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Medicine

Errichtung eines klinischen Biorepositorys

Published: May 29, 2017 doi: 10.3791/55583
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3, 1
1Affiliated Dermatology & Affiliated Laboratories, Midwestern University Osteopathic Postdoctoral Training Institute, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Arizona College of Osteopathic Medicine, Midwestern University, 3Biomedical Sciences Program, College of Health Sciences, Midwestern University

Summary

Kutane Tumoren werden oft nach Mohs mikrographischen Chirurgie verworfen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das es dem klinischen Hilfspersonal ermöglicht, kutane Tumor- ( zB Plattenepithelkarzinom-, Basalzellkarzinom- und Melanom-) Proben für nachgeschaltete Laboranwendungen effektiv zu verarbeiten und zu speichern, ohne die klinischen Operationen zu beeinträchtigen.

Abstract

Die Inzidenz von Hautkrebs ( z. B. Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom und Melanom) hat in den vergangenen Jahren zugenommen. Es wird erwartet, dass es eine parallele Nachfrage nach kutanen Tumorproben für biomedizinische Forschungsstudien gibt. Die Verfügbarkeit der Gewebe ist jedoch aufgrund der Kosten für die Etablierung eines Biorepositorys und des Mangels an Protokollen, die für die Erlangung von klinischen Proben zur Verfügung stehen, die die klinischen Operationen nicht beeinträchtigen, begrenzt. Es wurde ein Protokoll erstellt, um kutane Tumor und assoziierte Blut- und Speichelproben zu sammeln und zu verarbeiten, die minimale Auswirkungen auf routinemäßige klinische Verfahren am Tag einer Mohs-Chirurgie haben. Tumorproben werden gesammelt und verarbeitet von Patienten, die sich ihrer ersten Schicht der Mohs-Chirurgie für biopsie-bewährte Hautmalignitäten durch den Mohs-Histotechnologen unterziehen. Angrenzendes normales Gewebe wird zum Zeitpunkt des chirurgischen Verschlusses gesammelt. Zusätzliche Proben, die gesammelt werden können, sind Vollblut und bukkale Tupfer. Durch die Verwendung von Gewebeproben, die normalerweise verworfen werden, wurde ein Biorepository erzeugt, das mehrere wesentliche Vorteile bietet, indem es in der Klinik gegenüber der Laborumgebung basiert. Dazu gehören eine breite Palette von gesammelten Proben; Zugang zu erkannten Patientenakten, einschließlich Pathologieberichten; Und, für den typischen Spender, Zugang zu zusätzlichen Proben bei Folgebesuchen.

Introduction

Krebs- und Biomarkerforschung beruht auf einer Versorgung mit hochwertigen menschlichen Gewebeproben, und begrenztes Angebot hat die Forschung behindert 1 , 2 . Viele dermatologische Studien sind durch die unzureichende Versorgung, die variable Qualität und die Kosten im Zusammenhang mit der Verwendung von menschlichem Gewebe begrenzt. Die Kosten für die Gründung einer großen, dedizierten Biobank wurde auf etwa zwei Millionen Dollar 3 geschätzt, und diese Kosten legen die Verwendung von menschlichem Gewebe aus der Reichweite vieler Forscher. Darüber hinaus stellt der Prozess der Erzeugung und Speicherung von Forschungsproben das Risiko dar, klinische Operationen zu beeinträchtigen und die Patientenversorgung zu verzögern, wenn sie nicht sorgfältig durchgeführt wird. Es wurde ein kostengünstiges, klinikbasiertes Biorepository etabliert, das sich auf Hautkrebsproben nach empfohlenen Best Practices und Probenvalidierung 4 , 5 , 6 konzentriert.

7 , 8 .

Das Ziel der Mohs mikrographischen Chirurgie Technik ist, um sicherzustellen, dass alle Krebs Gewebe entfernt wird, während die Erhaltung so viel gesundes Gewebe wie möglich. Das Verfahren beinhaltet die fortschreitende Entfernung von dünnen Schichten von Tumorgewebe. Jede aufeinanderfolgende Schicht ist seineTologisch untersucht (nach der Kryosektion des Tumorgewebes und Durchführung von H & E-Färbung) durch einen Dermatologen, um festzustellen, ob alle Krebsgewebe entfernt worden sind. Die Exzision und Untersuchung der nachfolgenden Gewebeschichten erfolgt, während der Patient im Büro bleibt. Diese Technik gilt als die beste Behandlungsoption für SCC 9 . An diesem Punkt wird die Wunde geschlossen und zur Verbesserung der Heilung und des kosmetischen Erscheinungsbildes wird neben normalem Gewebe (ANT) häufig herausgeschnitten. So ist dieses chirurgische Verfahren zur Entfernung eines Tumors ideal geeignet, um histologisch charakterisiertes Gewebe für zukünftige Studien zu sammeln.

