SDS-polyacrylamide à 4-20%. Tenez le gel avec Coomassie Blue pour visualiser les bandes de protéines, si désiré.
  4. Si l'analyse Western Blot des protéines exprimées est nécessaire, transférez les protéines du gel à une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) en suivant des protocoles standard. Après le transfert, Ponceau tache la membrane PVDF pour visualiser les bandes de protéines, si désiré.
  5. Bloquer la membrane et la sonde PVDF pour détecter les protéines d'intérêt suivant les protocoles standard. Utiliser des anticorps primaires spécifiques à la (des) protéine (s) d'intérêt, ainsi que des anticorps secondaires correspondants spécifiques aux anticorps primaires, aux concentrations recommandées par le fabricant pour l'analyse Western Blot.
  6. Exposer la membrane sondée à l'aide d'un substrat chimioluminescent et image de la membrane à l'aide d'une imagiSystème ng.

5. Isolation de l'ARN et réaction en chaîne quantitative de la polymérase (qPCR)

  1. Préparer immédiatement des échantillons de tissus frais (SCC et / ou ANT) dans un tube de 1,5 mL contenant une solution de stabilisation d'ARN et placer des échantillons de tissus post-Mohs dans un tube de 1,5 ml contenant une solution de transition de tissu congelé, conformément aux recommandations du fabricant. Assurez-vous que le tissu est complètement immergé. Conservez ces échantillons à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.
  2. Retirez les échantillons d'ARN de -80 ° C et décongélation sur de la glace. Transférer le tissu à un nouveau tube de 1,5 ml contenant 1 ml de tampon d'extraction d'ARN (phénol / thiocyanate de guanidine) par 50 à 100 mg de tissu.
  3. Lyse les tissus en utilisant un homogénéisateur de tissu. Effectuer six cycles d'homogénéisation, suivis d'une période de refroidissement de l'échantillon; Chaque cycle se compose de 20 s d'homogénéisation à 4 ° C et d'une période de refroidissement de 40 s. Après homogénéisation, incuber l'échantillon pendant 5 minutes à température ambiante.
  4. Ajouter 0,2Ml de chloroforme pour 1 ml de tampon d'extraction d'ARN et agiter vigoureusement le tube à la main pendant 15 s. Incuber pendant 2 à 3 minutes à température ambiante.
  5. Faire passer les échantillons à 12 000 xg et 4 ° C pendant 15 min. Retirer la phase aqueuse de l'échantillon et la placer dans un nouveau tube de 1,5 ml.
  6. Ajouter 0,5 ml d'isopropanol à 100% pour 1 ml du tampon d'extraction d'ARN utilisé à l'étape 5.2 à la phase aqueuse et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
    NOTE: Si les rendements d'ARN sont prévus pour être faibles ( c.-à-d., Le volume de tissus de départ est inférieur à 10 mg), les échantillons peuvent être précipités pendant une nuit à -80 ° C. De plus, 5 pg de glycogène sans RNase par 500 μL de tampon d'extraction d'ARN peuvent être ajoutés pendant l'étape de précipitation d'isopropanol pour améliorer les rendements d'ARN.
  7. Faire tourner l'échantillon à 12 000 xg à 4 ° C pendant 10 min. Retirer le surnageant et laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 75%.
  8. Vortez l'échantillon brièvement, puis tournez-le à 7 500 xg et 4 °C pendant 5 min. Jeter le lavage et sécher à l'air la pastille pendant 5-10 min.
  9. Remettre en suspension la pastille d'ARN dans 20 μL d'eau sans RNase.
    1. Si désiré, purifiez chaque échantillon d'ARN en utilisant un kit de nettoyage d'ARN suivant les recommandations du fabricant.
      REMARQUE: Les petits ARN seront perdus de l'échantillon si cette étape est effectuée.
  10. Électrophorèse un échantillon de 1 μg en utilisant un gel d'agarose à 1,2% de formaldéhyde-MOPS pour analyser la qualité de l'ARN.
    NOTE: En variante, analysez les échantillons en utilisant un bioanalyseur pour obtenir un numéro RIN 13 .
  11. Inverser la transcription de l'ARN à l'ADNc en utilisant un protocole de transcription inverse pour l'analyse qPCR des ARNm cibles (ou des miRNA) d'intérêt.

6. Les cultures sensibles aux tissus

  1. Stériliser le tissu excisé avant la culture en immergeant le tissu en 70% d'éthanol.
  2. Placez le tissu sur une lame ou un plat et ajoutez suffisamment de milieu de culture (mélange 1: 1 de DMEM: Ham & #F-12 F-12 complété par 10% de FBS, 25 mM d'HEPES, 100 UI / mL de pénicilline et 100 μg / ml de streptomycine) pour couvrir le tissu (pour éviter que le tissu ne se séche). Coupez soigneusement le tissu en fragments (<1 mm 3 ) en utilisant une lame de scalpel.
  3. Transférer les fragments de tissu dans un plat de culture tissulaire de 35 mm et ajouter environ 20 μL de sérum bovin fœtal (FBS) au-dessus de chaque fragment.
  4. Laisser le plat ouvert dans un capot de culture pendant 20 à 30 minutes, ou jusqu'à ce qu'il soit presque sec.
  5. Ajouter 1 ml de milieu de culture (mélange 1: 1 de DMEM: F-12 de jambon supplémenté avec 10% de FBS, 25 mM d'HEPES, 100 UI / mL de pénicilline et 100 μg / ml de streptomycine) à chaque plat et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 . Sous-culture ou sous-clone les cultures si nécessaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La tumeur et l'ANT ont été utilisés avec succès dans l'isolement des protéines et testés par Western Blot. Comme le montre la figure 3 , les marqueurs de carcinomes épidermiques cutanés (Muc1 14 , FHL-1 15 et p40 16 , 17 ) peuvent être détectés dans des échantillons de patients collectés et stockés dans notre biorepository basé sur la clinique.

figure 3
Figure 3: Analyse des protéines extraites de l'ANT et du SCC. La protéine totale a été isolée à partir d'échantillons ANT et SCC, et l'expression de marqueurs connus pour SCC a été examinée par Western Blot. Des transferts de mucine 1 représentatifs (MUC1), Factor H Like-1 (FHL-1) et p40 (panneau B) sont affichés. PlaidoyerSe cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

L'ARN isolé en utilisant les techniques ci-dessus a été testé par électrophorèse sur gel, qPCR et analyse d'intégrité d'ARN. La figure 4 montre deux échantillons de patients dont l'ARN intacte de haute qualité a été isolé. L'ARN convient à toutes les applications en aval.

Figure 4
Figure 4: analyse de l'intégrité de l'ARN à l'aide de la bioanalyse. Évaluation de la taille et de l'intégrité de l'ARN par électrophorèse sur gel (panneau A). Un nombre d'intégrité d'ARN (RIN) a été généré pour chaque échantillon en fonction de la trace électrophorétique de l'échantillon d'ARN, y compris le rapport de l'ARN ribosomique et la présence ou l'absence de produits de dégradation (panneau B). Un RIN de «10» représente un échantillon d'ARN parfait, sans aucun produit de dégradation, tandis que «1» marque une sa complètement dégradéeMple. Les profils de densitométrie des bandes sont tracés en unités de fluorescence (FU) par rapport aux nucléotides (nt) (panneau C) pour des échantillons représentatifs d'ARN du SCC et du tissu du patient ANT. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les explants viables établis à partir des sections de tissu ont été évalués par microscopie ( Figure 5A ). Ces cultures d'explants, générées à partir des échantillons de tumeurs et d'ANT, sont des cultures mixtes de kératinocytes et de fibroblastes. Ces cultures peuvent être sous-cultivées ou utilisées pour un développement futur de la ligne cellulaire. Des diapositives histologiques stockées ont été utilisées pour l'immunohistochimie et l'immunofluorescence. Dans la figure 5B , un échantillon de SCC montre une coloration positive pour un marqueur de transition épithéliale-mésenchymateuse dans SCC 18 .


Figure 5: Culture explicite et coloration IF des sections SCC. L'image de contraste de phase d'un explant de tissu de carcinome épidermique (panneau A, Barre d'échelle = 50 μm) et des sections de tissu réunies dans le cadre de la chirurgie micrographique Mohs, colorées avec un anticorps primaire anti-pSnail / Slug (panneau B, Barre d'échelle = 25 μm ). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Nous avons déterminé expérimentalement que les tissus peuvent être stockés à 4 ° C pendant 24 à 48 h avant l'isolement de l'ARN (étape 5) ou la culture d'explants (étape 6) sans affecter les résultats. Le rendement ou l'intégrité de l'ARN, évalué par électrophorèse sur gel ou bioanalyseur et numéro RIN, ne sont pas compromis. En outre, les cultures d'explants sont facilement obtenues en utilisant des tissus stockés à 4 ° C pour thiS durée. Cela offre une flexibilité accrue lors du transfert d'échantillons entre la clinique et le laboratoire de recherche. Comme l'isolation de l'ARN et la culture d'explants sont effectuées dans le laboratoire de recherche et non dans la clinique, cette fonctionnalité rend le biorepository basé sur la clinique un modèle plus robuste que prévu précédemment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Pour la connaissance de l'auteur, ce protocole est le premier de son genre qui se concentre sur l'achat clinique d'échantillons de tissus cutanés dans une approche rentable et rapide. Les patients subissant une microchirurgie Mohs sont généralement programmés pendant des blocs de temps spécifiques, et la collecte est limitée à ces périodes. La collecte d'échantillons implique l'effort de l'assistant médical impliqué dans les soins aux patients, l'histotechnologue de Mohs qui traite les échantillons de tumeur et un membre du personnel de laboratoire désigné qui gère l'entrée de l'échantillon et le traitement du sang.

Avec une coordination minutieuse entre les trois membres de l'équipe de collecte ( c'est-à-dire l'assistant médical, Mohs histotechnologist et technicien de laboratoire), nous avons constaté que le personnel d'assistance médicale existant peut compléter les tâches supplémentaires associées à la collecte de 3-5 échantillons de tissus Par jour sans retard apparent dans les opérations cliniques. Obtenir le consentement du patient Et la collecte des écouvillons buccal et du sang sont complétés pendant les périodes d'attente normales impliquées dans la procédure de microchirurgie de Mohs. Outre la prise de décision sur la façon dont un échantillon doit être traité, les tâches pour lesquelles le responsable de l'histochnologie de Mohs est responsable sont complétées à la fin du traitement par Mohs des échantillons de patients et ajouteront généralement environ 30 minutes à l'horaire quotidien. En règle générale, un membre du personnel de la clinique est responsable de l'étiquetage et du traitement des échantillons de sang et pour effectuer tout transfert et saisie d'échantillons dans la base de données. En fonction du nombre d'échantillons traités, ces tâches peuvent exiger un temps important en dehors des tâches existantes; Par conséquent, la collecte des échantillons ne doit être effectuée que si une équipe de laboratoire suffisante est disponible. Plus précisément, si plus de 5 échantillons sont collectés en une seule journée, ou si plusieurs échantillons de sang sont prélevés sur les patients, il faut plusieurs heures d'efforts supplémentaires du technicien de laboratoire.

Jove_content "> Au cours des jours de collecte, les assistants médicaux (MA) obtiennent le consentement des patients pour des dons de tissus. L'MA obtient par la suite un prélèvement buccal (et de la salive, le cas échéant) et collecte du sang pour le traitement par le personnel de laboratoire. L'implication du patient après la collecte de ces échantillons, du point de vue du patient, le reste de la visite de la clinique est inchangé (bien qu'on leur demande de faire un don de sang au cours d'une visite de suivi). Actuellement, nous pouvons estimer que 70% des patients consentent Pour faire don de tissus, avec 30% de ces patients faisant également un don de sang, 30% refusent de participer. Actuellement, seuls les patients présentant un diagnostic de cancer biopathique sont inclus dans le biorepository. Les patients atteints d'une maladie transmissible transmissible transmise par le sang sont exclus .

Le membre du personnel de laboratoire est responsable de la coordination avec les deux autres membres de l'équipe de collecte et enregistre les échantillons collectés (tableau 1). Après unLa collecte initiale des échantillons, le formulaire de consentement complété, le sang et les écouvillons buccaux sont transférés au membre du personnel du laboratoire, et les initiales du donneur, la date de naissance et d'autres informations pertinentes, telles que le type d'échantillon, sont enregistrées. Cela permet d'enregistrer les nombres et les types d'échantillons collectés avec chaque patient pendant la procédure de collecte. Les tableaux d'écrans résumant le traitement du tissu SCC ( Figure 6 ) et de l'ANT (Figure 7) sont des outils utiles pour la formation du nouveau personnel dans les procédures de collecte.

Figure 6
Figure 6: Organigramme délimitant le traitement des échantillons SCC. Lors de l'excision tumorale, la taille de l'échantillon est évaluée. Si l'échantillon est ≤ 2 mm 3 , l'échantillon entier est utilisé pour le traitement de Mohs, comme l'évaluation des marges propres (l'indicateurUne suppression complète de la tumeur) est la priorité absolue. Après le traitement de Mohs, tout tissu restant est congelé dans de l'azote liquide et transféré au biorepository. Si l'échantillon est assez grand, de sorte qu'une partie> 2 mm 3 du tissu peut être retirée, cette partie est recueillie et placée dans un tube contenant un milieu de culture cellulaire, tandis que la partie restante est utilisée pour le traitement de Mohs et stockée comme ci-dessus. La partie de l'échantillon retirée au milieu de culture cellulaire est encore segmentée, avec un fragment de 0,5 mm 3 éliminé et utilisé pour l'établissement d'une ligne de culture cellulaire; Le fragment de tissu restant est transféré au biorepository pour l'analyse en aval des protéines et des expressions génétiques. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Er.within-page = "1"> Figure 7
Figure 7: Organigramme délimitant le traitement des échantillons ANT. Au moment de la fermeture de Mohs, une partie du tissu normal adjacent (ANT) est retirée et collectée par le chirurgien Mohs. Si la taille de l'échantillon est ≤2 mm 3 , l'échantillon entier est placé dans un tube cryogénique et congelé dans de l'azote liquide avant de le transférer au biorepository. Si l'échantillon est> 2 mm 3 , l'échantillon entier est d'abord placé dans un tube contenant un milieu de culture cellulaire. L'échantillon est ensuite sectionné en un fragment de ~ 0,5 mm 3 , pour être utilisé pour l'établissement de lignes de culture cellulaire. La section de tissu restante est transférée au biorepository pour être stockée pour l'analyse en aval des protéines et des expressions génétiques.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Ce protocole est conçu pour minimiser les variations entre les échantillons dans le biorepository. La coordination et la communication efficace entre le personnel de la clinique et entre la clinique et tout le personnel de laboratoire est essentielle pour minimiser la variabilité et pour maximiser l'obtention d'ADN, d'ARN et de protéines de haute qualité provenant des tissus. Alors que l'ADN et la protéine dans les tissus sont robustes, si l'ARN est souhaité, il est essentiel de garder les tissus froids et dans le milieu approprié pendant la collecte, le transport et le traitement afin de maintenir l'intégrité de l'ARN. Une tenue précise des registres est également essentielle pour lier les échantillons des patients avec leur historique et leur diagnostic, car ces informations sont souvent nécessaires lors de l'analyse des résultats des applications en aval.

Avec l'intérêt croissant pour la médecine personnalisée et la bioRecherche de marqueurs, un certain nombre de biorepositories ont récemment été établis. Ceux-ci sont généralement associés à des cliniques hospitalières dans de grands centres universitaires et ont des coûts substantiels impliqués dans la configuration et l'opération 2 , 8 , 19 . Le développement d'un biorepository clinique pour les échantillons de cancer cutané généré dans le cadre de la pratique quotidienne présente plusieurs avantages clés par rapport aux autres biorepositories. Tout d'abord, avec un seul site de collecte et de traitement d'échantillons, les variations de la gestion des échantillons, qui peuvent compromettre les applications en aval, sont minimisées. Deuxièmement, comme ces échantillons donnés sont tirés d'une population de patients stable, l'accès aux dossiers médicaux désidentifiés et aux données sur les résultats du patient sont sans équivalent. Ces données peuvent être anonymisées et transférées du tableau du patient à la base de données biorepository au moment de la collecte des échantillons ou lors d'une visite de suivi. Troisièmement, avec une base de patient fidèle, le clLe biorepository basé sur l'intempérie est capable de rassembler plusieurs échantillons du même patient, un ensemble d'échantillons non souvent obtenu dans d'autres paramètres. L'une des limites de ce protocole est qu'il a été optimisé pour les échantillons cutanés obtenus grâce à la chirurgie micrographique de Mohs et peut avoir besoin d'être modifié pour d'autres types de tissus ou de procédures cliniques.

Dans l'ensemble, l'un des principaux objectifs du biorepository est de fournir un large éventail d'échantillons du même donneur pour permettre aux chercheurs de poser une large gamme de questions, en particulier pour le développement de biopsies liquides et de marqueurs de cancer. Plus précisément, la capacité de corréler l'histologie tumorale et l'expression des biomarqueurs aux niveaux de l'ARNm et de la protéine aux échantillons de plasma, ainsi que la capacité de référencer les résultats des patients, crée un ensemble de données unique. Nous espérons que le modèle de biorepository basé sur la clinique peut être utilisé pour aider à atténuer la pénurie d'échantillons de patients dans la recherche biomédicale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des fonds du Collège de l'Université du Midwestern, Subvention de facilitation de la recherche en sciences de la santé, décerné à EEH, et Midwestern University, Bureau de la recherche et programmes sponsorisés Intramural Grant, décerné à KJL. Un soutien supplémentaire a été fourni par les Laboratoires Affiliés et la Dermatologie Affiliée. Nous remercions Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel et Ali Zaidi pour leur assistance technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA ThermoFisher Scientific 02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades ThermoFisher Scientific 50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps ThermoFisher Scientific 16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium ThermoFisher Scientific NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound ThermoFisher Scientific 50-363-579
Leica CM1950 Cryostat Leica Biosystems 14047743909
Frosted Microscope Slides ThermoFisher Scientific 12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit ThermoFisher Scientific 99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes ThermoFisher Scientific 03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab  ThermoFisher Scientific NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer ThermoFisher Scientific 50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer ThermoFisher Scientific 12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle ThermoFisher Scientific 121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific 13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140148
Gibco 1 M Hepes ThermoFisher Scientific 15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent ThermoFisher Scientific 1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 Abnova MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody Abnova ABX-144A
Anti MUC-1 antibody Santa Cruz Biotech sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246) Abcam Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin Molecular Probes  A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Molecular Probes  P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera Zeiss 4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera Olympus IX511F3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, M. Biorepositories: Building better biobanks. Nature. 486, 141-146 (2012).
  2. Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
  3. Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
  4. National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
  5. Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
  6. Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
  7. Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
  8. Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
  9. Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
  10. Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
  11. Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
  12. Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
  13. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
  14. Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
  15. Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
  16. Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
  17. Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
  18. Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
  19. Vaught, J. Developments in biospecimen research. Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).

Tags

Medicine Biorepository clinique cancer de la peau chirurgie de Mohs carcinome épidermoïde traitement des tissus banque de tissus
Création d&#39;un biorepository basé sur une clinique
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Belden, S. E., Uppalapati, C. K.,… More

Belden, S. E., Uppalapati, C. K., Pascual, A. S., Montgomery, M. R., Leyva, K. J., Hull, E. E., Averitte, R. L. Establishment of a Clinic-based Biorepository. J. Vis. Exp. (123), e55583, doi:10.3791/55583 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter