Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Etablering af et klinisk-baseret biorepository

Published: May 29, 2017 doi: 10.3791/55583
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3, 1
1Affiliated Dermatology & Affiliated Laboratories, Midwestern University Osteopathic Postdoctoral Training Institute, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Arizona College of Osteopathic Medicine, Midwestern University, 3Biomedical Sciences Program, College of Health Sciences, Midwestern University

Summary

Kutane tumorer kasseres ofte efter Mohs mikrografisk kirurgi. Der beskrives en protokol her, der gør det muligt for klinisk supportpersonale effektivt at behandle og lagre kutan tumor ( fx pladecellekarcinom, basalcellekarcinom og melanom) prøver til downstream-laboratorieapplikationer uden at forstyrre kliniske operationer.

Abstract

Forekomsten af ​​hudkræft ( fx pladecellekarcinom, basalcellecarcinom og melanom) har været stigende i løbet af de seneste år. Det forventes, at der vil være en parallel efterspørgsel efter kutane tumorprøver til biomedicinske undersøgelser. Tilgængelighed af væv er imidlertid begrænset på grund af omkostningerne ved etablering af et biorepository og manglen på protokoller til rådighed for opnåelse af kliniske prøver, der ikke forstyrrer kliniske operationer. En protokol blev oprettet for at indsamle og behandle kutan tumor og tilhørende blod- og spytprøver, der har minimal indflydelse på rutinemæssige kliniske procedurer på datoen for en Mohs-kirurgi. Tumorprøver opsamles og behandles fra patienter, der gennemgår deres første lag af Mohs-kirurgi for biopsi-bevist kutan malignitet hos Mohs-histoteknologen. Tilstødende normalt væv opsamles på tidspunktet for kirurgisk lukning. Yderligere prøver, der kan indsamles, er helblod og buccal swabs. Ved at udnytte vævsprøver, der normalt kasseres, blev der dannet et biorepository, der giver flere vigtige fordele ved at være baseret i klinikken versus laboratorieindstillingen. Disse omfatter en bred vifte af indsamlede prøver; Adgang til deidentificerede patientjournaler, herunder patologirapporter; Og for den typiske donor adgang til yderligere prøver under opfølgende besøg.

Introduction

Kræft- og biomarkørforskning er afhængig af en levering af humane vævsprøver af høj kvalitet, og begrænset forsyning har forhindret forskning 1 , 2 . Mange dermatologiske undersøgelser er begrænset af utilstrækkelig forsyning, variabel kvalitet og omkostninger forbundet med brugen af ​​humant væv. Omkostningerne til at etablere en stor dedikeret biobank er anslået til at være ca. 2 millioner dollars 3 , og disse omkostninger sætter brugen af ​​humant væv utilgængeligt for mange forskere. Desuden udgør processen med generering og opbevaring af undersøgelsesprøver risikoen for at påvirke kliniske operationer og forsinke patientpleje, hvis den ikke udføres forsigtigt. En omkostningseffektiv klinikbaseret biorepository er blevet etableret, der fokuserer på hudkræftprøver efter anbefalede bedste praksis og prøvevalidering 4 , 5 , 6 .

7 , 8 .

Målet med Mohs mikrografiske kirurgi teknikken er at sikre, at alt kræftvæv fjernes, samtidig med at der sikres så meget sundt væv. Proceduren involverer progressiv fjernelse af tynde lag af tumorvæv. Hvert efterfølgende lag er hansTologisk undersøgt (efter kryosektion af tumorvævet og udførelse af H & E-farvning) af en hudlæge for at bestemme, om alt kræftvæv er blevet fjernet. Excisionen og undersøgelsen af ​​efterfølgende lag af væv udføres mens patienten forbliver på kontoret. Denne teknik anses for at være den bedste behandlingsmulighed for SCC 9 . På dette tidspunkt er såret lukket og for at forbedre helbredelse og kosmetisk udseende udskæres nærliggende normalt væv (ANT) ofte. Således er denne kirurgiske procedure til fjernelse af en tumor ideel til indsamling af histologisk kendetegnet væv til fremtidige studier.