Das Beschaffungsverfahren zur Gewinnung von Tumorgewebe, angrenzend an normalem Gewebe, Speichel und Blutproben wurde so entworfen, dass es minimale Auswirkungen auf die normalen Personalaufgaben hat (Abbildung 1 ). Medizinische Assistenten führen das Blut zieht bei der Vorbereitung des Patienten für das Verfahren. Nach Beendigung des Mohs-Verfahrens ist das M Ohs Histotechnologe bereitet zusätzliche histologische Folien der Probe vor und überträgt das Gewebe auf das Biorepository. Die Kosten für die Errichtung des Biorepositorys beinhalten den Kauf von Kryokonservierungsgefriergeräten, die Schaffung eines bescheidenen klinischen Laborraums und die Entwicklung eines Inventarverfolgungsprogramms.

Abbildung 1
Abbildung 1: Reihenfolge der Probenahme und verantwortungsbewusstes Personal Nach dem Check-in des Patienten und dem Erreichen der Zustimmung des Patienten sammelt der medizinische Assistent einen bukkalen Tupfer und führt einen Blutentnahme durch. Der Dermatologe und der medizinische Assistent überholen dann den Tumor und schließen die Wunde, während welcher Zeit SCC- und ANT-Proben gesammelt werden. Ein engagierter Labortechniker verarbeitet das Blut und deckt die SCC- und ANT-Proben für die Gewebekultur, die Konservierung und den Eintritt in das Biorepository ab.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Vielfalt der gesammelten Proben ermöglicht eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen (Abbildung 2 ). Proben, die vom Patienten gesammelt wurden, sind bukkale Tupfer (Speichel kann auch gesammelt werden, wenn nötig), Vollblut und ausgeschnittenes Gewebe. Die bukkalen Tupfer und eine Probe aus dem Vollblut werden ohne Verarbeitung für die Genotypisierung und Gewebeanpassung gerettet. Vollblut wird in weiße Blutkörperchen (WBC) und Plasmafraktionen für zukünftige Analysen getrennt. Nach der Mohs-Verarbeitung wird der gefrorene Tumor direkt in flüssigen Stickstoff gegeben und auf einen Gefrierschrank von -80 ° C übertragen. Frisches, lebensfähiges Tumorgewebe und ANT-Proben werden unter Verwendung von Modifikationen der vorherigen Techniken 10 , 11 kultiviert und dann kryokonserviert. Während der Erhebung wird die Anzahl der einzelnen Sample-Typen auf einer Kalkulationstabelle vor dem Eintritt aufgezeichnet Das Inventar-Tracking-Programm zur Erleichterung der genauen Verarbeitung ( Tabelle 1 ).

Figur 2
Abbildung 2: Überblick über die Klinik-basierte Biorepository Probenahme und -verarbeitung. Ein bukkaler Tupfer und eine Blutprobe werden vom Patienten gesammelt und für die nachgeschaltete Genotypisierung und Gewebeanpassung gespeichert. Vollblut wird für die Isolierung der weißen Blutkörperchen (WBC) und die CTC-Analyse sowie für die Plasmasammlung und die Flüssigbiopsieanalyse weiterverarbeitet. Gewebe, das während des Mohs-Verfahrens ausgeschnitten wird, wird für diagnostische Zwecke histologisch verarbeitet, wonach die histologischen Folien experimentell für weitere immunhistochemische Analysen eingesetzt werden können. Unter der Voraussetzung, dass die exzidierte Gewebeprobe groß genug ist, wird ein Teil des frischen Gewebes entfernt und für die Protein- und RNA-Isolierung geschnitten und für die Herstellung von kultivierten Zelllinien.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abholtermin:
Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5
Initialen und Geburtsdatum
Augenfarbe
Beispielstyp
Beispiel Ort
Speichel
WLoch Blut
Plasma
Tumor lebensfähig
Gewebe Normal lebensfähig
Tumor Mohs Flüssiger Stickstoff
Tissue Normal Liquid Stickstoff
Rutschen

Tabelle 1: Checkliste zum Aufnehmen von Sample-Sammlungen. Daten, die mit jeder gesammelten Probe verfolgt und aufgezeichnet wurden, beinhalten Patienteninitialen, Geburtsdatum und Augenfarbe (für die Hauttypisierung) sowie die locatiAuf Probenentfernung Die Anzahl der Speichelproben, die Blutentnahmevolumina und die Anzahl der lebensfähigen und konservierten Gewebeproben, die gesammelt wurden, werden auch als Referenzen für Zuweisungen zu späteren Verwendungen aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Um die Probenahmeverfahren zu validieren, wurde jeder Sample-Typ in nachgeschalteten Anwendungen getestet. Unter Verwendung von Modifikationen von früheren Techniken 12 wurden Tumor und ANT erfolgreich in der Protein- und RNA-Isolierung verwendet und können möglicherweise für die DNA-Isolierung verwendet werden. Lebensfähige Explantate aus den Gewebeschnitten wurden durch Mikroskopie ausgewertet, während gespeicherte histologische Objektträger für die Immunhistochemie und Immunfluoreszenz verwendet wurden.

Durch das hier beschriebene Protokoll ist es möglich, dieses Modell auf andere Dermatologiekliniken, andere Tumortypen (wie Melanom) zu erweitern,, Und andere chirurgische Spezialitäten und Praktiken, um menschliche Gewebe Proben für vielfältige Forschung in menschlichen Krebs zu liefern. Leichte Modifikationen dieses Protokolls sind wahrscheinlich für andere Praktiken notwendig, aber grundsätzlich ist dieses Protokoll auf jede chirurgische Praxis anwendbar, die routinemäßig Patientenproben, die im Laufe der Patientenbehandlung gesammelt wurden, verwischt.

