Summary
גידולים עוריים נמחקים לעתים קרובות לאחר ניתוח microsraphic Mohs. פרוטוקול מתואר כאן המאפשר לצוות התמיכה הקלינית לעבד ולאחסן באופן יעיל גידול סרטני ( כגון קרצינומה של תאי קשקש , קרצינומה של תאי בסיס ומלנומה) עבור יישומים במעבדה במורד הזרם מבלי להפריע לפעולות קליניות.
Abstract
שכיחות סרטן העור ( למשל, קרצינומה של תאי קשקש , קרצינומה של תאי בסיס ומלנומה) גדלה בשנים האחרונות. צפוי כי תהיה דרישה מקבילה דגימות גידול סרטני למחקרים ביו-רפואיים. עם זאת, זמינות הרקמות מוגבלת בשל עלות הקמת מאגר ביולוגי וחוסר פרוטוקולים זמינים לקבלת דגימות קליניות שאינן מפריעות לפעולות קליניות. פרוטוקול הוקם כדי לאסוף ולעבד גידול עורית ודם הקשורים דגימות רוק שיש לו השפעה מינימלית על הליכים קליניים שגרתיים בתאריך של ניתוח Mohs. דגימות הגידול נאספות ומעובדות מחולים העוברים את השכבה הראשונה של ניתוח מוהס עבור ביופסיה מוכחת ממאירות עורית על ידי ההיסטולוג Mohs. רקמות נורמליות צמודות נאספות בזמן סגירת כירורגי. דגימות נוספות שניתן לאסוף הן כדוריות דם מלאות ובוקאליות. על ידי ניצול דגימות רקמות כי הם מושלכים בדרך כלל, biorepository נוצר המציע מספר יתרונות מרכזיים על ידי היותו מבוסס במרפאה לעומת הגדרת המעבדה. אלה כוללים מגוון רחב של דוגמאות שנאספו; גישה לרשומות המטופל, כולל דיווחי פתולוגיה; ו, עבור התורם טיפוסי, גישה דגימות נוספות במהלך הביקורים מעקב.
Introduction
מחקר סרטן וביו-מרקר מסתמך על אספקה של דגימות רקמות איכותיות, והאספקה המוגבלת הפריעה למחקר 1 , 2 . מחקרים רבים דרמטולוגים מוגבלים על ידי אספקה לקויה, איכות משתנה, ועלויות הקשורות לשימוש ברקמת האדם. העלות של הקמת ביובנק גדול ומוקדש נאמדה בכשני מיליון דולר 3 , ועלויות אלה מציבות את השימוש ברקמות אדם מחוץ להישג ידם של חוקרים רבים. יתר על כן, תהליך ייצור ואחסון של דגימות המחקר מהווה את הסיכון להשפיע על פעולות קליניות עיכוב הטיפול בחולה אם לא בוצע בזהירות. Biorepository עלות תועלת, המרפאה מבוסס הוקם כי מתמקדת דגימות סרטן העור בעקבות שיטות מומלצות המומלץ אימות מדגם 4 , 5 , 6 .
המטרה של טכניקת הניתוח microsraphic Mohs היא להבטיח כי כל רקמת הסרטן מוסר תוך שמירה על רקמה בריאה ככל האפשר. ההליך כולל הסרת פרוגרסיבי של שכבות דקות של רקמת הגידול. כל שכבה עוקבת הוא שלוכדי לבדוק בצורה לוגית (לאחר cryosectioning רקמת הגידול וביצוע מכתים H & E) על ידי רופא עור כדי לקבוע אם כל רקמת הסרטן הוסר. כריתה ובדיקה של שכבות של רקמות לאחר מכן מבוצע בזמן שהחולה נשאר במשרד. טכניקה זו נחשבת האפשרות הטיפול הטוב ביותר עבור SCC 9 . בשלב זה, הפצע סגור, כדי לשפר את הריפוי ואת המראה הקוסמטי, רקמה רגילה הסמוך (ANT) הוא נכרת לעתים קרובות. לפיכך, הליך כירורגי זה כדי להסיר גידול מתאים באופן אידיאלי עבור איסוף רקמות מאופיינות היסטולוגית עבור מחקרים עתידיים.
ההליך רכש להשגת רקמת הגידול, רקמה רגילה, רוק, דגימות דם ו תוכנן להיות בעל השפעה מינימלית על צוות העובדים הרגילים ( איור 1 ). עוזרים רפואיים לבצע את הדם שואבת בעת הכנת החולה עבור ההליך. לאחר השלמת הליך מוס, M Ohs histotechnologist מכין שקופיות היסטולוגית נוספת של הדגימה ומעביר את הרקמה למחסן biorepository. עלויות הקשורות בהקמת biorepository כוללים רכישת מקפיאים cryopreservation, יצירת מרחב מעבדה קליני צנוע, ופיתוח של תוכנית מעקב מלאי.