Indkøbsproceduren for at opnå tumorvæv, der støder op til normalt væv, spyt og blodprøver, er designet til at få minimal indflydelse på normale personaleopgaver ( figur 1 ). Medicinske assistenter udfører blodet, mens patienten forberedes til proceduren. Efter afslutningen af ​​Mohs-proceduren er M Ohs histoteknologen forbereder yderligere histologiske dias af prøven og overfører vævet til biorepositoryet. Omkostninger forbundet med etablering af biorepository omfatter køb af cryopreservation-frysere, oprettelse af beskedent klinisk laboratorierum og udvikling af et opsporingssporingsprogram.

figur 1
Figur 1: Sekvens af prøveopsamling og ansvarlig personale. Ved patientindcheckning og opnåelse af patientens samtykke indsamler den lægeassistent en buccal swab og udfører en blodtegning. Dermatologen og medicinsk assistent beskytter derefter tumoren og lukker såret, i hvilket tidsrum SCC og ANT prøver opsamles. En dedikeret laboratorie tekniker behandler blodet og sektioner SCC og ANT prøverne til vævskultur, bevaring og indgang i biorepository.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Mangfoldigheden af ​​de indsamlede prøver muliggør en række eksperimentelle tilgange ( figur 2 ). Prøver indsamlet fra patienten er buccale swabs (spyt kan også opsamles om nødvendigt), helblod og udskåret væv. Buccal swabs og en prøve fra hele blodet er gemt, uden behandling, til genotyping og vævsafstemning. Hele blod separeres i hvide blodlegemer (WBC) og plasmafraktioner til fremtidige analyser. Efter Mohs-forarbejdning placeres den frosne tumor direkte i flydende nitrogen og overføres til en -80 ° C fryser. Friske, levedygtige tumorvæv og ANT-prøver dyrkes under anvendelse af modifikationer af tidligere teknikker 10 , 11 og derefter kryopreserveret. Under indsamlingen registreres antallet af hver prøvetype på et regneark inden indgangen til Opsporingssporingsprogrammet for at lette nøjagtig behandling ( tabel 1 ).

Figur 2
Figur 2: Oversigt over klinikbaseret biorepositoryprøveindsamling og -behandling. En buccal vatpind og blodprøve opsamles fra patienten og opbevares til downstream genotyping og vævsafstemning. Hele blod behandles yderligere til isolering af hvide blodlegemer og CTC-analyser samt for plasmaindsamling og væskebiopsianalyse. Væv udskåret under Mohs-proceduren behandles histologisk til diagnostiske formål, hvorefter de histologiske lysbilleder kan anvendes eksperimentelt til yderligere immunhistokemiske analyser. Forudsat at den udskårne vævsprøve er stor nok, fjernes en del af frisk væv og snittes for protein- og RNA-isolering og til etablering af dyrkede cellelinjer.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Indsamlingsdato:
Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5
Initialer og fødselsdato
Øjenfarve
Prøvetype
Prøveplacering
Spyt
WHul blod
Plasma
Tumor levedygtig
Tissue Normal Viable
Tumor Mohs Flydende Kvælstof
Tissue Normal Flydende Kvælstof
Slides

Tabel 1: Tjekliste for at optage stikprøver. Data, der spores og registreres med hver indsamlet prøve, omfatter patientens initialer, fødselsdato og øjenfarve (til hudtyping) samt lokaliseringenPå prøveudtagning. Antallet af spytprøver, blodopsamlingsvolumener og antallet af levende og konserverede vævsprøver indsamles registreres også som referencer for tildelinger til senere anvendelser. Klik her for at downloade denne fil.

For at validere prøveopsamlingsprocedurer er hver prøvetype testet i downstream applikationer. Ved anvendelse af modifikationer af tidligere teknikker 12 er tumor og ANT blevet anvendt med succes i protein- og RNA-isolering og kan potentielt anvendes til DNA-isolering. Levende eksplanter, der er etableret fra vævssektionerne, er blevet evalueret ved mikroskopi, mens lagrede histologiske lysbilleder er blevet anvendt til immunhistokemi og immunofluorescens.