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Protocol

Alle Experimente an menschlichen Gewebeproben wurden von Western IRB (WIRB-Protokoll Nr. 20142461) genehmigt. Das einzige Kriterium für die Sammlung von Geweben für diese Verfahren ist eine Biopsie-bewährte Diagnose von SCC. Es wurden keine Ausschlusskriterien im ursprünglichen IRB-Protokoll skizziert, aber Proben von Patienten mit bekannter blutübertragbarer Krankheit wurden nicht verwendet. Informierte Zustimmung wurde vor der Sammlung von Hautgewebe, Blut und Speichel erhalten. Midwestern Institutional Review Board genehmigte die Validierungsarbeit mit klinikbasierten Biorepository-Proben an der Midwestern University (AZ # 807).

1. Kutane Tumor-Gewebe-Verarbeitung

HINWEIS: Dies wird von einem Mohs Histotechnologen durchgeführt.

  1. Verarbeitung von frischem Plattenepithelkarzinom (SCC) Gewebe für RNA und Explant Culture
    1. Nachdem das Gewebe vom Mohs-Chirurgen herausgeschnitten worden ist, ernten Sie 10 bis 50 mg (≥ 10 mm 3 HINWEIS: Dies ist nur möglich, wenn der Tumor groß genug ist, um eine Probe von 10-50 mg (≥10 mm 2 ) vor der histologischen Beurteilung, die Teil des Mohs-Verfahrens ist, zu entfernen. Wenn der Tumor nicht groß genug ist, um ein Minimum von 2 mm 3 zu entfernen, gehen Sie nicht mit der Verarbeitung für RNA vor (Schritt 5 überspringen).
    2. Übertragen Sie das lebensfähige Gewebe auf ein markiertes 1,5 mL Röhrchen, das Kulturmedium enthält (1: 1 Mischung von DMEM: Ham F-12, 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin) mit Pinzetten und stellen Sie sicher, dass die Gewebe wird vollständig in das Medium eingetaucht. Lagern Sie diese Röhre bei 4 ° C vor der zusätzlichen Verarbeitung.
    3. Verwenden Sie das Gewebe für die RNA-Isolierung und Expressionsanalyse (siehe Schritt 5) und / oder die etablierungEnt einer Kulturpflanze (siehe Schritt 6) innerhalb von 24 Stunden.
    4. Legen Sie den Rest der Tumorprobe, die vom Patienten entfernt wurde (Schritt 1.1.1), auf einem Kryostat-Gewebehalter (oder "Chuck"). Das Gewebe in eine optimale Schneidetemperatur (OCT) -Verbindung einbinden, das Gewebe innerhalb des Halters einfrieren, um die Fertigstellung der Mohs-Histologie und die Vorbereitung zusätzlicher histologischer Dias für die experimentelle Analyse zu ermöglichen.
  2. Vorbereitung von histologischen Folien
    1. Schneiden Sie Gewebeabschnitte 7 μm dick mit einem Kryostaten und erstellen Sie zwei (oder mehrere) Objektträger für jede Tumorprobe. Stellen Sie sicher, dass jede Folie bis zu drei Abschnitte des gesamten Tumors enthält.
      HINWEIS: Einer der beiden Folien wird mit H & E vom Mohs-Histotechniker gefärbt und die zusätzlichen Folien können mit IF-, IHC- oder FISH-Analyse verarbeitet werden.
    2. Legen Sie die Folien in Aceton für 1-2 s, um das Gewebe zu fixieren. Setzen Sie diese Rutschen zur Seite. Nicht h & eFlecken oder Deckel die Folie für zukünftige Immunfluoreszenz (IF), Immunhistochemie (IHC) oder Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Analyse, abhängig von der experimentellen Protokoll verwendet werden.
  3. Verarbeitung von Post-Mohs-Gewebe
    1. Sobald die Mohs-Verarbeitung abgeschlossen ist (Schritte 1.1-1.2), arbeiten Sie in der Kryostatkammer und entlasten die Probe aus dem Kryo-Einbettungsmedium und legen das Gewebe in ein markiertes Kryo-Röhrchen.
    2. Legen Sie die markierte Ampulle in flüssigen Stickstoff, bevor das Gewebe aufgetaut hat. Wenn Proben für die Protein- und / oder DNA-Analyse verwendet werden sollen, können sie innerhalb weniger Minuten in einen flüssigen Stickstoff oder ein Gefäß mit -80 ° C überführt werden, um für die zukünftige Proteinexpression und DNA-Mutationsanalyse gelagert zu werden (siehe Schritte 4-5) .
      HINWEIS: Wenn aus der Post-Mohs-Probe eine intakte RNA gewünscht wird, ist es unerlässlich, die Probe während der Entfernung aus dem Kryo-Einbettungsmedium gefroren zu halten. Wenn äußerste Sorgfalt nicht ausgeübt wirdIn diesem Schritt sollte die Post-Mohs-Probe für die Protein- und / oder DNA-Analyse reserviert werden.
  4. Verarbeitung von frischem ANT
    1. Zur Zeit der Mohs-Schließung, erhalten ANT vom Mohs-Chirurgen.
    2. Entfernen Sie eine gleich große oder größere Menge an ANT, wie sie aus der SCC-Probe (siehe oben) von der apikalen Seite des normalen Gewebes geerntet wurde, und überführen sie auf ein markiertes 1,5 ml-Röhrchen, das Kulturmedium enthält (1: 1-Gemisch von DMEM: Hams F- 12, ergänzt mit 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 & mgr; g / ml Streptomycin) unter Verwendung einer Pinzette.
    3. Vollständig das Gewebe in das gleiche Kulturmedium eintauchen und bei 4 ° C bis zur nachfolgenden Verarbeitung aufbewahren (siehe Schritte 4-6).

2. Blut-, Speichel- und Bukkal-Tupferverarbeitung

  1. Erhalten Sie ca. 10 ml Blut in EDTA Sammelröhrchen über Venenpunktion.
  2. Übertragen Sie das Blut aus den Sammelröhrchen in ein steriles 15- oder 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie ca. 200 μl in ein 1,5 mL Kryo-Röhrchen, um Blasen zu vermeiden; Speichern Sie diese Vollblutprobe bei -80 ° C, um für zukünftige Genotypisierung und Gewebeanpassung verwendet zu werden, falls nötig.
    1. Das restliche Blut bei 1000 xg für 30 min drehen und den Standardverfahren folgen, um die Plasmafraktion zu sammeln.
    2. Aliquotieren Sie das Plasma in 1-ml-Schritten in 1,5 ml Kryo-Röhrchen und lagern bei -80 ° C für den Einsatz bei zukünftigen Flüssigbiopsie-Analysen.
  3. Verwenden Sie einen sterilen Tupfer, um eine bukkale Tupferprobe zu erhalten und den Tupfer in einem sterilen Röhrchen bei Raumtemperatur zu lagern.
  4. Falls erforderlich, eine Speichelprobe erhalten und bei Raumtemperatur in einem sterilen Röhrchen aufbewahren.
    HINWEIS: Diese Proben können für zukünftige Genotypisierung und Gewebeanpassung verwendet werden, falls erforderlich.

3. Aufzeichnung der Proben

  1. Übertragen von Informationen aus der Checkliste der Patientenproben in die Biorepository-Datenbank. Patienteninformation und diag einbeziehenNosis aus der Patientendiagramm.
  2. Drucken Sie Etiketten mit einem Barcode für jede Probe und notieren Sie jede in der Datenbank, um jede gesammelte Probe mit Patientendaten zu verknüpfen.
  3. Notieren Sie die Verteilung der de-identifizierten Proben in der Biorepository-Datenbank vor der Übertragung der Proben in das Forschungslabor.

4. Protein-Isolierung und Western-Blot-Analyse

  1. Legen Sie jede Gewebeprobe (SCC und / oder ANT) in eine Durchstechflasche, die 500 μl Zelllysepuffer enthält, der Protease-Inhibitoren pro 100 mg Gewebe enthält, um das Gewebe zu lysieren.
    HINWEIS: Wir verwendeten einen Radioimmunopräzipitationstest (RIPA) -Puffer, bestehend aus 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1,0% NP-40 und 0,1% SDS. Andere Zelllysepuffer können verwendet werden.
  2. Homogenisieren des Gewebes unter Verwendung eines Gewebehomogenisators für 5 min in 20-s-Intervallen bei 4 ° C. Spin die Proben bei 21.000 xg und 4 ° C für 20 min und sammle den überstehenden Protein in eine frische tuSein. Den Überstand unter den gleichen Bedingungen nachspülen und den Endüberstand in ein frisches Röhrchen sammeln.
  3. Elektrophorese 30-50 μg Protein aus jeder Probe unter Verwendung eines 4-20% SDS-Polyacrylamid-Gradientengels. Färben Sie das Gel mit Coomassie Blue, um Proteinbanden zu visualisieren, falls gewünscht.
  4. Wenn eine Western-Blot-Analyse von exprimierten Proteinen erforderlich ist, übertragen Sie die Proteine ​​aus dem Gel zu einer Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran nach Standardprotokollen. Nach der Übertragung färben Ponceau die PVDF-Membran, um Proteinbanden zu visualisieren, falls gewünscht.
  5. Blockieren Sie die PVDF-Membran und die Sonde, um Proteine ​​von Interesse nach Standardprotokollen zu erkennen. Verwenden Sie primäre Antikörper, die spezifisch für das / die Protein (e) von Interesse sind, zusammen mit entsprechenden sekundären Antikörpern, die für die primären Antikörper spezifisch sind, in Konzentrationen, die vom Hersteller für Western-Blot-Analyse empfohlen werden.
  6. Die untersuchte Membran unter Verwendung eines chemolumineszierenden Substrats freisetzen und die Membran mit einem imagi aufbildenSystem.

5. RNA-Isolierung und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)

  1. Stellen Sie sofort frische Gewebeproben (SCC und / oder ANT) in ein 1,5 ml-Röhrchen, das eine RNA-Stabilisierungslösung enthält, und platzieren Sie nach dem Mohs-Gewebeproben in ein 1,5 ml-Röhrchen, das eine gefrorene Gewebeübergangslösung enthält, nach den Empfehlungen des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig eingetaucht ist. Diese Proben bei -80 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren.
  2. Entfernen Sie die RNA-Proben von -80 ° C und tauen Sie auf Eis. Übertragen Sie das Gewebe auf ein neues 1,5 ml-Röhrchen, das 1 ml RNA-Extraktionspuffer (Phenol / Guanidin-Thiocyanat) pro 50-100 mg Gewebe enthält.
  3. Lyse die Gewebe mit einem Gewebe-Homogenisator. Führen Sie sechs Zyklen der Homogenisierung durch, gefolgt von einer Periode der Probenkühlung; Jeder Zyklus besteht aus 20 s Homogenisierung bei 4 ° C und einer 40 s Kühlung. Nach der Homogenisierung die Probe 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Füge 0,2 hinzuMl Chloroform pro 1 ml RNA-Extraktionspuffer und schüttelt das Röhrchen kräftig von Hand für 15 s. Inkubieren für 2-3 min bei Raumtemperatur.
  5. Die Proben bei 12.000 xg und 4 ° C für 15 min drehen. Entfernen Sie die wässrige Phase der Probe und legen Sie sie in ein neues 1,5 mL Röhrchen.
  6. Fügen Sie 0,5 ml von 100% Isopropanol pro 1 ml des in Schritt 5.2 verwendeten RNA-Extraktionspuffers in die wässrige Phase hinzu und inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Wenn die RNA-Ausbeuten niedrig sind ( dh das Ausgangsgewebevolumen beträgt weniger als 10 mg), können die Proben über Nacht bei -80 ° C ausgefällt werden. Zusätzlich können 5 & mgr; g RNase-freies Glykogen pro 500 & mgr; l RNA-Extraktionspuffer während des Isopropanol-Präzipitationsschrittes zugegeben werden, um die RNA-Ausbeuten zu verbessern.
  7. Die Probe bei 12.000 xg bei 4 ° C für 10 min drehen. Den Überstand entfernen und das Pellet mit 1 ml 75% igem Ethanol waschen.
  8. Vortex die Probe kurz und dann drehen Sie es bei 7.500 xg und 4 °C für 5 min. Verwerfen Sie die Wäsche und lufttrocknen Sie das Pellet für 5-10 min.
  9. Das RNA-Pellet wird in 20 μl RNase-freiem Wasser resuspendiert.
    1. Falls gewünscht, reinige jede RNA-Probe mit einem RNA-Cleanup-Kit nach den Empfehlungen des Herstellers.
      HINWEIS: Kleine RNAs werden aus der Probe verloren, wenn dieser Schritt durchgeführt wird.
  10. Elektrophorese eine 1 & mgr; g Probe unter Verwendung eines 1,2% Formaldehyd-MOPS-Agarosegels, um die Qualität der RNA zu analysieren.
    HINWEIS: Als Alternative analysieren Sie Proben mit einem Bioanalysator, um eine RIN-Nummer 13 zu erhalten.
  11. Reverse-transkribieren der RNA an cDNA unter Verwendung eines reversen Transkriptionsprotokolls für die qPCR-Analyse von Ziel-mRNAs (oder miRNAs) von Interesse.

6. Gewebe-Explant-Kulturen

  1. Sterilisieren des ausgeschnittenen Gewebes vor der Kultur durch Eintauchen des Gewebes in 70% Ethanol.
  2. Legen Sie das Gewebe auf eine Folie oder Schale und fügen Sie genug Kultur Medium (1: 1 Mischung aus DMEM: Ham & #39; s F-12, ergänzt mit 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin), um das Gewebe zu bedecken (um das Gewebe vor dem Trocknen zu verhindern). Das Gewebe sorgfältig in Fragmente (<1 mm 3 ) mit einem Skalpellblatt schneiden.
  3. Übertragen Sie die Gewebefragmente auf eine 35-mm-Gewebekulturschale und fügen Sie etwa 20 μl fötales Rinderserum (FBS) auf jedes Fragment hinzu.
  4. Lassen Sie das Gericht in einer Kulturhaube für 20-30 min oder bis fast trocken.
  5. Fügen Sie 1 ml Kulturmedium (1: 1 Mischung aus DMEM: Schinken F-12, ergänzt mit 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin) zu jeder Schale und inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 . Subkultur oder Sub-Klon die Kulturen, wenn nötig.

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Representative Results

Tumor und ANT wurden erfolgreich in der Proteinisolation eingesetzt und durch Western Blotting getestet. Wie in Abbildung 3 gezeigt , können kutane Plattenepithelkarzinommarker (Muc1 14 , FHL-1 15 und p40 16 , 17 ) bei Patientenproben nachgewiesen und in unserem klinikbasierten Biorepository gespeichert werden.

Abbildung 3
Abbildung 3: Analyse von aus ANT und SCC extrahierten Proteinen. Gesamtprotein wurde aus ANT- und SCC-Proben isoliert und die Expression bekannter Marker für SCC wurde durch Western-Blot untersucht. Repräsentative Western-Blots von Mucin 1 (MUC1), Faktor H Like-1 (FHL-1) und p40 (Panel B) sind gezeigt. PlädoyerKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die unter Verwendung der obigen Techniken isolierte RNA wurde durch Gelelektrophorese, qPCR und RNA-Integritätsanalyse getestet. Abbildung 4 zeigt zwei Patientenproben, aus denen hochqualitative, intakte RNA isoliert wurde. Die RNA eignet sich für alle nachgeschalteten Anwendungen.

Abbildung 4
Abbildung 4: RNA-Integritätsanalyse mittels Bioanalyse Beurteilung der RNA-Größe und Integrität durch Gelelektrophorese (Panel A). Eine RNA-Integritätszahl (RIN) wurde für jede Probe auf der Grundlage der elektrophoretischen Spur der RNA-Probe, einschließlich des Verhältnisses der ribosomalen RNA und der Anwesenheit oder Abwesenheit von Abbauprodukten (Tafel B), erzeugt. Eine RIN von "10" stellt eine perfekte RNA-Probe ohne jegliche Abbauprodukte dar, während "1" eine vollständig abgebaute Sa darstelltMatt Densitometrieprofile der Banden sind als Fluoreszenzeinheiten (FU) gegenüber Nukleotiden (nt) (Panel C) für repräsentative RNA-Proben aus SCC- und ANT-Patientengewebe aufgetragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Lebensfähige Explantate aus den Gewebeschnitten wurden durch Mikroskopie ausgewertet (Abbildung 5A ). Diese aus Tumor- und ANT-Proben erzeugten Explantkulturen sind gemischte Keratinozyten- und Fibroblasten-Kulturen. Diese Kulturen können subkultiviert oder für zukünftige Zelllinienentwicklung verwendet werden. Gespeicherte histologische Dias wurden für Immunhistochemie und Immunfluoreszenz verwendet. In Fig. 5B gezeigt , zeigt eine SCC-Probe eine positive Färbung für einen epithelial-zu-mesenchymalen Übergangsmarker in SCC 18 .


Abbildung 5: Explantierte Kultur und IF-Färbung von SCC-Abschnitten Phasenkontrastbild eines Plattenepithelkarzinom-Gewebe-Explantats (Tafel A, Scale-Bar = 50 & mgr; m) und Gewebeabschnitte, die als Teil der Mohs-mikrographischen Chirurgie gesammelt wurden, gefärbt mit einem anti-pSnail / Slug-Primärantikörper (Tafel B, Scale-Bar = 25 & mgr; m) ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Wir haben experimentell festgestellt, dass das Gewebe bei 4 ° C für 24-48 h vor der RNA-Isolierung (Schritt 5) oder der Explantokultur (Schritt 6) gelagert werden kann, ohne die Ergebnisse zu beeinflussen. RNA-Ausbeute oder Integrität, wie durch Gelelektrophorese oder Bioanalyzer und RIN-Zahl beurteilt, sind nicht beeinträchtigt. Zusätzlich werden Explantkulturen leicht unter Verwendung von Gewebe, das bei 4 ° C für thi gespeichert ist, erhaltenS Zeitdauer. Dies bietet eine erhöhte Flexibilität bei der Übertragung von Proben zwischen der Klinik und dem Forschungslabor. Da die RNA-Isolierung und die Explantokultur im Forschungslabor und nicht in der Klinik durchgeführt werden, macht diese Funktion das klinikbasierte Biorepository zu einem robusteren Modell als wir es vorher erwartet hatten.

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Discussion

Nach dem Wissen des Autors ist dieses Protokoll das erste seiner Art, das sich auf die klinische Beschaffung von Hautgewebeproben sowohl in einem kostengünstigen als auch in einem schnellen Ansatz konzentriert. Patienten, die sich einer Mohs-Mikrochirurgie unterziehen, sind typischerweise während bestimmter Zeitblöcke geplant, und die Sammlung ist auf diese Zeiträume beschränkt. Die Probenahme beinhaltet die Anstrengung des medizinischen Assistenten, der an der Patientenversorgung beteiligt ist, der Mohs-Histotechnologe, der die Tumorproben verarbeitet, und ein designiertes Laborpersonal, das den Stichprobeneintrag und die Blutverarbeitung behandelt.

Mit sorgfältiger Koordination zwischen den drei Mitgliedern des Kollektionsteams ( dh dem medizinischen Assistenten, dem Mohs-Histotechnologen und dem Labortechniker) haben wir festgestellt, dass die vorhandenen medizinischen Hilfskräfte die zusätzlichen Aufgaben im Zusammenhang mit der Sammlung von 3-5 Gewebeproben vervollständigen können Pro Tag ohne offensichtliche Verzögerung im Klinikbetrieb. Gewährleistung der Zustimmung des Patienten Und das Sammeln von bukkalen Tupfern und Blut sind während der normalen Wartezeiten abgeschlossen, die mit dem Mohs-Mikrochirurgieverfahren verbunden sind. Anders als die Entscheidungsfindung darüber, wie eine Probe verarbeitet werden soll, werden die Aufgaben, für die der Mohs-Histotechnologe verantwortlich ist, am Ende der Mohs-Verarbeitung von Patientenproben abgeschlossen und werden in der Regel etwa 30 Minuten zum Tagesablauf hinzufügen. Typischerweise ist ein Mitglied des Klinikpersonals für die Etikettierung und Verarbeitung der Blutproben und für die Durchführung von Transfer und Eintragung von Proben in die Datenbank verantwortlich. Abhängig von der Anzahl der verarbeiteten Proben können diese Pflichten erhebliche Zeit von den bestehenden Pflichten verlangen. So sollte die Probenahme nur dann durchgeführt werden, wenn genügend Laborpersonal vorhanden ist. Genauer gesagt, wenn mehr als 5 Proben an einem einzigen Tag gesammelt werden oder wenn mehrere Blutproben von Patienten gesammelt werden, werden mehrere Stunden zusätzlicher Aufwand vom Labortechniker benötigt.

Jove_content "> An den Sammeltagen erhalten die medizinischen Assistenten (MA) die Zustimmung der Patienten für Spenden von Gewebe, die MA erhält anschließend einen bukkalen Tupfer (und Speichel, falls nötig) und sammelt Blut für die Verarbeitung durch Laborpersonal Patientenbeteiligung nach der Erhebung dieser Proben, also aus der Perspektive des Patienten, ist der Rest des Klinikbesuchs unverändert (obwohl sie gebeten werden, Blut während eines Folgebesuchs zu spenden). Derzeit können wir abschätzen, dass 70% der Patienten zustimmen Um das Gewebe zu spenden, mit ~ 30% der Patienten, die auch Blut spenden, 30% Rückgang zur Teilnahme. Derzeit sind nur Patienten mit einer Biopsie-bewährten Diagnose von Krebs im Biorepository enthalten. Patienten mit bekannter blutübertragbarer Krankheit sind ausgeschlossen .

Der Laborpersonal ist für die Koordinierung mit den beiden anderen Mitgliedern des Sammlungsteams verantwortlich und zeichnet die gesammelten Proben auf (Tabelle 1). Nach einerN Erstmusterprobe, die ausgefüllte Einwilligungsform, das Blut und die bukkalen Tupfer werden an den Laborpersonal übertragen, und die Initialen, Geburtsdaten und andere relevante Informationen des Spenders, wie zB der Mustertyp, werden aufgezeichnet. Dies ermöglicht die Aufzeichnung der Zahlen und Arten von Proben, die bei jedem Patienten während des Sammelvorgangs gesammelt wurden. Die Flussdiagramme, die die Verarbeitung von SCC-Gewebe (Abbildung 6 ) und ANT (Abbildung 7) zusammenfassen, sind nützliche Werkzeuge für die Ausbildung von neuen Mitarbeitern in Sammelverfahren.

Abbildung 6
Abbildung 6: Flussdiagramm zur Abgrenzung der Verarbeitung von SCC-Samples. Bei der Tumor-Exzision wird die Größe der Probe beurteilt. Wenn die Probe ≤2 mm 3 ist, wird die gesamte Probe für die Mohs-Verarbeitung verwendet, da die Beurteilung der sauberen Margen (die IndikatorenAtion der vollständigen Tumorentfernung) ist oberste Priorität. Nach der Mohs-Verarbeitung wird jedes verbleibende Gewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren und in das Biorepository transferiert. Wenn die Probe groß genug ist, so dass ein> 2 mm 3- Teil des Gewebes entfernt werden kann, wird dieser Teil gesammelt und in ein Röhrchen enthalten, das Zellkulturmedium enthält, während der verbleibende Teil für die Mohs-Verarbeitung verwendet und wie oben gespeichert gelagert wird. Der zu Zellkulturmedium entfernte Teil der Probe wird weiter segmentiert, wobei ein ~ 0,5 mm 3 -Fragment entfernt und für die Herstellung einer Zellkulturlinie verwendet wird; Wird das verbleibende Gewebefragment auf das Biorepository für die nachgeschaltete Protein- und Genexpressionsanalyse übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 7: Flussdiagramm zur Abgrenzung der Verarbeitung von ANT-Samples. Zum Zeitpunkt des Mohs-Verschlusses wird ein Teil des angrenzenden normalen Gewebes (ANT) entfernt und vom Mohs-Chirurgen gesammelt. Wenn die Probengröße ≤2 mm 3 beträgt, wird die gesamte Probe in ein Kryo-Rohr gegeben und in flüssigem Stickstoff vor dem Transfer zum Biorepository eingefroren. Wenn die Probe> 2 mm 3 ist , wird die gesamte Probe zuerst in ein Röhrchen gegeben, das Zellkulturmedium enthält. Die Probe wird dann weiter in ein ~ 0,5 mm 3- Fragment geschnitten, um für die Etablierung von Zellkulturlinien verwendet zu werden. Der verbleibende Gewebeabschnitt wird in das Biorepository übertragen, um für die nachgeschaltete Protein- und Genexpressionsanalyse gespeichert zu werden.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Dieses Protokoll soll die Variation zwischen den Proben im Biorepository minimieren. Die Koordination und die effektive Kommunikation zwischen den Klinikmitarbeitern und zwischen der Klinik und allen Labormitarbeitern ist von wesentlicher Bedeutung, um die Variabilität zu minimieren und das Erreichen von hochwertiger DNA, RNA und Protein aus den Geweben zu maximieren. Während die DNA und das Protein innerhalb der Gewebe robust sind, wenn RNA erwünscht ist, ist es entscheidend, die Gewebe während des Sammelns, des Transports und der Verarbeitung kalt und in dem geeigneten Medium zu halten, um die RNA-Integrität aufrechtzuerhalten. Eine genaue Aufzeichnung ist auch wichtig, um die Patientenproben mit ihrer Geschichte und Diagnose zu verknüpfen, da diese Informationen häufig bei der Analyse von Ergebnissen aus nachgeschalteten Anwendungen benötigt werden.

Mit dem zunehmenden Interesse an personalisierter Medizin und BioMarkerforschung wurde vor kurzem eine Reihe von Biorepositorien etabliert. Diese sind typischerweise mit klinikbasierten Kliniken in großen akademischen Zentren verbunden und haben erhebliche Kosten bei der Einrichtung und dem Betrieb 2 , 8 , 19 . Die Entwicklung eines klinikbasierten Biorepositorys für kutane Krebsproben, die als Teil der täglichen Praxis entstanden sind, hat gegenüber anderen Biorepositorien mehrere wesentliche Vorteile. Zuerst werden mit einer einzigen Sammel- und Probenverarbeitungsstelle Variationen in der Probenhandhabung, die nachgeschaltete Anwendungen kompromittieren können, minimiert. Zweitens, da diese gespendeten Proben aus einer stabilen Patientenpopulation gezogen werden, ist der Zugang zu de-identifizierten medizinischen Aufzeichnungen und Patienten-Ergebnisdaten unvergleichlich. Diese Daten können anonymisiert und aus der Patientendiagramm in die Biorepository-Datenbank zum Zeitpunkt der Probenahme oder bei einem Folgebesuch übertragen werden. Drittens, mit einer loyalen Patientenbasis, die clInic-basierte Biorepository ist in der Lage, mehrere Proben aus dem gleichen Patienten zu sammeln, ein Sample-Set nicht oft in anderen Einstellungen erhalten. Eine der Einschränkungen dieses Protokolls ist, dass es für kutane Proben optimiert wurde, die durch Mohs-mikrographische Chirurgie erhalten wurden und möglicherweise für andere Gewebetypen oder klinische Verfahren modifiziert werden müssen.

Insgesamt ist eines der Hauptziele des Biorepositorys, ein breites Spektrum von Proben von demselben Spender bereitzustellen, um es Forschern zu ermöglichen, eine breite Palette von Fragen zu stellen, insbesondere für die Entwicklung von Flüssigbiopsien und Krebsmarkern. Insbesondere die Fähigkeit, die Tumorhistologie und die Expression von Biomarkern an den mRNA- und Protein-Niveaus zu Plasmaproben zu korrelieren, sowie die Fähigkeit, Patienten-Ergebnisdaten zu verweisen, erzeugt einen einzigartig leistungsfähigen Datensatz. Wir hoffen, dass das klinikbasierte Biorepository-Modell genutzt werden kann, um den Mangel an Patientenproben in der biomedizinischen Forschung zu lindern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Mittel von der Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant, verliehen an EEH und Midwestern University Office of Research und Sponsored Programme Intramural Grant, an KJL vergeben unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde von angeschlossenen Laboratorien und angeschlossenen Dermatologie zur Verfügung gestellt. Wir danken Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel und Ali Zaidi für ihre technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA ThermoFisher Scientific 02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades ThermoFisher Scientific 50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps ThermoFisher Scientific 16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium ThermoFisher Scientific NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound ThermoFisher Scientific 50-363-579
Leica CM1950 Cryostat Leica Biosystems 14047743909
Frosted Microscope Slides ThermoFisher Scientific 12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit ThermoFisher Scientific 99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes ThermoFisher Scientific 03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab  ThermoFisher Scientific NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer ThermoFisher Scientific 50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer ThermoFisher Scientific 12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle ThermoFisher Scientific 121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific 13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140148
Gibco 1 M Hepes ThermoFisher Scientific 15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent ThermoFisher Scientific 1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 Abnova MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody Abnova ABX-144A
Anti MUC-1 antibody Santa Cruz Biotech sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246) Abcam Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin Molecular Probes  A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Molecular Probes  P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera Zeiss 4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera Olympus IX511F3

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References

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Medizin Ausgabe 123 Klinik-basierte Biorepository Hautkrebs Mohs Chirurgie Plattenepithelkarzinom Gewebeverarbeitung Gewebebank
Errichtung eines klinischen Biorepositorys
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Belden, S. E., Uppalapati, C. K.,… More

Belden, S. E., Uppalapati, C. K., Pascual, A. S., Montgomery, M. R., Leyva, K. J., Hull, E. E., Averitte, R. L. Establishment of a Clinic-based Biorepository. J. Vis. Exp. (123), e55583, doi:10.3791/55583 (2017).

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