איור 1: רצף איסוף מדגם וצוות אחראי. לאחר ביצוע הצ'ק-אין של המטופל והשלמת הסכמת החולה, עוזר הרפואי אוספת מטלית חזה ומבצע משיכת דם. רופא העור ועוזר רפואי אז לבלו את הגידול ולסגור את הפצע, שבמהלכם זמן SCC ו דגימות ANT נאספים, בהתאמה. טכנאי מעבדה ייעודי מעבד את הדם ואת החלקים SCC ו- ANT דגימות לתרבות רקמות, שימור, וכניסה לתוך biorepository."לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו." Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.
מגוון הדגימות שנאספו מאפשר מגוון של גישות ניסיוניות ( איור 2 ). הדגימות שנאספו מהחולה הן ספוגי buccal (רוק יכול גם להיות שנאסף במידת הצורך), דם שלם, ורקמות ננטשים. את bubal swabs ו מדגם של כל הדם נשמרים, ללא עיבוד, עבור genotyping ו התאמת רקמות. כל הדם מופרד לתאי דם לבנים (WBC) ושברי פלזמה לניתוחים עתידיים. לאחר עיבוד Mohs, הגידול הקפוא ממוקם ישירות לתוך חנקן נוזלי הועבר מקפיא -80 מעלות צלזיוס. טריים, רקמת גידול קיימא דגימות ANT הם מתורבתים באמצעות שינויים של טכניקות קודמות 10 , 11 ולאחר מכן cryopreserved. במהלך האוסף, מספר כל סוג מדגם נרשם בגיליון אלקטרוני לפני הכניסה את תוכנית מעקב מלאי כדי להקל על עיבוד מדויק ( טבלה 1 ).
איור 2: מתאר של המרפאה מבוסס biorepository אוסף המדגם ועיבוד. מטלית buccal ו דגימת דם נאספים מן המטופל ומאוחסנים עבור genotyping במורד הזרם ואת התאמת רקמות. דם שלם מעובד עוד יותר לבדיקת תאי דם לבנים (WBC) וניתוח CTC, וכן לאיסוף פלזמה ולניתוח ביופסיה נוזלית. רקמות שנחקרו במהלך ההליך Mohs מעובד היסטולוגית למטרות אבחון, ולאחר מכן את שקופיות היסטולוגית ניתן להשתמש באופן ניסיוני עבור ניתוחים immunohistochemical נוסף. בתנאי מדגם הרקמה שנחקרו הוא גדול מספיק, חלק רקמות טריות מוסר וחתך לבידוד חלבון RNA, וכן להקמת שורות תאים תרבותיים.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| תאריך איסוף: | |||||
| מטופל 1 | מטופל 2 | מטופל 3 | מטופל 4 | מטופל 5 | |
| תאריך לידה ותאריך לידה | |||||
| צבע עיניים | |||||
| סוג דוגמה | |||||
| מיקום לדוגמה | |||||
| רוֹק | |||||
| Wחור דם | |||||
| פְּלַסמָה | |||||
| גידול בר קיימא | |||||
| רקמות רגיל בר קיימא | |||||
| גידול חנקן נוזלי | |||||
| רקמות רגילות חנקן נוזלי | |||||
| שקופיות |
טבלה 1: רשימת פעולות לביצוע כדי לרשום אוספי מדגם. הנתונים שנחקרו ונרשמו עם כל דגימה שנאספו כוללים ראשי תיבות של המטופל, תאריך הלידה וצבע העין (עבור הקלדת עור), כמו גם את locatiעל הסרת הדגימה. מספר דגימות הרוק, כמויות איסוף הדם, ומספר הדגימות של הרקמה המשומרת והמשומרת, נרשמות גם כהפניות להקצאות לשימושים מאוחרים יותר. לחץ כאן להורדת הקובץ.
כדי לאמת את נהלי איסוף המדגם, כל סוג מדגם נבדק ביישומים במורד הזרם. באמצעות שינויים של טכניקות קודמות 12 , הגידול ANT שימשו בהצלחה בבידוד חלבון ו- RNA והוא יכול לשמש לבידוד דנ"א. אקספלנסים קיימא הוקמה מתוך קטעי רקמה הוערכו על ידי מיקרוסקופ, בעוד שקופיות היסטולוגית מאוחסנים שימשו אימונוהיסטוכימיה ו immunofluorescence.
על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר כאן, ניתן להרחיב את המודל הזה למרפאות דרמטולוגיה אחרות, סוגי גידול אחרים (כגון מלנומה), וכן התמחויות כירורגיות אחרות כדי לספק דגימות רקמות האדם למחקר רב פנים לתוך סרטן האדם. שינויים קלים של פרוטוקול זה צפויים להיות נחוצים עבור שיטות אחרות, אבל, באופן עקרוני, פרוטוקול זה הוא ישים לכל תרגול כירורגי כי באופן שגרתי משליך דגימות החולה שנאספו במהלך הטיפול בחולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים על דגימות רקמות אדם אושרו על ידי IRB המערבי (WIRB Protocol # 20142461). הקריטריון היחיד עבור אוסף של רקמות עבור נהלים אלה היא אבחנה מוכחת ביופסיה של SCC. לא נכללו קריטריונים לאי-הכללה בפרוטוקול ה- IRB המקורי, אך לא נעשה שימוש בדגימות מחולים עם מחלה מוכרת בדם ידועה. הסכמה מדעת התקבלה לפני איסוף רקמות עוריות, דם ורק. Midwestern מוסדיים סקירה מועצת אישרה את עבודת האימות עם דגימות biorepository קליני באוניברסיטת Midwestern (AZ # 807).
1. עור רקמתי גידול רקמות
הערה: זה אמור להתבצע על ידי היסטולוג Mohs.
- עיבוד של קרצינומה של תאים קשקשיים טריים (SCC) רקמה עבור RNA ו תרבות אקספלנט
- לאחר הרקמה כבר נכרת על ידי המנתח Mohs, הקציר של 10 מ"ג 50 (≥ 10 מ"מ 3 הערה: זה אפשרי רק אם הגידול גדול מספיק כדי לאפשר מדגם בגודל 10-50 מ"ג (≥ 10 מ"מ 2 ) כדי להסיר לפני ההערכה היסטולוגית, המהווה חלק הליך מוס. אם הגידול אינו גדול מספיק כדי לאפשר מינימום של 2 מ"מ 3 כדי להסיר, לא להמשיך עם עיבוד עבור RNA (לדלג על שלב 5).
- מעבירים את הרקמה קיימא לצינור שכותרתו 1.5 מ"ל המכיל בינוני תרבות (1: 1 תערובת של DMEM: F של 12, 25 HEPES מ"מ, 100 IU / מ"ל של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) באמצעות פינצטה ולוודא כי רקמה שקועה לחלוטין במדיום. חנות זו צינור ב 4 ° C לפני עיבוד נוסף.
- השתמש רקמות לבידוד רנ"א ניתוח ביטוי (ראה שלב 5) ו / או הממסדEnt של תרבות explant (ראה שלב 6) בתוך 24 שעות.
- מניחים את שאר המדגם הגידול כי הוסר מן החולה (שלב 1.1.1) על מחזיק רקמות cryostat (או "צ 'אק"). הטמע את הרקמה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) המתחם, הקפאת הרקמה בתוך המחזיק, כדי לאפשר השלמת היסטולוגיה Mohs להכנת הכפפות היסטולוגית נוספת לניתוח ניסיוני.
- הכנת שקופיות היסטולוגית
- חתך קטעי רקמה 7 מיקרומטר עבה באמצעות cryostat וליצור שתי (או יותר) שקופיות עבור כל מדגם הגידול. ודא כי כל שקופית מכילה עד שלושה קטעים של הגידול המלא.
הערה: אחד משני שקופיות יהיה מוכתם באמצעות H & E על ידי ההיסטולוג Mohs, ואת שקופיות נוספות (ים) עשוי להיות מעובד עם IF, IHC, או ניתוח דגים. - מניחים את השקופיות אצטון עבור 1-2 s כדי לתקן את הרקמה. הגדר שקפים אלה בצד לייבוש. אל H & Eכתם או coverslip את השקופית לשמש בעתיד immunofluorescence (IF), אימונוהיסטוכימיה (IHC), או פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) ניתוח, בהתאם פרוטוקול הניסוי.
- חתך קטעי רקמה 7 מיקרומטר עבה באמצעות cryostat וליצור שתי (או יותר) שקופיות עבור כל מדגם הגידול. ודא כי כל שקופית מכילה עד שלושה קטעים של הגידול המלא.
- עיבוד רקמות שלאחר המוות
- לאחר עיבוד Mohs הושלמה (צעדים 1.1-1.2), לעבוד בחדר cryostat ו לחטט את המדגם מן המדיום cryo-embedding ומקום הרקמה לתוך צינור קריוגני שכותרתו.
- מניחים את הבקבוקון שכותרתו חנקן נוזלי לפני הרקמה יש מופשר. אם דגימות ישמשו לחלבון ו / או ניתוח DNA, הם עשויים להיות מועברים חנקן נוזלי או מקפיא -80 מעלות צלזיוס בתוך כמה דקות כדי להיות מאוחסן ביטוי חלבון עתידי וניתוח המוטציה DNA (ראה שלבים 4-5) .
הערה: אם רנ"א שלם הוא הרצוי מדגם שלאחר Mohs, זה חיוני כדי לשמור על המדגם קפוא במהלך ההסרה מן המדידה cryo-embedding. אם הטיפול הקיצוני אינו מופעלבשלב זה, המדגם שלאחר Mohs צריך להיות שמור עבור חלבון ו / או ניתוח DNA.
- עיבוד של ANT טרי
- בזמן סגירת Mohs, לקבל ANT מן המנתח Mohs.
- הסר כמות שווה או גדולה יותר של ANT כפי שנקטף מדגם SCC (ראה לעיל) מן הצד apical של הרקמה הרגילה ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל המכיל בינוני תרבות (תערובת 1: 1 של DMEM: F- 12 בתוספת HEPES מ"מ 25, 100 IU / מ"ל של פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) באמצעות פינצטה.
- לגמרי לטבול את הרקמה במדיום התרבות אותו חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד עיבוד הבא (ראה שלבים 4-6).
2. דם, רוק, ו Buccal עיבוד ספוגית
- השג כ 10 מ"ל של דם צינורות EDTA איסוף באמצעות וניפנקטורה.
- מעבירים את הדם מן צינורות איסוף צינור סטרילית 15 או 50 צנטריפוגות מ"ל. הסר כ 200 μL לתוך צינור 1.5 מ"ל cryogenic, הימנעות בועות; חנות זו מדגם דם שלם ב -80 מעלות צלזיוס, כדי לשמש genotyping בעתיד התאמת רקמות, במידת הצורך.
- ספין את הדם הנותר ב 1000 xg במשך 30 דקות ופעל נהלים סטנדרטיים כדי לאסוף את חלק הפלסמה.
- Aliquot פלזמה לתוך 1 מ"ל במרווחים של 1.5 מ"ל צינורות cryogenic ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש במהלך ניתוח ביופסיה נוזלי בעתיד.
- השתמש במקלון סטרילי כדי לקבל מדגם ספוגית buccal ולאחסן את ספוגית בצינור סטרילי בטמפרטורת החדר.
- במידת הצורך, לקבל מדגם רוק לאחסן בצינור סטרילי בטמפרטורת החדר.
הערה: דגימות אלה עשויים לשמש גנוטיפינג בעתיד התאמת רקמות, במידת הצורך.
3. רישום של דוגמאות
- העברת מידע מתוך רשימת הדגימות של המטופל למסד הנתונים biorepository. כלול מידע המטופל diagNosis מן התרשים המטופל.
- הדפס תוויות עם ברקוד עבור כל מדגם להקליט כל במסד הנתונים כדי לקשר כל מדגם שנאסף עם נתוני המטופל.
- הקלט את ההפצה של דגימות דה מזוהה במאגר biorepository לפני העברת דגימות למעבדה המחקר.
4. בידוד חלבון המערבי ניתוח כתם
- מניחים כל דגימה רקמה (SCC ו / או ANT) לתוך בקבוקון המכיל 500 μL של חיץ תמוגה התא המכיל מעכבי פרוטאז לכל 100 מ"ג של רקמות lyse הרקמה.
הערה: השתמשנו assay radioimmunoprecipitation (RIPA) חיץ, המורכב 50 מ"מ טריס pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 0.5% נתרן deoxycholate, 1.0% NP-40, ו 0.1% SDS. מאגרים תמוגה תאים אחרים ניתן להשתמש. - Homogenize הרקמות באמצעות homogenizer רקמות במשך 5 דקות במרווחים 20-S ב 4 מעלות צלזיוס. ספין דגימות ב XG 21,000 ו 4 ° C במשך 20 דקות ולאסוף את החלבון המכיל supernatant לתוך tu טרייםלִהיוֹת. Re- לסובב את supernatant באמצעות אותם תנאים לאסוף את supernatant הסופי לתוך צינור חדש.
- Electrophorese 30-50 מיקרוגרם של חלבון מכל מדגם באמצעות ג'ל 4-20% SDS-polyacrylamide מדרון. הכתם ג'ל עם Coomassie כחול לדמיין להקות חלבון, אם תרצה.
- אם ניתוח כתם המערבי של חלבונים לידי ביטוי נחוץ, להעביר את החלבונים מן הג'ל כדי polyluylidene difluoride (PVDF) קרום בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר ההעברה, Ponceau הכתם קרום PVDF לדמיין להקות חלבון, אם תרצה.
- לחסום את הממברנה PVDF בדיקה כדי לזהות חלבונים עניין בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. השתמש נוגדנים ראשוניים ספציפיים החלבון (ים) של עניין, יחד עם נוגדנים משניים המקביל ספציפי עבור הנוגדנים העיקריים, בריכוז המומלץ על ידי היצרן לניתוח כתם המערבי.
- לחשוף את הממברנה בדיקה באמצעות מצע chemiluminescent ואת התמונה הממברנה באמצעות imagiמערכת.
5. בידוד RNA ו כמותי פולימראז התגובה שרשרת (qPCR)
- מיד מקום דגימות רקמות טריות (SCC ו / או ANT) לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל פתרון ייצוב רנ"א במקום דגימות רקמות מוח לאחר צינור 1.5 מ"ל המכיל פתרון מעבר רקמות קפוא, בעקבות המלצות היצרן. ודא כי הרקמה שקועה לחלוטין. חנות דגימות אלה ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הסר את דגימות רנ"א מ -80 מעלות צלזיוס והפשרה על הקרח. מעבירים את הרקמה לצינור 1.5 מ"ל חדש המכיל 1 מ"ל של חיץ RNA החילוץ (פנול / guiidine thiocyanate) לכל 50-100 מ"ג של רקמות.
- Lyse הרקמות באמצעות homogenizer רקמות. לבצע שישה מחזורים של homogenization, ואחריו תקופה של קירור מדגם; כל מחזור מורכב של 20 ים של homogenization ב 4 ° C ו 40 של תקופת הקירור. לאחר homogenization, דגירה המדגם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 0.2מ"ל של כלורופורם לכל 1 מ"ל של חיץ רנ"א החילוץ ולנער את הצינור במרץ על ידי יד במשך 15 s. דגירה של 2-3 דקות בטמפרטורת החדר.
- ספין דגימות ב XG 12,000 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הסר את השלב מימית של המדגם ומניחים אותו צינור חדש 1.5 מ"ל.
- הוסף 0.5 מ"ל של איזופרונול 100% לכל 1 מ"ל של חיץ החילוץ RNA בשימוש בשלב 5.2 לשלב מימית דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: אם התשואות RNA צפויים להיות נמוכים ( כלומר, נפח רקמות החל הוא פחות מ 10 מ"ג), דגימות עשוי להיות זירז לילה ב -80 ° C. בנוסף, 5 מיקרוגרם של גליקוגן ללא RNase חינם μL 500 למאגר החילוץ RNA ניתן להוסיף במהלך השלב משקעים איזופרונול כדי לשפר את התשואות RNA. - ספין המדגם ב XG 12,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את supernatant ולשטוף את גלולה עם 1 מ"ל של 75% אתנול.
- וורטקס המדגם בקצרה ולאחר מכן לסובב אותו ב 7,500 XG ו 4 °C במשך 5 דקות. מחק את לשטוף ויבש את האוויר גלולה במשך 5-10 דקות.
- Resuspend גלולה RNA ב 20 μL של מים ללא RNase.
- אם תרצה, לטהר כל מדגם RNA באמצעות ערכת ניקוי RNA בעקבות המלצות היצרן.
הערה: RNA קטנים יאבדו מהמדגם אם שלב זה מבוצע.
- אם תרצה, לטהר כל מדגם RNA באמצעות ערכת ניקוי RNA בעקבות המלצות היצרן.
- Electrophorese מדגם 1 מיקרוגרם באמצעות 1.2% פורמלדהיד-MOPS agarose ג'ל לנתח את האיכות של רנ"א.
הערה: כחלופה, לנתח דגימות באמצעות bioanalyzer להשיג מספר RIN 13 . - הפוך - לתמלל את RNA כדי cDNA באמצעות פרוטוקול שעתוק לאחור עבור ניתוח qPCR של mRNAs היעד (או miRNAs) של עניין.
6. תרבויות Explant רקמות
- לעקר את הרקמה הנטילה לפני התרבות על ידי טבילה את הרקמה לתוך אתנול 70%.
- מניחים את הרקמה על שקופית או צלחת ומוסיפים בינוני תרבות מספיק (1: 1 תערובת של DMEM: Ham & #של F-12 בתוספת 10% FBS, 25 מ"מ HEPES, 100 IU / מ"ל של פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) כדי לכסות את הרקמה (כדי למנוע את הרקמה מ ייבוש). בזהירות לחתוך את הרקמה לשברים (<1 מ"מ 3 ) באמצעות להב סכין מנתחים.
- מעבירים את שברי רקמות 35 מ"מ צלחת רקמה תרבות ומוסיפים כ 20 μL של בסרום שור עוברית (FBS) על גבי כל קטע.
- השאירו את המנה פתוחה ברדס תרבות 20-30 דקות, או עד כמעט יבש.
- הוסף 1 מ"ל של המדיום תרבות (1: 1 תערובת של DMEM: F-12 של Ham בתוספת 10% FBS, 25 HEPES מ"מ, 100 IU / מ"ל של פניצילין, ו 100 סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל) לכל מנה ו דגירה על 37 מעלות C ב 5% CO 2 . תת-תרבות או תת-שכפול התרבויות במידת הצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגידול ו ANT שימשו בהצלחה בבידוד חלבון נבדק על ידי סופג המערבי. כפי שניתן לראות בתרשים 3 , ניתן לזהות דגימות של חולים שנאספו ואוחסנו במיקרו-מאגר מבוסס-המרפאה שלנו (Muc1 14 , FHL-1 15 ו- p40 16 , 17 ).
איור 3: ניתוח של חלבונים שחולצו ANT ו SCC. החלבון הכולל היה מבודד דגימות ANT ו SCC, ואת הביטוי של סמנים ידועים עבור SCC נבדקו על ידי כתם המערבי. נציג המערבי כתמים של mucin 1 (MUC1), פקטור H-1 (FHL-1), ו p40 (פאנל B) מוצגים. טַעֲנָהלחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
RNA מבודדים באמצעות הטכניקות הנ"ל נבדק על ידי ג'ל אלקטרופורזה, qPCR, וניתוח רנ"א שלמות. איור 4 מציג שתי דגימות המטופל שממנו באיכות גבוהה, RNA שלם היה מבודד. RNA מתאים לכל היישומים במורד הזרם.
איור 4: ניתוח שלמות רנ"א באמצעות ביואנליזה. הערכה של גודל RNA ויושרה על ידי ג'ל אלקטרופורזה (פאנל א). מספר RNA שלמות (RIN) נוצר עבור כל מדגם מבוסס על זכר electrophoretic של מדגם RNA, כולל היחס של RNA ריבוזומלי ואת הנוכחות או היעדר מוצרים השפלה (פאנל B). RIN של "10" מייצג מדגם RNA מושלם, ללא כל השפלה מוצרים, ואילו "1" מסמן לגמרי מושפל sa Mple. פרופילי צפיפות של להקות הם זממו יחידות פלואורסצנטי (FU) לעומת נוקליאוטידים (nt) (פאנל C) עבור דגימות RNA נציג מ SCC ו ANT רקמת החולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
אקספלנסים בת קיימא הוקמה מתוך סעיפים רקמות הוערכו על ידי מיקרוסקופיה ( איור 5 א ). תרבויות אקספלנטיות אלו, הנוצרות מדגימות של גידולים סרטניים ו- ANT, הן תרבויות מעורבות של קרטינוציטים ופיברובלסטים. תרבויות אלה עשויים להיות subcultured או המשמש לפיתוח קו התא בעתיד. שקופיות היסטולוגית מאוחסנות שימשו אימונוהיסטוכימיה ו immunofluorescence. שמוצג באיור 5 ב , מדגם SCC מראה מכתים חיובי עבור אפיתל ל-שינוי mesenchymal המעבר ב SCC 18 .
-Page = "1"> 
איור 5: תרבות אקספרס מכתים אם של SCC חלקים. שלב בניגוד לתמונה של קרצינומה תא קרצינומה explant רקמה (פאנל A, קנה מידה בר = 50 מיקרומטר) וסעיפים רקמות שנאספו כחלק ניתוח מוס מיקרוסקופיים, מוכתמים נוגדן אנטי-pSnail / Slug העיקרי (פאנל B, קנה מידה בר = 25 מיקרומטר ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
יש לנו הניסוי נקבע כי רקמות ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 24-48 שעות לפני בידוד RNA (שלב 5) או תרבות explant (שלב 6) מבלי להשפיע על התוצאות. תשואה RNA או שלמות, כפי שהוערך על ידי אלקטרופורזה ג'ל או bioanalyzer מספר RIN, אינם בסכנה. בנוסף, תרבויות explant מתקבלים בקלות באמצעות רקמות המאוחסנים 4 מעלות צלזיוס עבור thiמשך הזמן. זה מספק גמישות מוגברת בעת העברת דגימות בין המרפאה לבין מעבדת המחקר. כמו בידוד RNA ותרבות explant מבוצעות במעבדה המחקר ולא במרפאה, תכונה זו הופכת את biorepository המרפאה מבוסס מודל חזק יותר ממה שציפינו בעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לדעת המחבר, פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו המתמקד הרכש הקליני של דגימות רקמה עורית הן בגישה מהירה וחסכונית. מטופלים העוברים ניתוח מיקרוסקופיים במוס מתוכננים בדרך כלל במהלך גושי זמן ספציפיים, והאוסף מוגבל לתקופות אלה. אוסף הדגימה כרוך במאמץ של עוזר רפואי המעורב בטיפול בחולה, ההיסטוסטוס של המוס המעבד את דגימות הגידול, וחבר צוות המעבדה המיועד לטפל בדגימת כניסה ועיבוד דם.
עם תיאום קפדני בין שלושת חברי צוות האיסוף ( כלומר, העוזר הרפואי, היסטוסטולוג מוהס וטכנאי המעבדה), מצאנו כי צוות הסיוע הרפואי הקיים יכול להשלים את המשימות הנוספות הקשורות באיסוף של 3-5 דגימות רקמות ליום ללא כל עיכוב ניכר בפעילות המרפאה. קבלת הסכמת החולה ו איסוף בוקאלי ספוגי דם הושלמו במהלך תקופות המתנה נורמלי מעורב עם הליך microsurgery Mohs. מלבד קבלת ההחלטות על איך מדגם הוא להיות מעובד, המשימות שעבורן אחראי ההיסטולוג Mohs אחראים בסוף עיבוד Mohs של דגימות המטופל ובדרך כלל יוסיף כ 30 דקות על לוח הזמנים היומי. בדרך כלל, חבר בצוות המרפאה אחראי על תיוג ועיבוד דגימות הדם ועל ביצוע כל העברה וכניסה של דגימות למסד הנתונים. בהתאם למספר דגימות מעובד, חובות אלה עשויים לדרוש זמן ניכר הרחק חובות קיימות; ולכן, איסוף המדגם צריך להתבצע רק כאשר צוות המעבדה מספקת זמין. באופן ספציפי, אם יותר מ 5 דגימות נאספות ביום אחד, או אם כמה דגימות דם נאספים מהחולים, כמה שעות של מאמץ נוסף של טכנאי המעבדה יש צורך.
Jove_content "> במהלך ימי האספקה, המסייעים הרפואיים (MA) מקבלים את הסכמתם של החולים לתרומות של רקמות, ומאוחר יותר מקבלת מחלת דגימות (ורוק, במידת הצורך) ואוספת דם לעיבוד על ידי אנשי המעבדה. מעורבות המטופלים לאחר איסוף הדגימות, כך שמבחינת המטופל, שאר הביקורים במרפאה לא השתנו (אם כי הם מתבקשים לתרום דם במהלך כל ביקור המשך), וכיום ניתן להעריך כי 70% מהחולים מסכימים כדי לתרום רקמות, עם 30% מהחולים האלה גם תורמים דם, 30% ירידה להשתתף כיום, רק חולים עם אבחנה מוכחת ביופסיה של סרטן כלולים biorepository.חולים עם מחלה מוכרת בדם ידועים נשלל .חבר צוות המעבדה אחראי על תיאום עם שני חברי צוות האוסף ורישום הדגימות שנאספו (טבלה 1). אחריאיסוף מדגם ראשוני, טופס הסכמה מוחלטת, דם וחוליות ספוגיות מועברים לחבר צוות המעבדה, וראשי התיבות של התורם, תאריך הלידה ומידע רלוונטי אחר, כגון סוג המדגם, נרשמות. זה מאפשר את ההקלטה של מספרים וסוגים של דגימות שנאספו עם כל חולה במהלך הליך איסוף. תרשימי זרימה המסכמים את העיבוד של רקמות SCC ( איור 6 ) ו ANT (איור 7) הם כלים שימושיים להכשרת צוות חדש בהליכי גבייה.
איור 6: תרשים זרימה המתאר את העיבוד של דגימות SCC. עם כריתה של הגידול, גודל המדגם מוערך. אם המדגם הוא ≤2 מ"מ 3 הדגימה כולה מנוצל לעיבוד Mohs, כמו הערכה של שולי נקי (אינדיקטור Ation של הסרת הגידול המלא) הוא בראש סדר העדיפויות. לאחר עיבוד Mohs, כל רקמה שנותר הוא קפוא בחנקן נוזלי הועבר biorepository. אם המדגם הוא גדול מספיק, כך חלק 2 מ"מ 3 של הרקמה ניתן להסיר, חלק זה נאסף והניח בצינור המכיל בינוני תרבות התא, ואילו החלק הנותר מנוצל לעיבוד Mohs מאוחסן כאמור. חלק המדגם הוסרו לתרבות התרבות התא הוא מפולח נוסף, עם ~ 0.5 מ"מ 3 קטע הוסר ונוצל להקמת קו תרבות התא; את יתרת רקמת שבר מועבר biorepository עבור חלבון במורד ניתוח גנים ביטוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Er.within-page = "1"> 
איור 7: תרשים זרימה המתאר את העיבוד של דגימות ANT. בזמן סגירת Mohs, חלק מהרקמה הרגילה הסמוכה (ANT) מוסר ונאסף על ידי המנתח המוס. אם גודל המדגם הוא ≤2 מ"מ 3 , הדגימה כולה ממוקמת צינור cryogenic וקפאה חנקן נוזלי לפני ההעברה biorepository. אם המדגם הוא> 2 מ"מ 3 , הדגימה כולו ממוקם הראשון לתוך צינור המכיל בינוני תרבות התא. הדגימה לאחר מכן מחולקת נוספת לתוך ~ 0.5 מ"מ שבר 3 , כדי לשמש להקמת שורות התרבות תאים. החלק הנותר רקמה מועבר biorepository כדי להיות מאוחסן עבור חלבון במורד הזרם וניתוח ביטוי גנים.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
פרוטוקול זה נועד למזער וריאציה בין דגימות בתוך biorepository. תיאום ותקשורת יעילה בין צוות המרפאה ובין המרפאה לבין כל אנשי המעבדה חיוניים כדי למזער השתנות ולמקסם את השגתם של DNA, RNA וחלבון באיכות גבוהה מהרקמות. בעוד DNA וחלבון בתוך הרקמות חזקים, אם RNA הוא הרצוי, חשוב לשמור על הרקמות קר במדיום המתאים במהלך איסוף, הובלה ועיבוד על מנת לשמור על שלמות רנ"א. שמירת רשומות מדויקת חיונית גם לקישור דגימות החולה עם ההיסטוריה והאבחון שלהן, מכיוון שמידע זה נחוץ לעיתים קרובות בעת ניתוח התוצאות מיישומים במורד הזרם.
עם העניין הגובר ברפואה אישית ביומחקר הסמן, מספר biorepositories הוקמו לאחרונה. אלה קשורות בדרך כלל עם מרפאות בית החולים במרכזים אקדמיים גדולים יש עלויות משמעותיות מעורב עם ההתקנה והפעולה 2 , 8 , 19 . הפיתוח של biorepository מבוסס מרפאה עבור דגימות סרטן עורית שנוצר כחלק בפועל היומי יש כמה יתרונות מרכזיים על פני biorepositories אחרים. ראשית, עם אוסף יחיד באתר עיבוד הדגימה, וריאציות בטיפול המדגם, אשר יכול לפגוע ביישומים במורד הזרם, הם ממוזער. שנית, כמו אלה נתרמו דגימות נמשכים מאוכלוסיית חולים יציבה, גישה רשומות רפואי מזוהים ונתוני תוצאות המטופל הם ללא תחרות. נתונים אלה עשויים להיות אנונימיים ומועברים מתרשים המטופל למסד הנתונים biorepository בזמן איסוף המדגם או בביקור מעקב. שלישית, עם בסיס המטופל הנאמן, clביולוגי מבוסס biorepository הוא מסוגל לאסוף דגימות מרובות מאותו מטופל, מדגם להגדיר לא מתקבל לעתים קרובות הגדרות אחרות. אחת המגבלות של פרוטוקול זה היא כי זה כבר מותאם לדגימות עורית שהושגו באמצעות ניתוח microsraphic Mohs ואולי צריך להיות שונה עבור סוגים אחרים של רקמות או הליכים קליניים.
בסך הכל, אחת המטרות העיקריות של biorepository היא לספק מגוון רחב של דגימות מאותו תורם כדי לאפשר לחוקרים לשאול מגוון רחב של שאלות, במיוחד עבור פיתוח ביופסיות נוזלי וסמני סרטן. באופן ספציפי, היכולת לקשר בין היסטולוגיה של הגידול לבין הביטוי של סמנים ביולוגיים ברמות ה- mRNA והחלבון לדגימות פלסמה, כמו גם את היכולת להתייחס לנתוני תוצאות החולה, יוצרת מערך נתונים חזק במיוחד. אנו מקווים כי המודל biorepository המרפאה ניתן להשתמש כדי לעזור להקל על המחסור של דגימות המטופל במחקר ביו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי כספים מן המערב התיכון אוניברסיטת מכללת למדעי הבריאות מחקר מענק סיוע, הוענק EEH, ו Midwestern אוניברסיטת מחקר של מחקר תוכניות ממומן גרנט פנימי, הוענק KJL. תמיכה נוספת סופקה על ידי מעבדות קשורות ודרמטולוגיה. אנו מודים שרה Potekhen, ג'יימי בארטו, סטפני פאוקס, קודי Jording, Stacie Schimke, הת 'ר Kissel, עלי Zaidi על סיוע טכני שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA | ThermoFisher Scientific | 02-685-2B | |
| Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades | ThermoFisher Scientific | 50-949-411 | |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | ThermoFisher Scientific | 16-100-110 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-138 | |
| Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium | ThermoFisher Scientific | NC9791321 | |
| Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound | ThermoFisher Scientific | 50-363-579 | |
| Leica CM1950 Cryostat | Leica Biosystems | 14047743909 | |
| Frosted Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-343 | |
| Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 99-900-01 | |
| Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes | ThermoFisher Scientific | 03-337-7X | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| Boca Scientific BuccalT-Swab | ThermoFisher Scientific | NC9679349 | |
| Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer | ThermoFisher Scientific | 50-195-822 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | PI78443 | |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 05-401-203 | |
| Pellet Morter Cordless Homogenizer | ThermoFisher Scientific | 12-141-3 | |
| RNAse Free Pellet Pestle | ThermoFisher Scientific | 121-141-364 | |
| Forma SteriCycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 13-998-089 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | SH30071.02 | |
| Gibco Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12-634-028 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140148 | |
| Gibco 1 M Hepes | ThermoFisher Scientific | 15-630-130 | |
| Nunc Cell Culture 35 mm with Vent | ThermoFisher Scientific | 1256591 | |
| Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 | Abnova | MAB12583 | |
| Anti-p40 (p63 delta) antibody | Abnova | ABX-144A | |
| Anti MUC-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-7313 | |
| Anti-Snail + Slug (phospho S246) | Abcam | Ab63568 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 568 Phallodin | Molecular Probes | A12380 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P36941 | |
| Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera | Zeiss | 4300009901 | |
| Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera | Olympus | IX511F3 |
References
- Baker, M. Biorepositories: Building better biobanks. Nature. 486, 141-146 (2012).
- Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
- Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
- National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
- Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
- Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
- Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
- Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
- Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
- Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
- Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
- Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
- Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
- Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
- Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
- Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
- Vaught, J. Developments in biospecimen research. Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).