Ved at følge den her beskrevne protokol er det muligt at udvide denne model til andre dermatologiklinikker, andre tumortyper (såsom melanom), Og andre kirurgiske specialiteter og praksis til at tilvejebringe humane vævsprøver til mangesidig forskning i humane kræftformer. Små modifikationer af denne protokol er sandsynligvis nødvendige for andre former for praksis, men i princippet gælder denne protokol for enhver kirurgisk praksis, der rutinemæssigt kasserer patientprøver indsamlet under patientbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt forsøg på humane vævsprøver blev godkendt af Western IRB (WIRB Protocol # 20142461). Det eneste kriterium for indsamling af væv til disse procedurer er en biopsi-bekræftet diagnose af SCC. Ingen udelukkelseskriterier blev skitseret i den oprindelige IRB-protokol, men prøver fra patienter med en kendt blodbåret smitsom sygdom blev ikke anvendt. Informeret samtykke blev opnået inden indsamling af kutant væv, blod og spyt. Midwestern Institutional Review Board godkendte valideringsarbejdet med klinikbaserede biorepository prøver på Midwestern University (AZ # 807).

1. Kutan tumorvævsbehandling

BEMÆRK: Dette skal udføres af en Mohs histoteknolog.

  1. Behandling af friskt pladecellecarcinom (SCC) væv til RNA og eksplicit kultur
    1. Efter at vævet er udskåret af Mohs-kirurgen, høst en 10 til 50 mg (≥10 mm 3 BEMÆRK: Dette er kun muligt, hvis tumoren er stor nok til at fjerne en prøve på 10-50 mg (≥10 mm 2 ) før den histologiske vurdering, som er en del af Mohs-proceduren. Hvis tumoren ikke er stor nok til at fjerne mindst 2 mm 3, skal du ikke fortsætte med behandling for RNA (spring trin 5).
    2. Overfør det levedygtige væv til et mærket 1,5 ml rør indeholdende dyrkningsmedium (1: 1 blanding af DMEM: Ham's F-12, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) ved anvendelse af pincetter og sikre, at Væv er helt nedsænket i mediet. Opbevar dette rør ved 4 ° C inden yderligere behandling.
    3. Brug vævet til RNA-isolation og ekspressionsanalyse (se trin 5) og / eller etableringenEnt explant kultur (se trin 6) inden for 24 timer.
    4. Anbring resten af ​​den tumorprøve, der blev fjernet fra patienten (trin 1.1.1) på en cryostatvævsholder (eller "chuck"). Embed vævet i optimal skæringstemperatur (OCT) forbindelse, fryser vævet inde i holderen, for at muliggøre færdiggørelsen af ​​Mohs histologi og til fremstilling af yderligere histologiske lysbilleder til eksperimentel analyse.
  2. Fremstilling af histologiske lysbilleder
    1. Klip vævssektioner 7 μm tykt ved hjælp af en kryostat og lav to (eller flere) dias for hver tumorprøve. Sørg for, at hvert dias indeholder op til tre dele af den komplette tumor.
      BEMÆRK: En af de to lysbilleder bliver farvet ved hjælp af H & E af Mohs histoteknologen, og de yderligere dias (r) kan behandles med IF, IHC eller FISH analyse.
    2. Placer diasene i acetone i 1-2 s for at løse vævet. Sæt disse lysbilleder til side for at tørre. Må ikke H & EPletter eller dækker glideren, der skal bruges til fremtidig immunfluorescens (IF), immunhistokemi (IHC) eller fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse, afhængigt af forsøgsprotokollen.
  3. Behandling af post-Mohs væv
    1. Når først Mohs-forarbejdning er gennemført (trin 1.1-1.2), arbejde i kryostatkammeret og smør prøven fra det cryo-indlejringsmedium og læg vævet i et mærket kryogenrør.
    2. Anbring det mærkede hætteglas i flydende nitrogen, før vævet har optøet. Hvis prøver skal anvendes til protein- og / eller DNA-analyse, kan de overføres til flydende nitrogen eller en -80 ° C fryser inden for få minutter for at blive opbevaret til fremtidig proteinekspression og DNA-mutationsanalyse (se trin 4-5) .
      BEMÆRK: Hvis intakt RNA ønskes fra post-Mohs-prøven, er det vigtigt at holde prøven frosset under fjernelsen fra cryo-indlejringsmediet. Hvis ekstrem pleje ikke udøves påDette trin bør post-Mohs-prøven reserveres til protein- og / eller DNA-analyse.
  4. Behandling af frisk ANT
    1. På tidspunktet for Mohs lukning, få ANT fra Mohs kirurg.
    2. Fjern en lige eller større mængde ANT som høstet fra SCC-prøven (se ovenfor) fra den apikale side af det normale væv og overfør det til et mærket 1,5 ml rør indeholdende dyrkningsmedium (1: 1 blanding af DMEM: Ham's F- 12 suppleret med 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) ved anvendelse af pincetter.
    3. Fuldstændigt nedsænk vævet i det samme dyrkningsmedium og opbevar ved 4 ° C indtil efterfølgende behandling (se trin 4-6).

2. Blod-, spyt- og buccal swab-behandling

  1. Opnå ca. 10 ml blod i EDTA-indsamlingsrør via venipunktur.
  2. Overfør blodet fra opsamlingsrørene til et sterilt 15- eller 50 ml centrifugerør. Fjern ca. 200 μL i et 1,5 ml kryogent rør, undgå bobler; Opbevar denne helblodprøve ved -80 ° C, der skal bruges til fremtidig genotyping og vævsafstemning, hvis det er nødvendigt.
    1. Spin det resterende blod ved 1.000 xg i 30 minutter og følg standardprocedurer til opsamling af plasmafraktionen.
    2. Aliquot plasmaet i 1 ml inkrementer i 1,5 ml kryogen rør og opbevar ved -80 ° C til brug under fremtidige flydende biopsi analyser.
  3. Brug en steril vatpind til opnåelse af en buccal swabprøve og opbevar vatpinden i et sterilt rør ved stuetemperatur.
  4. Hvis det er nødvendigt, få en spytprøve og opbevar i et sterilt rør ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Disse prøver kan bruges til fremtidig genotyping og vævsmatchning, hvis det er nødvendigt.

3. Registrering af prøver

  1. Overfør information fra tjekliste over patientprøver til biorepositorydatabasen. Medtag patientinformation og diagNosis fra patientdiagrammet.
  2. Udskriv etiketter med en stregkode for hver stikprøve og registrer hver i databasen for at forbinde hver indsamlet prøve med patientdata.
  3. Optag fordelingen af ​​de de-identificerede prøver i biorepositorydatabasen forud for overførsel af prøverne til forskningslaboratoriet.

4. Proteinisolering og Western Blot Analysis

  1. Placer hver vævsprøve (SCC og / eller ANT) i et hætteglas indeholdende 500 μl cellelysbuffer indeholdende proteaseinhibitorer pr. 100 mg væv til lysning af vævet.
    BEMÆRK: Vi anvendte en radioimmunoprecipitationsassay (RIPA) buffer, sammensat af 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCI, 0,5% natriumdeoxycholat, 1,0% NP-40 og 0,1% SDS. Andre cellelysisbuffere kan anvendes.
  2. Homogeniser vævene ved hjælp af en vævshomogenisator i 5 minutter i intervaller på 20 s ved 4 ° C. Spin prøverne ved 21.000 xg og 4 ° C i 20 min og saml det supernatantholdige protein ind i en frisk tuvære. Spind supernatanten igen under anvendelse af de samme betingelser og opsaml den endelige supernatant i et frisk rør.
  3. Elektroforese 30-50 μg protein fra hver prøve ved anvendelse af en 4-20% SDS-polyacrylamidgradientgel. Stain gelen med Coomassie Blue for at visualisere proteinbånd, hvis det ønskes.
  4. Hvis der kræves Western blot-analyse af udtrykte proteiner, overfør proteinerne fra gelen til en polyvinyliden-difluorid-membran (PVDF) efter standardprotokoller. Efter overførsel pletter Ponceau PVDF-membranen for at visualisere proteinbånd, hvis det ønskes.
  5. Bloker PVDF-membranen og sonden for at detektere proteiner af interesse efter standardprotokoller. Brug primære antistoffer, der er specifikke for proteinet / proteinerne af interesse, sammen med tilsvarende sekundære antistoffer, der er specifikke for de primære antistoffer, i koncentrationer anbefalet af producenten for Western blot-analyse.
  6. Udsæt den probede membran ved hjælp af et kemiluminescerende substrat og billedet membranen ved hjælp af en imagiNg system.

5. RNA-isolering og kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR)

  1. Anbring straks friskrekseprøver (SCC og / eller ANT) i et 1,5 ml rør, der indeholder en RNA-stabiliseringsopløsning, og læg post-Mohs vævsprøver i et 1,5 ml rør indeholdende en frosset vævsovergangsløsning efter producentens anbefalinger. Sørg for, at vævet er helt nedsænket. Opbevar disse prøver ved -80 ° C indtil brug.
  2. Fjern RNA-prøverne fra -80 ° C og optø på is. Overfør vævet til et nyt 1,5 ml rør indeholdende 1 ml RNA-ekstraktionsbuffer (phenol / guanidinthiocyanat) pr. 50-100 mg væv.
  3. Lyse vævene ved hjælp af en vævshomogenisator. Udfør seks cykler af homogenisering efterfulgt af en periode med prøvekøling; Hver cyklus består af 20 s homogenisering ved 4 ° C og en 40 s køleperiode. Efter homogenisering inkuberes prøven i 5 minutter ved stuetemperatur.
  4. Tilføj 0,2Ml chloroform pr. 1 ml RNA-ekstraktionsbuffer og ryst røret kraftigt i hånden i 15 s. Inkubér i 2-3 minutter ved stuetemperatur.
  5. Spin prøverne ved 12.000 xg og 4 ° C i 15 minutter. Fjern prøveens vandige fase og læg den i et nyt 1,5 ml rør.
  6. Tilsæt 0,5 ml 100% isopropanol pr. 1 ml af RNA-ekstraktionsbufferen anvendt i trin 5.2 til den vandige fase og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Hvis RNA-udbyttet forventes at være lavt ( dvs. startvævsvolumen er mindre end 10 mg), kan prøver udfældes natten over ved -80 ° C. Derudover kan 5 μg RNase-frit glycogen pr. 500 μl RNA-ekstraktionsbuffer tilsættes under isopropanol-udfældningstrinnet for at forbedre RNA-udbytter.
  7. Spin prøven ved 12.000 xg ved 4 ° C i 10 minutter. Fjern supernatanten og vask pelleten med 1 ml 75% ethanol.
  8. Vortex prøven kort og drej den derefter på 7.500 xg og 4 °C i 5 min. Kassér vasken og lufttør pellet i 5-10 minutter.
  9. Resuspender RNA-pellet i 20 μl RNase-frit vand.
    1. Rens om ønsket RNA-prøve ved brug af et RNA-oprydningssæt efter producentens anbefalinger.
      BEMÆRK: Små RNA'er vil gå tabt fra prøven, hvis dette trin udføres.
  10. Elektroforese en 1 μg prøve ved anvendelse af en 1,2% formaldehyd-MOPS agarosegel for at analysere kvaliteten af ​​RNA.
    BEMÆRK: Som et alternativ, analyser prøver ved hjælp af en bioanalysator for at opnå et RIN nummer 13 .
  11. Omvendt transkriberer RNA'et til cDNA ved anvendelse af en revers transkriptionsprotokol til qPCR analyse af målmRNA'er (eller miRNA'er) af interesse.

6. Væv Explantantkulturer

  1. Steriliser det udskårne væv forud for dyrkning ved at dyppe vævet i 70% ethanol.
  2. Placer vævet på et dias eller en skål og tilsæt nok kulturmedium (1: 1 blanding af DMEM: skinke og #39; s F-12 suppleret med 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) til at dække vævet (for at forhindre væv i at tørre). Skær vævet forsigtigt i fragmenter (<1 mm 3 ) ved hjælp af et skalpelsblad.
  3. Overfør vævsfragmenterne til en 35 mm vævskulturskål og tilsæt ca. 20 μl føtalt bovint serum (FBS) oven på hvert fragment.
  4. Lad skålen stå åben i en kogeplade i 20-30 minutter, eller indtil den er næsten tør.
  5. Tilsæt 1 ml kulturmedium (1: 1 blanding af DMEM: Ham's F-12 suppleret med 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) til hver skål og inkuber ved 37 ° C C i 5% CO 2 . Subkultur eller subklone kulturerne, hvis det er nødvendigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tumor og ANT er blevet anvendt succesfuldt i proteinisolering og testet ved Western blotting. Som vist i figur 3 kan kutane pladecellekarcinommarkører (Muc114, FHL-115 og p40 16 , 17 ) detekteres i patientprøver indsamlet og opbevaret i vores klinikbaserede biorepository.

Figur 3
Figur 3: Analyse af proteiner ekstraheret fra ANT og SCC. Total protein blev isoleret fra ANT- og SCC-prøver, og ekspressionen af ​​kendte markører for SCC blev undersøgt af Western blot. Repræsentative Western blots af mucin 1 (MUC1), Factor H Like-1 (FHL-1) og p40 (panel B) er vist. anbringendeSe klik her for at se en større version af denne figur.

RNA isoleret ved anvendelse af ovennævnte teknikker er blevet testet ved gelelektroforese, qPCR og RNA-integritetsanalyse. Figur 4 viser to patientprøver, hvorfra højkvalitets, intakt RNA blev isoleret. RNA'en er velegnet til alle downstream applikationer.

Figur 4
Figur 4: RNA-integritetsanalyse ved anvendelse af bioanalyse. Vurdering af RNA-størrelse og integritet ved gelelektroforese (panel A). Et RNA integritetsnummer (RIN) blev genereret for hver prøve baseret på RNA-prøveens elektroforetiske spor, herunder forholdet mellem ribosomalt RNA og tilstedeværelsen eller fraværet af nedbrydningsprodukter (panel B). En RIN på "10" repræsenterer en perfekt RNA-prøve uden nogen nedbrydningsprodukter, mens "1" markerer et fuldstændigt nedbrudt sample. Densitometriprofiler af båndene er plottet som fluorescensenheder (FU) versus nukleotider (nt) (panel C) for repræsentative RNA-prøver fra SCC- og ANT-patientvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Levable eksplantater etableret fra vævssektionerne er blevet evalueret ved mikroskopi ( figur 5A ). Disse eksplanterende kulturer, der er dannet fra tumor- og ANT-prøver, er blandede keratinocytter og fibroblastkulturer. Disse kulturer kan subkultiveres eller anvendes til fremtidig cellelinieudvikling. Lagrede histologiske lysbilleder er blevet anvendt til immunhistokemi og immunofluorescens. Vist i Figur 5B viser en SCC-prøve positiv farvning for en epithelial-til-mesenkymal overgangsmarkør i SCC 18 .


Figur 5: Explant kultur og IF farvning af SCC sektioner. Fase kontrastbillede af et eksplanteret pladecellecarcinomvæv (panel A, Scale bar = 50 μm) og vævssektioner samlet som en del af Mohs mikrografisk kirurgi, farvet med et anti-pSnail / Slug primær antistof (panel B, Scale bar = 25 μm ). Klik her for at se en større version af denne figur.

Vi har eksperimentelt bestemt, at væv kan opbevares ved 4 ° C i 24-48 timer forud for RNA-isolering (trin 5) eller eksplanterende kultur (trin 6) uden at påvirke resultaterne. RNA udbytte eller integritet, som vurderet ved gelelektroforese eller bioanalysator og RIN-nummer, er ikke kompromitteret. Derudover opnås eksplanterende kulturer let under anvendelse af væv opbevaret ved 4 ° C for thiS tid. Dette giver øget fleksibilitet ved overførsel af prøver mellem klinikken og forskningslaboratoriet. Da RNA-isolering og eksplanterende kultur udføres i forskningslaboratoriet og ikke i klinikken, gør denne funktion den klinikbaserede biorepository en mere robust model, end vi tidligere havde forventet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efter forfatterens viden er denne protokol den første af sin art, der fokuserer på klinisk indkøb af kutane vævsprøver i både en omkostningseffektiv og hurtig tilgang. Patienter, der undergår Mohs-mikrokirurgi, er typisk planlagt i bestemte tidsblokke, og indsamling er begrænset til disse perioder. Prøveudtagning indebærer indsats fra den medicinske assistent, der er involveret i patientpleje, Mohs histoteknologen, der behandler tumorprøverne og en udpeget laboratoriemedlem, der håndterer prøveindgang og blodbehandling.

Med omhyggelig koordinering mellem de tre medlemmer af indsamlingsholdet ( dvs. den medicinske assistent, Mohs histoteknolog og laboratorie teknikere) har vi fundet ud af, at det eksisterende lægeassistent personale kan gennemføre de yderligere opgaver, der er forbundet med indsamling af 3-5 vævsprøver Dag uden nogen form for forsinkelse i kliniske operationer. Indhentning af patientens samtykke Og indsamling af buccal swabs og blod afsluttes under normale venteperioder involveret i Mohs-mikrokirurgiproceduren. Udover beslutningen om, hvordan en prøve skal behandles, udføres de opgaver, som Mohs histoteknologen er ansvarlig for, ved afslutningen af ​​Mohs behandling af patientprøver og vil typisk tilføje ca. 30 min til den daglige skema. Typisk er et medlem af klinikpersonalet ansvarligt for mærkning og behandling af blodprøverne og for at udføre overførsel og indlæsning af prøver i databasen. Afhængigt af antallet af behandlede prøver kan disse opgaver kræve betydelig tid væk fra eksisterende toldsatser; Prøveopsamlingen bør derfor kun udføres, når der er tilstrækkelig laboratoriepersonale til rådighed. Specifikt, hvis mere end 5 prøver opsamles på en enkelt dag, eller hvis flere blodprøver hentes fra patienter, er der brug for flere timers ekstra indsats fra laboratorietekniker.

Jove_content "> På samlingsdage får de medicinske assistenter (MA) samtykke fra patienterne til donationsvæv. MA får efterfølgende en buccal swab (og spyt, hvis det er nødvendigt) og indsamler blod til behandling af laboratoriepersonale. Der er ikke mere Patientinddragelse efter indsamling af disse prøver, så fra patientens synspunkt er resten af ​​klinikbesøget uændret (selvom de bliver bedt om at donere blod under et opfølgende besøg). I øjeblikket kan vi estimere, at 70% af patienterne samtykker At donere væv, hvoraf 30% af patienterne også donerer blod, 30% falder for at deltage. I øjeblikket er kun patienter med en biopsi-beviset kræftdiagnosticering inkluderet i biorepository. Patienter med en kendt overførbar sygdom i blodet er udelukket .

Laboratoriemedlemmet er ansvarlig for koordinering med de to andre medlemmer af indsamlingsholdet og registrerer de prøver, der indsamles (tabel 1). Efter aEn indledende prøveopsamling, den udfyldte samtykkeform, blod og buccal swabs overføres til laboratoriemedlemmet, og donorens initialer, fødselsdato og andre relevante oplysninger, såsom prøvestypen, registreres. Dette gør det muligt at optage numre og typer af prøver indsamlet med hver patient under indsamlingsproceduren. Flow diagrammerne, der opsummerer behandlingen af ​​både SCC væv ( Figur 6 ) og ANT (Figur 7), er nyttige værktøjer til uddannelse af nye medarbejdere i indsamlingsprocedurer.

Figur 6
Figur 6: Flowchart afgrænsning af behandling af SCC prøver. Ved tumorekscision vurderes størrelsen af ​​prøven. Hvis prøven er ≤2 mm 3, anvendes hele prøven til Mohs-behandling, som vurderingen af ​​rene margener (indikatorenAtion af fuldstændig tumorfjernelse) er topprioriteten. Efter Mohs-forarbejdning fryses eventuelt resterende væv i flydende nitrogen og overføres til biorepositoryet. Hvis prøven er stor nok, således at en> 2 mm 3 portion af vævet kan fjernes, opsamles denne portion og anbringes i et rør indeholdende cellekulturmedium, medens den resterende del anvendes til Mohs-behandling og opbevares som ovenfor. Den del af prøven fjernet til cellekulturmedium segmenteres yderligere, med et ~ 0,5 mm3 fragment fjernet og anvendt til etablering af en cellekulturlinie; Det resterende vævsfragment overføres til biorepositoryet for nedstrøms protein og genekspression analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

er.within-side = "1"> Figur 7
Figur 7: Flowchart afgrænsning af behandling af ANT-prøver. På tidspunktet for Mohs-lukningen fjernes en del af tilstødende normalt væv (ANT) og opsamles af Mohs-kirurgen. Hvis prøvestørrelsen er ≤2 mm 3 , placeres hele prøven i et kryogent rør og frosses i flydende nitrogen før overførsel til biorepositoryet. Hvis prøven er> 2 mm 3 , placeres hele prøven først i et rør indeholdende cellekulturmedium. Prøven skæres derefter yderligere ind i et ~ 0,5 mm3 fragment, der skal anvendes til etablering af cellekulturlinjer. Den resterende vævssektion overføres til biorepositoryet, der skal opbevares til downstream protein og genekspression analyse.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Denne protokol er designet til at minimere variationen mellem prøver i biorepository. Koordinering og effektiv kommunikation mellem klinikpersonalet og mellem klinikken og alle laboratoriepersonale er afgørende for at minimere variabiliteten og for at maksimere opnåelsen af ​​høj kvalitet DNA, RNA og protein fra vævene. Mens DNA og protein i vævene er robuste, hvis RNA er ønsket, er det afgørende at holde vævene kolde og i passende medium under indsamling, transport og behandling for at opretholde RNA-integriteten. Nøjagtig registrering er også afgørende for at forbinde patientprøverne med deres historie og diagnose, da disse oplysninger ofte er nødvendige for at analysere resultater fra downstream applikationer.

Med den stigende interesse for personlig medicin og bioMarkørforskning er der for nylig blevet etableret en række biorepositorier. Disse er typisk forbundet med hospitalsbaserede klinikker i store akademiske centre og har betydelige omkostninger involveret i opsætning og drift 2 , 8 , 19 . Udviklingen af ​​et klinikbaseret biorepository til kutane kræftprøver, der genereres som en del af den daglige praksis, har flere vigtige fordele i forhold til andre biorepositorier. For det første minimeres variationer i prøvehåndtering, der kan kompromittere nedstrøms applikationer, med et enkelt samlings- og prøvebehandlingssted. For det andet, da disse donerede prøver er trukket fra en stabil patientpopulation, er adgang til de-identificerede lægejournaler og patientudfaldsdata uovertruffen. Disse data kan anonymiseres og overføres fra patientdiagrammet til biorepositorydatabasen på tidspunktet for prøveopsamling eller på et opfølgende besøg. For det tredje, med en loyal patientbase, klInic-baserede biorepository er i stand til at samle flere prøver fra den samme patient, et prøve sæt, som ikke ofte opnås i andre indstillinger. En af begrænsningerne i denne protokol er, at den er blevet optimeret til kutane prøver opnået gennem Mohs mikrografisk kirurgi og kan muligvis modificeres for andre typer væv eller kliniske procedurer.

Alt i alt er et af de vigtigste mål for biorepository at tilvejebringe et bredt spektrum af prøver fra den samme donor, så forskere kan stille en lang række spørgsmål, især til udvikling af flydende biopsier og kræftmarkører. Specifikt skaber evnen til at korrelere tumorhistologi og ekspressionen af ​​biomarkører ved mRNA- og proteinniveauerne til plasmaprøver samt evnen til at referere til patientudfaldsdata et unikt kraftigt datasæt. Vi håber, at den klinikbaserede biorepositorymodel kan anvendes til at lette manglen på patientprøver i biomedicinsk forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af midler fra Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant, tildelt EEH, og Midwestern University Office of Research og sponsorerede programmer Intramural Grant, tildelt til KJL. Yderligere støtte blev ydet af tilknyttede laboratorier og tilknyttet dermatologi. Vi takker Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel og Ali Zaidi for deres tekniske assistance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA ThermoFisher Scientific 02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades ThermoFisher Scientific 50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps ThermoFisher Scientific 16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium ThermoFisher Scientific NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound ThermoFisher Scientific 50-363-579
Leica CM1950 Cryostat Leica Biosystems 14047743909
Frosted Microscope Slides ThermoFisher Scientific 12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit ThermoFisher Scientific 99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes ThermoFisher Scientific 03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab  ThermoFisher Scientific NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer ThermoFisher Scientific 50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer ThermoFisher Scientific 12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle ThermoFisher Scientific 121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific 13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140148
Gibco 1 M Hepes ThermoFisher Scientific 15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent ThermoFisher Scientific 1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 Abnova MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody Abnova ABX-144A
Anti MUC-1 antibody Santa Cruz Biotech sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246) Abcam Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin Molecular Probes  A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Molecular Probes  P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera Zeiss 4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera Olympus IX511F3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, M. Biorepositories: Building better biobanks. Nature. 486, 141-146 (2012).
  2. Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
  3. Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
  4. National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
  5. Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
  6. Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
  7. Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
  8. Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
  9. Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
  10. Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
  11. Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
  12. Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
  13. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
  14. Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
  15. Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
  16. Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
  17. Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
  18. Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
  19. Vaught, J. Developments in biospecimen research. Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).

Tags

Medicin udgave 123 klinikbaseret biorepository hudkræft Mohs-kirurgi pladecellecarcinom vævsbehandling vævsbank
Etablering af et klinisk-baseret biorepository
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Belden, S. E., Uppalapati, C. K.,… More

Belden, S. E., Uppalapati, C. K., Pascual, A. S., Montgomery, M. R., Leyva, K. J., Hull, E. E., Averitte, R. L. Establishment of a Clinic-based Biorepository. J. Vis. Exp. (123), e55583, doi:10.3791/55583 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter