Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

إنشاء مستودع حيوي قائم على العيادة

Published: May 29, 2017 doi: 10.3791/55583
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3, 1
1Affiliated Dermatology & Affiliated Laboratories, Midwestern University Osteopathic Postdoctoral Training Institute, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Arizona College of Osteopathic Medicine, Midwestern University, 3Biomedical Sciences Program, College of Health Sciences, Midwestern University

Summary

وغالبا ما يتم التخلص من الأورام الجلدية بعد جراحة ميكروغرافيك موس. يتم وصف بروتوكول هنا أن تمكن موظفي الدعم السريري لمعالجة وتخزين الورم الجلدي على نحو فعال (على سبيل المثال، سرطان الخلايا الحرشفية ، سرطان الخلايا القاعدية، وسرطان الجلد) عينات لتطبيقات المختبر المصب دون التدخل في العمليات السريرية.

Abstract

وازدادت حالات الإصابة بسرطان الجلد ( مثل سرطان الخلايا الحرشفية وسرطان الخلايا القاعدية وسرطان الجلد) خلال السنوات القليلة الماضية. ومن المتوقع أن يكون هناك طلب مواز لعينات الورم الجلدية للدراسات البحثية الطبية الحيوية. غير أن توافر الأنسجة محدود نظرا لتكلفة إنشاء مستودع حيوي وعدم وجود بروتوكولات متاحة للحصول على عينات سريرية لا تتداخل مع العمليات السريرية. تم إنشاء بروتوكول لجمع ومعالجة الورم الجلدي وعينات الدم واللعاب المرتبطة به والتي لها تأثير ضئيل على الإجراءات السريرية الروتينية في تاريخ جراحة موس. يتم جمع عينات الورم ومعالجتها من المرضى الذين يخضعون لطبقتهم الأولى من جراحة موس للأمراض الخبيثة الجلدية ثبت خزعة من قبل مهندس الهستولوجيا موس. يتم جمع الأنسجة العادية المجاورة في وقت إغلاق الجراحية. العينات الإضافية التي يمكن جمعها هي مسحات كاملة الدم والشدق. من خلال استخدام عينات الأنسجة التي يتم التخلص منها عادة، تم إنشاء مستودع حيوي يقدم العديد من المزايا الرئيسية من خلال أن يكون مقرها في العيادة مقابل إعداد المختبر. وتشمل هذه مجموعة واسعة من العينات التي تم جمعها. الوصول إلى سجلات المرضى التي تم تحديدها، بما في ذلك تقارير علم الأمراض؛ والجهات المانحة النموذجية، الحصول على عينات إضافية خلال زيارات المتابعة.

Introduction

يعتمد السرطان وعلامات العلامات البيولوجية على العرض من عينات الأنسجة البشرية ذات الجودة العالية، وقد أعاق العرض المحدود البحث 1 ، 2 . العديد من الدراسات الجلدية محدودة بسبب عدم كفاية العرض، ونوعية متغيرة، والتكاليف المرتبطة باستخدام الأنسجة البشرية. وقدرت تكلفة إنشاء بنك بيوبانك كبير ومكرس بما يقرب من مليوني دولار 3 ، وهذه التكاليف تضع استخدام الأنسجة البشرية بعيدا عن متناول العديد من الباحثين. وعلاوة على ذلك، فإن عملية توليد وتخزين عينات البحوث تشكل خطرا على التأثير على العمليات السريرية وتأخير رعاية المرضى إذا لم يتم تنفيذها بعناية. وقد تم إنشاء مستودع حيوي فعال من حيث التكلفة ومستند إلى العيادة يركز على عينات سرطان الجلد بعد اتباع أفضل الممارسات الموصى بها والتحقق من صحة العينة 4 و 5 و 6 .

7 ، 8 .

والهدف من تقنية الجراحة المجهرية موس هو التأكد من إزالة جميع الأنسجة السرطانية مع الحفاظ على أكبر قدر ممكن من الأنسجة السليمة. الإجراء ينطوي على الإزالة التدريجية للطبقات الرقيقة من أنسجة الورم. كل طبقة متعاقبة لهفحص (بعد كريوسكتيونينغ الأنسجة الورم وأداء H & E تلطيخ) من قبل طبيب الأمراض الجلدية لتحديد ما إذا كان قد تم إزالة جميع الأنسجة السرطانية. يتم تنفيذ استئصال وفحص الطبقات اللاحقة من الأنسجة في حين يبقى المريض في المكتب. وتعتبر هذه التقنية الخيار الأفضل لعلاج شك 9 . عند هذه النقطة، يتم إغلاق الجرح، لتحسين الشفاء والمظهر التجميلي، والأنسجة العادية المجاورة (أنت) في كثير من الأحيان استئصال. وبالتالي، فإن هذا الإجراء الجراحي لإزالة الورم هو مثالي مثالي لجمع الأنسجة نسيجيا للدراسات المستقبلية.

وقد تم تصميم إجراءات الشراء للحصول على أنسجة الورم، الأنسجة الطبيعية المجاورة، اللعاب، وعينات الدم ليكون لها تأثير ضئيل على واجبات الموظفين العادية ( الشكل 1 ). ويقوم المساعدين الطبيين بإجراء عمليات سحب الدم أثناء تحضير المريض للإجراء. بعد الانتهاء من إجراء موس، و M أوهس هيستوتيشنولوجيست إعداد شرائح نسيجية إضافية من العينة ونقل الأنسجة إلى مستودع حيوي. وتشمل التكاليف المرتبطة بإنشاء مستودع حيوي شراء مجمدات للحفظ بالتبريد، وإنشاء حيز مختبر طبي متواضع، ووضع برنامج لتتبع المخزون.

شكل 1
الشكل 1: تسلسل جمع العينات والموظفين المسؤولين. عند تسجيل المريض والحصول على موافقة المريض، يقوم المساعد الطبي بجمع مسحة الشدق وإجراء عملية سحب الدم. طبيب الأمراض الجلدية والمساعد الطبي ثم استئصال الورم وإغلاق الجرح، وخلال ذلك الوقت يتم جمع شك و أنت العينات، على التوالي. يقوم فني مختبرات متخصص بمعالجة الدم والأقسام عينات شك و أنت لثقافة الأنسجة، وحفظها، والدخول في مستودع حيوي.ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تنوع العينات التي تم جمعها تمكن مجموعة متنوعة من النهج التجريبية ( الشكل 2 ). العينات التي تم جمعها من المريض هي مسحات الشدق (اللعاب ويمكن أيضا أن تجمع إذا لزم الأمر)، والدم الكامل، والأنسجة استئصال. يتم حفظ مسحات الشدق وعينة من الدم كله، من دون معالجة، من أجل التنميط الجيني والأنسجة مطابقة. يتم فصل الدم الكامل إلى خلايا الدم البيضاء (وك) وكسور البلازما للتحليلات المستقبلية. بعد تجهيز موهس، يتم وضع الورم المجمد مباشرة في النيتروجين السائل ونقلها إلى الفريزر -80 درجة مئوية. يتم استزراع جديدة، الأنسجة الورم قابلة للحياة وعينات أنت باستخدام تعديلات التقنيات السابقة 10 ، 11 ثم كريوبريزرفيد. أثناء التجميع، يتم تسجيل عدد كل نوع من أنواع العينات على جدول بيانات قبل الدخول إلى برنامج تتبع المخزون لتيسير المعالجة الدقيقة ( الجدول 1 ).

الشكل 2
الشكل 2: الخطوط العريضة لجمع العينات البيولوجية المستندة إلى العيادة ومعالجتها. يتم جمع مسحة الشدق وعينة الدم من المريض وتخزينها للتوليف الجيني والمطابقة الأنسجة. يتم معالجة الدم الكامل أيضا لعزل خلايا الدم البيضاء (وك) وتحليل كتك، وكذلك لجمع البلازما وتحليل خزعة السائل. الأنسجة استئصال خلال إجراء موس يتم معالجتها نسيجيا لأغراض التشخيص، وبعد ذلك الشرائح نسيجية يمكن استخدامها تجريبيا لمزيد من التحليلات المناعية. شريطة أن عينة الأنسجة استئصال كبيرة بما فيه الكفاية، يتم إزالة جزء من الأنسجة الطازجة ومقطوع للبروتين وعزل الحمض النووي الريبي، وإنشاء خطوط الخلايا المستزرعة.55583 / 55583fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تاريخ المجموعة:
المريض 1 المريض 2 المريض 3 المريض 4 المريض 5
البدايات وتاريخ الميلاد
لون العين
نوع العينة
موقع العينة
لعاب
Wثقب الدم
بلازما
الورم فيابل
الأنسجة عادي قابل للحياة
الورم موهس النيتروجين السائل
الأنسجة العادية النيتروجين السائل
الشرائح

الجدول 1: قائمة مرجعية لتسجيل مجموعات العينات. البيانات التي تم تتبعها وتسجيلها مع كل عينة تم جمعها تشمل الأحرف الأولى للمريض، وتاريخ الميلاد، ولون العين (للطباعة الجلد)، وكذلك الموقععلى إزالة العينة. كما يتم تسجيل عدد لعينات اللعاب، وأحجام جمع الدم، وعدد من عينات الأنسجة قابلة للحياة والحفاظ عليها التي تم جمعها كمراجع للمخصصات لاستخدامها لاحقا. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

للتحقق من صحة إجراءات جمع العينات، تم اختبار كل نوع من عينات في التطبيقات المصب. باستخدام التعديلات من التقنيات السابقة 12 ، الورم و أنت قد استخدمت بنجاح في البروتين وعزل الحمض النووي الريبي ويمكن أن تستخدم لعزل الحمض النووي. وقد تم تقييم إإكسبلنتس قابلة للحياة أنشئت من أقسام الأنسجة عن طريق الفحص المجهري، في حين تم استخدام الشرائح النسيجية المخزنة لالمناعية والمناعي.

من خلال اتباع بروتوكول الموصوفة هنا، فمن الممكن لتوسيع هذا النموذج إلى عيادات الأمراض الجلدية الأخرى، وأنواع الورم الأخرى (مثل سرطان الجلد)، وغيرها من التخصصات والممارسات الجراحية لتوفير عينات الأنسجة البشرية للأبحاث متعددة الأوجه في سرطان الإنسان. التعديلات الطفيفة من هذا البروتوكول من المرجح أن تكون ضرورية لممارسات أخرى ولكن، من حيث المبدأ، وهذا البروتوكول ينطبق على أي ممارسة الجراحية التي تتجاهل بشكل روتيني عينات المريض التي تم جمعها في سياق علاج المريض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على عينات الأنسجة البشرية من قبل إيرب الغربية (بروتوكول ويرب # 20142461). المعيار الوحيد لجمع الأنسجة لهذه الإجراءات هو تشخيص خزعة ثبت من شك. لم يتم تحديد معايير الاستبعاد في بروتوكول إيرب الأصلي، ولكن لم يتم استخدام عينات من المرضى الذين يعانون من الأمراض المعدية المنقولة عن طريق الدم. تم الحصول على موافقة مستنيرة قبل جمع الأنسجة الجلدية والدم واللعاب. وافق مجلس المراجعة المؤسسية الغربية الغربية على عمل التحقق من صحة مع عينات المستودع الحيوي المستندة إلى العيادة في جامعة ميدوسترن (أز # 807).

1. الجلدي معالجة الأنسجة الورم

ملاحظة: هذا هو ليتم تنفيذها من قبل مهندس الهستولوجيا موس.

  1. معالجة سرطان الخلايا الحرشفية الطازجة (شك) الأنسجة ل رنا و إكسبلانت الثقافة
    1. بعد أن تم استئصال الأنسجة من قبل جراح موس، حصاد 10 إلى 50 ملغ (≥10 مم 3 ملاحظة: هذا ممكن فقط إذا كان الورم كبيرة بما يكفي للسماح لعينة 10-50 ملغ حجم (≥10 مم 2 ) لإزالتها قبل التقييم النسيجي، الذي هو جزء من إجراء موس. إذا كان الورم ليست كبيرة بما فيه الكفاية للسماح بحد أدنى 2 مم 3 لإزالتها، لا المضي قدما في معالجة ل رنا (تخطي الخطوة 5).
    2. نقل الأنسجة القابلة للحياة إلى أنبوب المسمى 1.5 مل يحتوي على ثقافة المتوسطة (1: 1 خليط من دمم: هام F-12، 25 هيبيس هيبيس، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) باستخدام ملاقط وضمان أن الأنسجة مغمورة تماما في المتوسطة. تخزين هذا الأنبوب في 4 درجات مئوية قبل معالجة إضافية.
    3. استخدام الأنسجة لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير (انظر الخطوة 5) و / أو إنشاء(انظر الخطوة 6) خلال 24 ساعة.
    4. وضع ما تبقى من عينة الورم التي تمت إزالتها من المريض (الخطوة 1.1.1) على حامل الأنسجة البرد البرد (أو "تشاك"). تضمين الأنسجة في درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) مجمع، وتجميد الأنسجة داخل حامل، للسماح لاستكمال موس الأنسجة ولإعداد الشرائح النسيجية إضافية للتحليل التجريبي.
  2. إعداد الشرائح النسيجية
    1. قطع أقسام الأنسجة 7 ميكرون سميكة باستخدام البرد وإنشاء اثنين (أو أكثر) الشرائح لكل عينة الورم. تأكد من أن كل شريحة تحتوي على ما يصل إلى ثلاثة أقسام من الورم الكامل.
      ملاحظة: سوف تكون ملطخة واحدة من الشرائح اثنين باستخدام H & E من قبل التكنولوجيا الهوس موهس، والشرائح الإضافية (ق) يمكن معالجتها مع إف، إهك، أو فيش التحليل.
    2. وضع الشرائح في الأسيتون لمدة 1-2 ثانية لإصلاح الأنسجة. تعيين هذه الشرائح جانبا لتجف. لا H & Eوصمة عار أو ساترة الشريحة لاستخدامها في المناعي في المستقبل (إف)، المناعية (إهك)، أو مضان في الموقع التهجين (فيش) التحليل، اعتمادا على البروتوكول التجريبي.
  3. تجهيز الأنسجة بعد موس
    1. مرة واحدة وقد تم الانتهاء من تجهيز موهس (الخطوات 1.1-1.2)، والعمل في غرفة البرد ونقش العينة من البرد تضمين المتوسطة ووضع الأنسجة في أنبوب المبردة المسمى.
    2. وضع قارورة المسمى في النيتروجين السائل قبل أن ذوبان الأنسجة. إذا كانت العينات لاستخدامها في تحليل البروتين و / أو الحمض النووي، فإنها يمكن نقلها إلى النيتروجين السائل أو الفريزر -80 درجة مئوية في غضون بضع دقائق ليتم تخزينها لتعبير البروتين في المستقبل وتحليل الحمض النووي طفرة (انظر الخطوات 4-5) .
      ملاحظة: إذا كان المطلوب رنا سليمة من العينة بعد موهس، فمن الضروري للحفاظ على العينة المجمدة أثناء الإزالة من المتوسطة التضمين البرد. إذا لم يتم ممارسة العناية القصوى فيهذه الخطوة، يجب أن تكون محفوظة عينة ما بعد مهس لتحليل البروتين و / أو الحمض النووي.
  4. معالجة النمل الطازج
    1. في وقت إغلاق موس، الحصول على أنت من جراح موس.
    2. إزالة كمية متساوية أو أكبر من أنت كما تم حصادها من عينة شك (انظر أعلاه) من الجانب القمي من الأنسجة الطبيعية ونقله إلى أنبوب المسمى 1.5 مل تحتوي على مستنبت (1: 1 خليط من دمم: هام F- 12 تستكمل مع 25 ملي هيبيس، 100 وحدة دولية / مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) باستخدام ملاقط.
    3. تزج تماما الأنسجة في نفس المتوسطة الثقافة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى المعالجة اللاحقة (انظر الخطوات 4-6).

2. الدم واللعاب، ومعالجة مسدق الشدق

  1. الحصول على حوالي 10 مل من الدم في أنابيب جمع إدتا عن طريق الوريد.
  2. نقل الدم من أنابيب جمع إلى العقيمة 15- أو 50 مل أنبوب الطرد المركزي. إزالة حوالي 200 ميكرولتر في أنبوب المبردة 1.5 مل، وتجنب فقاعات. تخزين هذه العينة كاملة الدم في -80 درجة مئوية، لاستخدامها في التنميط الجيني في المستقبل والأنسجة مطابقة، إذا لزم الأمر.
    1. تدور الدم المتبقية في 1000 x ج لمدة 30 دقيقة واتبع الإجراءات القياسية لجمع جزء البلازما.
    2. قسامة البلازما إلى 1 مل الزيادات في 1.5 مل أنابيب المبردة وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها خلال تحليلات الخزعة السائل في المستقبل.
  3. استخدام مسحة معقمة للحصول على عينة مسحة الشدق وتخزين مسحة في أنبوب معقمة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إذا لزم الأمر، والحصول على عينة اللعاب وتخزينها في أنبوب معقمة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن استخدام هذه العينات لالمستقبلية التنميط الجيني والأنسجة مطابقة، إذا لزم الأمر.

3. ريكوردكيبينغ من العينات

  1. نقل المعلومات من القائمة المرجعية لعينات المرضى إلى قاعدة بيانات التخزين الحيوي. تضمين معلومات المريض و دياغنوسيس من المخطط المريض.
  2. طباعة تسميات مع الباركود لكل عينة وتسجيل كل في قاعدة البيانات لربط كل عينة تم جمعها مع بيانات المريض.
  3. تسجيل توزيع العينات التي تم تحديدها في قاعدة البيانات البيولوجية قبل نقل العينات إلى مختبر البحوث.

4. عزل البروتين وتحليل لطخة غربية

  1. وضع كل عينة الأنسجة (شك و / أو أنت) في قارورة تحتوي على 500 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني لكل 100 ملغ من الأنسجة إلى ليز الأنسجة.
    ملاحظة: استخدمنا فحص مقايسة مناعي رادي (ريبا) العازلة، تتألف من 50 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم، 1.0٪ نب-40، و 0.1٪ سدز. ويمكن استخدام مخازن أخرى تحلل الخلية.
  2. تجانس الأنسجة باستخدام الخالط الأنسجة لمدة 5 دقائق في فترات 20 ثانية في 4 درجات مئوية. تدور العينات في 21،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وجمع طاف تحتوي على البروتين إلى تو الطازجةيكون. إعادة تدور طاف باستخدام نفس الظروف وجمع طاف النهائي في أنبوب جديد.
  3. إليكتروفوريز 30-50 ميكروغرام من البروتين من كل عينة باستخدام 4-20٪ سدز بولي أكريلاميد التدرج هلام. وصمة عار الجل مع كوماسي الأزرق لتصور العصابات البروتين، إذا رغبت في ذلك.
  4. إذا كان هناك حاجة إلى تحليل لطخة غربية من البروتينات أعرب، ونقل البروتينات من هلام إلى غشاء البولي فينيلدين (بفدف) غشاء بعد البروتوكولات القياسية. بعد نقل، بونسو وصمة عار على غشاء بفدف لتصور العصابات البروتين، إذا رغبت في ذلك.
  5. منع غشاء بفدف والمسبار للكشف عن البروتينات من الفائدة بعد البروتوكولات القياسية. استخدام الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين (ق) من الفائدة، جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة المقابلة للأجسام المضادة الأولية، في تركيزات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لتحليل لطخة غربية.
  6. فضح غشاء التحقيق باستخدام الركيزة تشيميلومينسنت وصورة الغشاء باستخدام الخيالنغ.

5. عزل الحمض النووي الريبي وكمية البلمرة تفاعل سلسلة (قر)

  1. وضع فورا عينات الأنسجة الطازجة (شك و / أو أنت) في أنبوب 1.5 مل تحتوي على حل الاستقرار الحمض النووي الريبي ومكان ما بعد عينات الأنسجة موس في أنبوب 1.5 مل تحتوي على حل الانتقال الأنسجة المجمدة، في أعقاب توصيات الشركة المصنعة. تأكد من أن الأنسجة مغمورة تماما. تخزين هذه العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. إزالة عينات الحمض النووي الريبي من -80 درجة مئوية والذوبان على الجليد. نقل الأنسجة إلى أنبوب 1.5 مل جديد يحتوي على 1 مل من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي (الفينول / غوانيدين ثيوسيانات) لكل 50-100 ملغ من الأنسجة.
  3. ليس الأنسجة باستخدام الخالط الأنسجة. أداء ست دورات من التجانس، تليها فترة من عينة التبريد. كل دورة تتكون من 20 ثانية من التجانس في 4 درجات مئوية وفترة التبريد 40 ثانية. بعد التجانس، واحتضان العينة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة 0.2مل من الكلوروفورم لكل 1 مل من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي ويهز الأنبوب بقوة باليد لمدة 15 ثانية. احتضان لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. تدور العينات في 12،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إزالة المرحلة المائية للعينة ووضعه في أنبوب 1.5 مل جديد.
  6. إضافة 0.5 مل من الأيزوبروبانول 100٪ لكل 1 مل من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي المستخدمة في الخطوة 5.2 إلى المرحلة المائية واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: إذا كان من المتوقع أن تكون منخفضة الغلة ( أي، وحجم الأنسجة ابتداء من أقل من 10 ملغ)، وعينات قد عجلت بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، 5 ميكروغرام من الجليكوجين خالية من ريبونوكلياز لكل 500 ميكرولتر من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي يمكن أن تضاف خلال خطوة هطول الأيزوبروبانول لتحسين غلة الحمض النووي الريبي.
  7. تدور العينة في 12،000 x ج في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف وغسل بيليه مع 1 مل من الايثانول 75٪.
  8. دوامة العينة لفترة وجيزة ثم تدور في 7،500 زغ و 4 درجةC لمدة 5 دقائق. تجاهل غسل والهواء الجاف بيليه لمدة 5-10 دقيقة.
  9. ريسوسبيند بيليه الحمض النووي الريبي في 20 ميكرولتر من المياه خالية من ريبونوكلياز.
    1. إذا رغبت في ذلك، وتنقية كل عينة رنا باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي بعد توصيات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: سيتم فقدان رنا صغيرة من العينة إذا تم تنفيذ هذه الخطوة.
  10. إلكتروفوريز عينة 1 ميكروغرام باستخدام الفورمالديهايد - 1٪ الفورمالديهايد - هلام الاغاروز لتحليل نوعية الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: كبديل، وتحليل العينات باستخدام بيواناليزر للحصول على رقم رين 13 .
  11. عكس نسخ الحمض النووي الريبي إلى [كدنا] باستخدام بروتوكول النسخ العكسي لتحليل قر من مرناس الهدف (أو ميرناس) من الفائدة.

6. الأنسجة الثقافات إكسبلانت

  1. تعقيم الأنسجة استئصال قبل الثقافة من خلال غمس الأنسجة إلى 70٪ من الإيثانول.
  2. وضع الأنسجة على شريحة أو طبق وإضافة ما يكفي من الوسط الثقافي (1: 1 خليط من دمم: هام &39؛ ق F-12 تستكمل مع 10٪ فبس، 25 هيبيس ملي، 100 وحدة دولية / مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) لتغطية الأنسجة (لمنع الأنسجة من التجفيف). قطع بعناية الأنسجة إلى شظايا (<1 مم 3 ) باستخدام شفرة مشرط.
  3. نقل شظايا الأنسجة إلى طبق الثقافة الأنسجة 35 ملم وإضافة ما يقرب من 20 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنين (فبس) على رأس كل جزء.
  4. ترك الطبق مفتوحة في غطاء الثقافة لمدة 20-30 دقيقة، أو حتى الجافة تقريبا.
  5. إضافة 1 مل من الوسط الثقافي (1: 1 خليط من دمم: هام F-12 تستكمل مع 10٪ فبس، 25 ملي هيبيس، 100 وحدة دولية / مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) إلى كل طبق واحتضان عند 37 درجة C في 5٪ كو 2 . ثقافة فرعية أو شبه استنساخ الثقافات إذا لزم الأمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدمت الورم و أنت بنجاح في عزل البروتين واختبارها من قبل النشاف الغربية. كما هو مبين في الشكل (3) ، يمكن الكشف عن علامات سرطان الخلايا الحرشفية الجلدية (Muc1 14 ، فل-1 15 ، و p40 16 ، 17 ) في عينات المرضى التي تم جمعها وتخزينها في مستودعنا الحيوي القائم على العيادة.

الشكل 3
الشكل 3: تحليل البروتينات المستخرجة من أنت و شك. تم عزل البروتين الكلي من عينات أنت و شك، وتم فحص التعبير عن علامات معروفة ل شك من قبل لطخة غربية. يتم عرض النقط الغربية الممثل من موسين 1 (MUC1)، عامل H مثل 1 (فل-1)، و P40 (لوحة B). حجةسي انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم اختبار الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام التقنيات المذكورة أعلاه من قبل الكهربائي هلام، قر، وتحليل سلامة الحمض النووي الريبي. ويبين الشكل 4 اثنين من عينات المريض التي تم عزل رنا سليمة، سليمة. الحمض النووي الريبي هو مناسبة لجميع التطبيقات المصب.

الشكل 4
الشكل 4: تحليل سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام التحليل الحيوي. تقييم حجم الحمض النووي الريبي والنزاهة عن طريق الرحلان الكهربائي (لوحة A). تم إنشاء رقم سلامة الحمض النووي الريبي (رين) لكل عينة على أساس التتبع الكهربي لعينة الحمض النووي الريبي، بما في ذلك نسبة الحمض النووي الريبي الريباسي ووجود أو عدم وجود منتجات التحلل (لوحة B). يمثل رين من "10" عينة رنا مثالية، دون أي منتجات انحلال، في حين أن "1" يمثل سا متدهورة تماما mple. يتم رسم ملامح كثافة قياس العصابات كما وحدات مضان (فو) مقابل النيوكليوتيدات (نت) (لوحة C) لعينات رنا تمثيلية من شك وأنس أنس المريض. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد تم تقييم إإكسبلنتس قابلة للحياة أنشئت من أقسام الأنسجة عن طريق الفحص المجهري ( الشكل 5A ). هذه الثقافات إكسلانت، ولدت من الورم وعينات أنت، يتم خلط الخلايا الكيراتينية والثقافات الليفية. هذه الثقافات قد تكون فرعية أو تستخدم لتطوير خط الخلية في المستقبل. وقد استخدمت الشرائح النسيجية المخزنة لالمناعية ومناعي. يظهر في الشكل 5B ، عينة شك يظهر تلطيخ إيجابي لظهارية إلى علامة انتقالية الوسيطة في شك 18 .

-page = "1"> الشكل 5
الشكل 5: ثقافة إكسبلانت و إف تلطيخ أقسام شك. صورة على النقيض من صورة سرطان الخلايا الحرشفية سرطان إيسلانت الأنسجة (لوحة A، شريط مقياس = 50 ميكرون) وأقسام الأنسجة تجمعوا كجزء من جراحة ميكروغرافيك موس، ملطخة الأجسام المضادة الأولية بسيلن / سلوغ الأولية (لوحة B، شريط مقياس = 25 ميكرون ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لقد حددنا تجريبيا أن الأنسجة يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة 24-48 ساعة قبل العزلة الحمض النووي الريبي (الخطوة 5) أو ثقافة إكسلانت (الخطوة 6) دون التأثير على النتائج. العائد الحمض النووي الريبي أو النزاهة، كما تم تقييمه من قبل هلام الكهربائي أو بيواناليزر ورقم رين، لا تتعرض للخطر. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الحصول على الثقافات إكسلانت بسهولة باستخدام الأنسجة المخزنة في 4 درجات مئوية ل ثيق طول الوقت. وهذا يوفر مرونة متزايدة عند نقل العينات بين العيادة ومختبر الأبحاث. كما يتم تنفيذ العزلة الحمض النووي الريبي وثقافة إكسلانت في مختبر البحوث وليس في العيادة، وهذه الميزة يجعل المستودع الحيوي المستندة إلى العيادة نموذج أكثر قوة مما كنا نتوقع سابقا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إلى علم المؤلف، وهذا البروتوكول هو الأول من نوعه الذي يركز على المشتريات السريرية من عينات الأنسجة الجلدية في كل من نهج فعالة من حيث التكلفة وسريعة. وعادة ما يتم تحديد المرضى الذين يخضعون لجراحة المجهرية موه خلال فترات محددة من الزمن، ويقتصر جمع هذه الفترات. جمع العينات يتضمن جهد من المساعد الطبي المشارك في رعاية المرضى، ومهندس التكنولوجيا الهستولوجية الذي يعالج عينات الورم، وموظف مختبر معين يعالج عينة الدخول وتجهيز الدم.

مع التنسيق الدقيق بين أعضاء فريق التحصيل الثلاثة ( أي المساعد الطبي، والمهندس التكنولوجي موس، وفني المختبر)، وجدنا أن موظفي المساعدة الطبية القائمة يمكن إكمال المهام الإضافية المرتبطة جمع 3-5 عينات الأنسجة يوميا دون أي تأخير واضح في عمليات العيادة. الحصول على موافقة المريض ويتم جمع المسحات الشدقية والدم خلال فترات الانتظار العادية التي تنطوي عليها إجراءات المجهرية. وبخلاف اتخاذ القرار حول كيفية معالجة العينة، يتم الانتهاء من المهام التي يتحملها اختصاصي هندسة التكنولوجيا في موس في نهاية معالجة موهس لعينات المرضى، وعادة ما تضيف حوالي 30 دقيقة إلى الجدول اليومي. وعادة ما يكون أحد أعضاء طاقم العيادة مسؤولا عن وضع العلامات وتجهيز عينات الدم وإجراء أي نقل وإدخال العينات في قاعدة البيانات. واعتمادا على عدد العينات التي تم تجهيزها، قد تتطلب هذه الواجبات وقتا كبيرا بعيدا عن الواجبات القائمة؛ وبالتالي، ينبغي أن يتم جمع العينات فقط عندما يتوفر عدد كاف من الموظفين المختبريين. على وجه التحديد، إذا تم جمع أكثر من 5 عينات في يوم واحد، أو إذا تم جمع العديد من عينات الدم من المرضى، هناك حاجة إلى عدة ساعات من الجهد الإضافي من فني المختبر.

jove_content "> في أيام الجمع، يحصل المساعدين الطبيين على موافقة من المرضى على التبرع بالأنسجة، ويحصل ما بعد ذلك على مسحة شدق (واللعاب، إذا لزم الأمر) ويجمع الدم للمعالجة من قبل العاملين في المختبرات، وليس هناك أكثر مشاركة المريض بعد جمع هذه العينات، لذلك من وجهة نظر المريض، ما تبقى من زيارة العيادة لم يتغير (على الرغم من أن يطلب منهم التبرع بالدم خلال أي زيارة المتابعة) في الوقت الحالي، يمكننا أن نقدر أن 70٪ من المرضى الموافقة للتبرع بالأنسجة، مع 30٪ من هؤلاء المرضى أيضا التبرع بالدم، و 30٪ تراجع للمشاركة في الوقت الحالي، يتم تضمين المرضى فقط مع تشخيص خزعة ثبت من السرطان في مستودع حيوي، ويستثنى المرضى الذين يعانون من الأمراض المعروفة المنقولة عن طريق الدم .

ويكون موظف المختبر مسؤولا عن التنسيق مع العضوين الآخرين في فريق التحصيل ويسجل العينات التي يتم جمعها (الجدول 1). بعديتم حتويل عينات العينات األولية واستمارة املوافقة املكتملة والدم واملسحات الشدقية إىل موظف املخترب، ويتم تسجيل األحرف األولية للجهة املانحة وتاريخ امليالد واملعلومات األخرى ذات الصلة مثل نوع العينة. وهذا يسمح لتسجيل أرقام وأنواع العينات التي تم جمعها مع كل مريض أثناء إجراء جمع. الرسوم البيانية تدفق تلخيص تجهيز كل من شك الأنسجة ( الشكل 6 ) و أنت (الشكل 7) هي أدوات مفيدة لتدريب الموظفين الجدد في إجراءات جمع.

الشكل 6
الشكل 6: مخطط انسيابي يحدد معالجة عينات شك. عند استئصال الورم، يتم تقييم حجم العينة. إذا كانت العينة ≤2 مم 3 يتم استخدام العينة بأكملها لمعالجة موه، وتقييم الهوامش النظيفة (المؤشر آفة إزالة الورم كاملة) هو الأولوية القصوى. بعد المعالجة موهس، يتم تجميد أي الأنسجة المتبقية في النيتروجين السائل ونقلها إلى مستودع حيوي. إذا كانت العينة كبيرة بما فيه الكفاية، بحيث يمكن إزالة> 2 مم 3 جزء من الأنسجة، ويتم جمع هذا الجزء ووضعها في أنبوب يحتوي على خلية ثقافة المتوسطة، في حين أن الجزء المتبقي يستخدم ل موه تجهيز وتخزينها على النحو الوارد أعلاه. الجزء من عينة إزالتها إلى وسط زراعة الخلايا هو مزيد مجزأة، مع ~ 0.5 مم 3 جزء إزالة واستخدامها لإنشاء خط زراعة الخلية. يتم نقل جزء الأنسجة المتبقية إلى مستودع حيوي للبروتين المصب وتحليل التعبير الجيني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

er.within الصفحات = "1"> الشكل 7
الشكل 7: مخطط انسيابي يحدد معالجة عينات أنت. في وقت إغلاق موس، يتم إزالة جزء من الأنسجة الطبيعية المجاورة (أنت) وجمعها من قبل جراح موس. إذا كان حجم العينة ≤2 مم 3 ، يتم وضع العينة بأكملها في أنبوب المبردة وتجميدها في النيتروجين السائل قبل نقلها إلى مستودع حيوي. إذا كانت العينة> 2 مم 3 ، يتم وضع العينة بأكملها لأول مرة في أنبوب يحتوي على خلية ثقافة المتوسطة. ومن ثم مقطوع العينة إلى مزيد من ~ 0.5 مم 3 جزء، لاستخدامها في إنشاء خطوط زراعة الخلايا. يتم نقل قسم الأنسجة المتبقية إلى مستودع حيوي ليتم تخزينها للبروتين المصب وتحليل التعبير الجيني.55583 / 55583fig7large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تصميم هذا البروتوكول لتقليل التباين بين العينات داخل مستودع حيوي. التنسيق والتواصل الفعال بين موظفي العيادة وبين العيادة وجميع العاملين في المختبرات أمر ضروري لتقليل التباين وتحقيق أقصى قدر من الحمض النووي عالي الجودة، رنا، والبروتين من الأنسجة. في حين أن الحمض النووي والبروتين داخل الأنسجة هي قوية، إذا كان المطلوب رنا، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على الأنسجة الباردة وفي الوسط المناسب أثناء جمع ونقل ومعالجة من أجل الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. إن حفظ السجلات بدقة أمر حيوي أيضا لربط عينات المرضى مع تاريخهم وتشخيصهم، حيث أن هذه المعلومات غالبا ما تكون مطلوبة عند تحليل النتائج من التطبيقات المصب.

مع الاهتمام المتزايد في الطب شخصية والبيولوجيةوقد تم مؤخرا إنشاء عدد من المستودعات الحيوية. وعادة ما ترتبط هذه العيادات بالعيادات التي تتخذ من المستشفى مقرا لها في مراكز أكاديمية كبيرة ولها تكاليف كبيرة تتعلق بالإعداد والتشغيل 2 ، 8 ، 19 . إن تطوير مستودع حيوي قائم على العيادة لعينات سرطان الجلد التي يتم إنشاؤها كجزء من الممارسة اليومية له العديد من المزايا الرئيسية على المستودعات الحيوية الأخرى. أولا، مع مجموعة واحدة ومعالجة العينات الموقع، يتم تقليل الاختلافات في التعامل مع العينة، والتي يمكن أن تضر التطبيقات المصب. ثانيا، نظرا لأن هذه العينات المتبرع بها مستمدة من عدد مستقر من المرضى، فإن الوصول إلى السجلات الطبية التي تم تحديدها ونتائج نتائج المرضى لا مثيل لها. قد تكون هذه البيانات مجهولة المصدر ونقلها من مخطط المريض إلى قاعدة بيانات مستودع التخزين الحيوي في وقت جمع العينات أو في زيارة متابعة. ثالثا، مع قاعدة المرضى المخلصين، وكلالمستودع الحيوي القائم على إينيك قادر على جمع عينات متعددة من نفس المريض، مجموعة عينة لا غالبا ما يتم الحصول عليها في إعدادات أخرى. واحدة من القيود المفروضة على هذا البروتوكول هو أنه قد تم الأمثل للعينات الجلدية التي تم الحصول عليها من خلال جراحة ميكروغرافيك موس وربما تحتاج إلى تعديل لأنواع أخرى من الأنسجة أو الإجراءات السريرية.

وعموما، فإن أحد الأهداف الرئيسية للمستودع الحيوي هو توفير طيف واسع من العينات من نفس المانح لتمكين الباحثين من طرح مجموعة واسعة من الأسئلة، وخاصة من أجل تطوير الخزعات السائلة وعلامات السرطان. على وجه التحديد، والقدرة على ربط الأنسجة الورم والتعبير عن المؤشرات الحيوية في مرنا ومستويات البروتين لعينات البلازما، فضلا عن القدرة على الرجوع إلى بيانات نتائج المريض، ويخلق مجموعة بيانات فريدة من نوعها. ويحدونا الأمل في أن يتم استخدام نموذج المستودع الحيوي المستندة إلى العيادة للمساعدة في تخفيف النقص في عينات المرضى في البحوث الطبية الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من أموال من جامعة ميدوسترن كلية العلوم الصحية منحة تسهيل البحوث، منحت ل إيه، ومكتب جامعة ميدوسترن للبحوث والبرامج برعاية منحة الداخلية، التي منحت ل كيل. وقدمت دعما إضافيا من قبل المختبرات التابعة والأمراض الجلدية التابعة لها. نشكر سارة بوتيكين، جيمي بارتو، ستيفاني فوكس، كودي جوردينغ، ستاسي شيمكي، هيذر كيسيل، وعلي زايدي على مساعدتهم التقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA ThermoFisher Scientific 02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades ThermoFisher Scientific 50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps ThermoFisher Scientific 16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium ThermoFisher Scientific NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound ThermoFisher Scientific 50-363-579
Leica CM1950 Cryostat Leica Biosystems 14047743909
Frosted Microscope Slides ThermoFisher Scientific 12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit ThermoFisher Scientific 99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes ThermoFisher Scientific 03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab  ThermoFisher Scientific NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer ThermoFisher Scientific 50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer ThermoFisher Scientific 12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle ThermoFisher Scientific 121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific 13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140148
Gibco 1 M Hepes ThermoFisher Scientific 15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent ThermoFisher Scientific 1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 Abnova MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody Abnova ABX-144A
Anti MUC-1 antibody Santa Cruz Biotech sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246) Abcam Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin Molecular Probes  A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Molecular Probes  P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera Zeiss 4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera Olympus IX511F3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, M. Biorepositories: Building better biobanks. Nature. 486, 141-146 (2012).
  2. Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
  3. Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
  4. National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
  5. Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
  6. Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
  7. Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
  8. Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
  9. Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
  10. Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
  11. Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
  12. Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
  13. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
  14. Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
  15. Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
  16. Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
  17. Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
  18. Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
  19. Vaught, J. Developments in biospecimen research. Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).

Tags

الطب، العدد 123، المستندة إلى عيادة بيوبوسيتوري، سرطان الجلد، جراحة موس، سرطان الخلايا الحرشفية، تجهيز الأنسجة، بنك الأنسجة
إنشاء مستودع حيوي قائم على العيادة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Belden, S. E., Uppalapati, C. K.,… More

Belden, S. E., Uppalapati, C. K., Pascual, A. S., Montgomery, M. R., Leyva, K. J., Hull, E. E., Averitte, R. L. Establishment of a Clinic-based Biorepository. J. Vis. Exp. (123), e55583, doi:10.3791/55583 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter