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Medicine

क्लिनिक-आधारित बायोरेपोसिटरी की स्थापना

Published: May 29, 2017 doi: 10.3791/55583
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3, 1
1Affiliated Dermatology & Affiliated Laboratories, Midwestern University Osteopathic Postdoctoral Training Institute, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Arizona College of Osteopathic Medicine, Midwestern University, 3Biomedical Sciences Program, College of Health Sciences, Midwestern University

Summary

मोहस के माइक्रोग्राफिक सर्जरी के बाद कम्यूनिक ट्यूमर को अक्सर त्याग दिया जाता है। एक प्रोटोकॉल यहां वर्णित है जो क्लिनिकल ऑपरेशन के बिना हस्तक्षेप किए हुए डाउनस्ट्रीम प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए क्लिनिकल सपोर्ट स्टाफ को प्रभावी रूप से प्रोटेक्शन और स्टोर करने में सक्षम बनाता है ( जैसे, स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा, बेसल सेल कार्सिनोमा, और मेलेनोमा) नमूनों।

Abstract

पिछले कई सालों से त्वचा कैंसर ( जैसे, स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा, बेसल सेल कार्सिनोमा और मेलेनोमा) की घटनाएं बढ़ रही हैं। यह उम्मीद है कि बायोमेडिकल शोध अध्ययनों के लिए कटियन ट्यूमर के नमूनों की समानांतर मांग होगी। हालांकि, ऊतक की उपलब्धता, एक जैवपोषक की स्थापना की लागत और नैदानिक ​​परिचालनों में हस्तक्षेप न करने वाले नैदानिक ​​नमूनों को प्राप्त करने के लिए उपलब्ध प्रोटोकॉल की कमी के कारण सीमित है। एक प्रोटोकॉल को चाकूयुक्त ट्यूमर और जुड़े रक्त और लार के नमूने एकत्रित करने और संसाधित करने के लिए स्थापित किया गया था जो कि मोहस शल्य चिकित्सा की तिथि पर नियमित नैदानिक ​​प्रक्रियाओं पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है। मोम्स हॉस्टोटेक्नोलॉजिस्ट द्वारा बायोप्सी सिद्ध साबित कटिबंधों के लिए मोहसे सर्जरी की अपनी पहली परत से गुजरने वाले रोगियों से ट्यूमर के नमूने एकत्र और संसाधित होते हैं। निकटस्थ सामान्य ऊतक शल्यचिकित्सा बंद होने के समय एकत्र किया जाता है। अतिरिक्त नमूने जो इकट्ठे किए जा सकते हैं, पूरे रक्त और बुक्कल स्वैब्स हैं। सामान्य रूप से खारिज किए गए ऊतक नमूनों का उपयोग करके, एक बायोरपोसिटरी उत्पन्न होता है जो प्रयोगशाला सेटिंग से बना क्लिनिक में आधारित होने के द्वारा कई महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। इसमें एकत्र किए गए नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है; रोगविज्ञान रिपोर्टों सहित, डी-पहचान किए गए रोगी रिकॉर्ड तक पहुंच; और, ठेठ दाता के लिए, अनुवर्ती विज़िट के दौरान अतिरिक्त नमूने तक पहुंच।

Introduction

कैंसर और बायोमार्कर अनुसंधान गुणवत्ता वाले मानव ऊतक नमूनों की आपूर्ति पर निर्भर करता है, और सीमित आपूर्ति ने शोध 1 , 2 को बाधित किया है। कई त्वचा विज्ञान अध्ययन अपर्याप्त आपूर्ति, चर गुणवत्ता, और मानवीय ऊतक के उपयोग से जुड़े लागतों द्वारा सीमित हैं। एक बड़े, समर्पित बायोबैंक स्थापित करने की लागत का अनुमान लगभग 20 लाख डॉलर है, और ये लागत कई शोधकर्ताओं की पहुंच से मानव ऊतक का उपयोग करते हैं। इसके अलावा, शोध के नमूने बनाने और संग्रहीत करने की प्रक्रिया नैदानिक ​​आपरेशनों को प्रभावित करने और मरीज की देखभाल में देरी से होने वाले जोखिम को ध्यान में रखते हुए सावधानीपूर्वक निष्पादित नहीं होती है। एक लागत प्रभावी, क्लिनिक आधारित बायोरेपोसिटरी की स्थापना की गई है जो कि त्वचा कैंसर के नमूनों पर ध्यान केंद्रित करती है, सिफारिश की सर्वोत्तम प्रक्रियाओं और नमूना सत्यापन 4 , 5 , 6 ।

7 , 8 के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है।

Mohs micrographic सर्जरी तकनीक का लक्ष्य यह सुनिश्चित करना है कि जितना संभव हो उतना स्वस्थ ऊतक को संरक्षित करते समय सभी कैंसर के ऊतकों को हटा दिया जाए। इस प्रक्रिया में ट्यूमर के ऊतकों की पतली परतों को प्रगतिशील हटाने शामिल है। प्रत्येक क्रमिक परत उसकी हैत्वचा रोग विशेषज्ञ द्वारा सभी कैंसर के ऊतकों को हटा दिया गया है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए टॉगल की जांच के लिए (ट्यूमर के ऊतक को रोका जाने और एच एंड ई स्टेंसिंग करने के बाद) की जांच की जाती है। ऊतकों के बाद की परतों की परीक्षा और परीक्षा निष्पादित की जाती है, जबकि मरीज कार्यालय में रहता है। इस तकनीक को एससीसी 9 के लिए सबसे अच्छा इलाज विकल्प माना जाता है इस बिंदु पर, घाव बंद हो गया है और, उपचार और कॉस्मेटिक उपस्थिति में सुधार करने के लिए, आसन्न सामान्य ऊतक (एएनटी) अक्सर खुले हुए हैं इस प्रकार, एक ट्यूमर को निकालने के लिए इस शल्य प्रक्रिया को भविष्य के अध्ययनों के लिए ऊतक-दृष्टि से वर्णित ऊतक इकट्ठा करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल है।

सामान्य कर्मचारियों के कर्तव्यों ( चित्रा 1 ) पर न्यूनतम प्रभाव रखने के लिए ट्यूमर के ऊतक, आसन्न सामान्य ऊतक, लार और रक्त के नमूने प्राप्त करने के लिए खरीद प्रक्रिया तैयार की गई है। प्रक्रिया के लिए मरीज की तैयारी करते समय चिकित्सा सहायकों रक्त ड्रॉ करते हैं। Mohs प्रक्रिया पूरा होने के बाद, एम ओह हॉस्टोटेक्नोलॉजिस्ट नमूने के अतिरिक्त हिस्टोलॉजिकल स्लाइड्स तैयार करता है और ऊतक को बायोरपोसिटरी में स्थानांतरित करता है। बायोरेपोसिटरी की स्थापना के साथ जुड़े लागत में क्रियोपेशेशंस फ्रीजर, सामान्य नैदानिक ​​प्रयोगशाला अंतरिक्ष की स्थापना, और इन्वेंट्री ट्रैकिंग कार्यक्रम का विकास शामिल है।

आकृति 1
चित्रा 1: नमूना संग्रह और जिम्मेदार कर्मचारियों की अनुक्रम रोगी की जांच-पड़ताल और रोगी की सहमति की प्राप्ति पर, चिकित्सा सहायक एक बूकेदार स्वाद इकट्ठा करता है और रक्त ड्रॉ करता है। त्वचा विशेषज्ञ और चिकित्सा सहायक तब ट्यूमर को उत्पादित करते हैं और घाव को बंद करते हैं, जिसके दौरान एससीसी और एएनटी नमूनों को क्रमशः एकत्र किया जाता है। एक समर्पित प्रयोगशाला तकनीशियन, रक्तसंवर्धन और ऊतक संवर्धन, संरक्षण और बायोरेपोसिटरी में प्रवेश के लिए एससीसी और एएनटी नमूनों के खूनों और वर्गों को प्रक्रिया करता है।Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एकत्र किए गए नमूने की विविधता विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक दृष्टिकोण ( चित्रा 2 ) को सक्षम करती है। रोगी से एकत्र किए गए नमूने हैं बुक्कल swabs (लार भी यदि आवश्यक हो तो एकत्र किया जा सकता है), पूरे रक्त और excised tissue। जीनोटाइपिंग और ऊतक मिलान के लिए, पूरे रक्त से एक मस्तिष्क स्वाद और एक नमूना प्रोसेसिंग के बिना बचाया जाता है। पूरे रक्त को सफेद रक्त कोशिका (डब्लूबीसी) और भविष्य के विश्लेषण के लिए प्लाज्मा अंशों में विभाजित किया गया है। Mohs प्रसंस्करण के बाद, जमे हुए ट्यूमर सीधे तरल नाइट्रोजन में रखा जाता है और एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र को स्थानांतरित कर दिया जाता है। ताजा, व्यवहार्य ट्यूमर ऊतक और एएनटी नमूनों की पिछली तकनीक 10 , 11 के संशोधनों का उपयोग करके सुसंस्कृत किया जाता है और फिर क्रियोप्रेसेबल। संग्रह के दौरान, प्रत्येक नमूना प्रकार की संख्या दर्ज करने से पहले स्प्रैडशीट पर दर्ज की जाती है सटीक प्रसंस्करण ( तालिका 1 ) की सुविधा के लिए सूची ट्रैकिंग कार्यक्रम।

चित्र 2
चित्रा 2: क्लिनिक-आधारित जैवपोषक नमूना संग्रह और प्रसंस्करण की रूपरेखा। मस्तिष्क से एक बूकेदार स्वाद और रक्त का नमूना एकत्र किया जाता है और डाउनस्ट्रीम जीनोटाइपिंग और ऊतक मिलान के लिए संग्रहीत किया जाता है। पूरे रक्त को आगे सफेद रक्त कोशिका (डब्ल्यूबीसी) अलगाव और सीटीसी विश्लेषण के लिए और साथ ही प्लाज्मा संग्रह और तरल बायोप्सी विश्लेषण के लिए प्रोसेस किया जाता है। Mohs प्रक्रिया के दौरान excised ऊतक निदान उद्देश्यों के लिए histologically संसाधित किया जाता है, जिसके बाद histological स्लाइड्स आगे immunohistochemical विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक इस्तेमाल किया जा सकता है। बशर्ते excised ऊतक का नमूना काफी बड़ा है, ताजा ऊतक का एक हिस्सा निकाल दिया जाता है और प्रोटीन और आरएनए अलगाव के लिए, और सुसंस्कृत सेल लाइनों की स्थापना के लिए विभाजित किया जाता है।55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संग्रहण दिनांक:
रोगी 1 रोगी 2 रोगी 3 रोगी 4 रोगी 5
प्रारंभिक और जन्म तिथि
आँखों का रंग
नमूना प्रकार
नमूना स्थान
लार
डब्ल्यूछेद रक्त
प्लाज्मा
ट्यूमर व्यवहार्य
ऊतक सामान्य व्यवहार्य
ट्यूमर मोहस तरल नाइट्रोजन
ऊतक सामान्य तरल नाइट्रोजन
स्लाइड्स

तालिका 1: नमूना संग्रह रिकॉर्ड करने के लिए चेकलिस्ट। एकत्र किए गए प्रत्येक नमूने के साथ ट्रैक किए गए और रिकॉर्ड किए गए डेटा में शामिल हैं रोगी आद्याक्षर, जन्म तिथि, और आंखों का रंग (त्वचा टाइपिंग के लिए), साथ ही साथ स्थानीयनमूना हटाने पर लार के नमूनों, रक्त संग्रह खंडों की संख्या और एकत्रित व्यवहार्य और संरक्षित टिशू नमूनों की संख्या को बाद में उपयोग के लिए आवंटन के संदर्भ के रूप में भी दर्ज किया गया है। कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना संग्रह प्रक्रिया को मान्य करने के लिए, प्रत्येक नमूना प्रकार को डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन में परीक्षण किया गया है। पिछले तकनीकों के संशोधनों का उपयोग करना 12 , ट्यूमर और एएनटी को सफलतापूर्वक प्रोटीन और आरएनए अलगाव में इस्तेमाल किया गया है और संभवतः डीएनए अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऊतक वर्गों से स्थापित व्यवहार्य explants माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया है, जबकि संग्रहीत histological स्लाइड immunohistochemistry और immunofluorescence के लिए इस्तेमाल किया गया है

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके, इस मॉडल को अन्य त्वचाविज्ञान क्लिनिकों में पेश करना संभव है, अन्य ट्यूमर प्रकार (जैसे मेलेनोमा), और अन्य सर्जिकल विशिष्टताओं और मानव कैंसर में बहुमुखी अनुसंधान के लिए मानव ऊतक के नमूने प्रदान करने के लिए प्रथाओं। इस प्रोटोकॉल के थोड़ा बदलाव अन्य प्रथाओं के लिए आवश्यक होने की संभावना है लेकिन, सिद्धांत रूप में, यह प्रोटोकॉल किसी भी सर्जिकल अभ्यास पर लागू होता है जो रोगी के उपचार के दौरान नियमित रूप से रोगी के नमूने एकत्रित किए जाते हैं।

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Protocol

मानव ऊतक नमूनों पर सभी प्रयोग पश्चिमी आईआरबी (डब्ल्यूआईआरबी प्रोटोकॉल # 20142461) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इन प्रक्रियाओं के ऊतकों के संग्रह के लिए एकल मानदंड एससीसी के एक बायोप्सी-सिद्ध निदान है। कोई बहिष्करण मानदंड मूल आईआरबी प्रोटोकॉल में उल्लिखित नहीं थे, लेकिन ज्ञात खून से संक्रमणीय रोग वाले रोगियों के नमूनों का इस्तेमाल नहीं किया गया था। सूक्ष्म रूप से ऊतक, रक्त, और लार के संग्रह से पहले प्राप्त सहमति प्राप्त की गई थी। मिडवेस्टर्न इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड ने मिडवेस्टर्न यूनिवर्सिटी (एजेड # 807) पर क्लिनिक आधारित बायोरपोसिटरी नमूने के साथ सत्यापन कार्य को मंजूरी दी।

1. कट्युलस ट्यूमर टिशू प्रोसेसिंग

नोट: यह एक Mohs histotechnologist द्वारा किया जाता है

  1. ताजा स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) आरएनए और स्पंपल कल्चर के लिए टिशू प्रसंस्करण
    1. मोश सर्जन द्वारा ऊतक को उत्तेजित किया जाने के बाद, 10 से 50 मिलीग्राम (≥ 10 मिमी 3 नोट: यह केवल तभी संभव हो सकता है जब ट्यूमर बड़े आकार के एक 10-50 मिलीग्राम आकार का नमूना (≥ 10 मिमी 2 ) को हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन से पहले निकाला जा सके, जो कि मोहस प्रक्रिया का हिस्सा है। यदि कम से कम 2 मिमी 3 निकालने की अनुमति देने के लिए ट्यूमर पर्याप्त नहीं है, तो आरएनए (चरण 5 को छोड़ें) के लिए प्रोसेसिंग के साथ आगे बढ़ें न।
    2. टीएमईएम का उपयोग करते हुए 1.5 मिमी पौंड लेबल वाले लेबल (1.5 मिमी डीएमईएम: हैम एफ -12, 25 मिमी हेपेशस, 100 आईयू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) युक्त लेबल के लिए व्यवहार्य ऊतक को ट्रांसफर करें और सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से मध्यम में डूबे हुए हैं। इस ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस से अतिरिक्त प्रोसेसिंग से पहले स्टोर करें।
    3. आरएनए अलगाव और अभिव्यक्ति विश्लेषण (चरण 5 देखें) के लिए ऊतक का उपयोग करें और / या प्रतिष्ठान24 घंटे के भीतर एक व्याख्यात्मक संस्कृति (चरण 6 देखें)
    4. ट्यूमर के नमूने को छोड़ दें, जिसे एक cryostat ऊतक धारक (या "चक") पर रोगी (चरण 1.1.1) से हटा दिया गया था। इष्टतम काटने के तापमान (ओ सी टी) के परिसर में ऊतक को एम्बेड करें, धारक के अंदर ऊतक को ठंड, मोहस के ऊतक विज्ञान के पूरा होने और प्रायोगिक विश्लेषण के लिए अतिरिक्त हिस्टोलॉजिकल स्लाइड तैयार करने के लिए अनुमति दें।
  2. हिस्टोलॉजिकल स्लाइड्स की तैयारी
    1. एक cryostat का उपयोग करके 7 μm मोटी ऊतक अनुभाग कट और प्रत्येक ट्यूमर नमूना के लिए दो (या अधिक) स्लाइड बनायें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्लाइड में पूर्ण ट्यूमर के तीन भाग होते हैं।
      नोट: Mohs histotechnologist द्वारा दो स्लाइडों में से एक एच एंड ई का उपयोग करके दाग जाएगा, और अतिरिक्त स्लाइड (एस) पर IF, IHC, या FISH विश्लेषण के साथ संसाधित किया जा सकता है।
    2. ऊतक को ठीक करने के लिए एसीटोन में स्लाइड्स को 1-2 सेकंड के लिए रखें। सूखा करने के लिए इन स्लाइड्स को एक तरफ सेट करें एच एंड ई मत करोप्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के आधार पर भावी इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF), इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), या स्वस्थानी संकरण (एफआईएसएच) विश्लेषण में प्रतिदीप्ति के लिए इस्तेमाल होने वाली स्लाइड को दाग या कतरनीकृत करें।
  3. पोस्ट-मोहस टिश्यू के प्रसंस्करण
    1. एक बार Mohs प्रसंस्करण पूरा हो गया (चरण 1.1-1.2), cryostat कक्ष में काम करते हैं और cryo-embedding माध्यम से नमूना pry और ऊतक एक लेबल क्रायोजेनिक ट्यूब में जगह।
    2. तरल नाइट्रोजन में लेबल शीशी को रखें इससे पहले ऊतक को पिघल दिया गया है। यदि नमूने प्रोटीन और / या डीएनए विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाते हैं, तो उन्हें भविष्य में प्रोटीन अभिव्यक्ति और डीएनए उत्परिवर्तन विश्लेषण (चरण 4-5 देखें) के लिए कुछ मिनटों में तरल नाइट्रोजन या -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में स्थानांतरित किया जा सकता है ।
      नोट: यदि बरकरार आरएनए पोस्ट- Mohs नमूना से वांछित है, तो क्रायो-एम्बेडिंग माध्यम से हटाने के दौरान नमूना जमे हुए रखने के लिए आवश्यक है। यदि चरम परवाह का प्रयोग नहीं किया जाता हैयह कदम, पोस्ट-मोहस का नमूना प्रोटीन और / या डीएनए विश्लेषण के लिए आरक्षित होना चाहिए।
  4. ताजा एएनटी का प्रसंस्करण
    1. मोहों के बंद होने के समय, मोहसेन सर्जन से एएनटी प्राप्त करें।
    2. सामान्य ऊतक के शिखर पक्ष से एससीसी नमूना (ऊपर देखें) से काटा गया एक समान या अधिक से अधिक राशि निकालें और उसे एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब वाले लेवल के साथ संस्कृति माध्यम (1: 1 मिश्रण का डिमएम: एचएम एफ एफ- 12 25 मिमी एचईपीईएस, 100 आईयू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ चिमटी का उपयोग करते हुए।
    3. पूरी तरह से एक ही संस्कृति माध्यम में ऊतक को विसर्जित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर बाद में प्रसंस्करण तक (चरण 4-6 देखें)।

2. रक्त, लार, और बुक्कल स्वाब प्रसंस्करण

  1. वैनिपुंक्चर के माध्यम से EDTA संग्रह ट्यूबों में लगभग 10 एमएल रक्त प्राप्त करें।
  2. संग्रह ट्यूब से एक बाँझ 15- या 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रक्त हस्तांतरण। 1.5 एमएल क्रायोजेनिक ट्यूब में लगभग 200 μL निकालें, बुलबुले से बचने; यदि आवश्यक हो तो भावी जीनोटाइपिंग और ऊतक मिलान के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला यह पूरे-रक्त नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    1. शेष खून को 1,000 मिनट में 30 मिनट तक स्पिन करें और प्लाजमा अंश को इकट्ठा करने के लिए मानक प्रक्रियाओं का पालन करें।
    2. भविष्य में तरल बायोप्सी विश्लेषण के दौरान उपयोग के लिए -180 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर क्रायोजेनिक ट्यूबों में 1 एमएल की वृद्धि में प्लाज्मा को विभाजित करें और स्टोर करें।
  3. एक बूकेदार swab नमूना प्राप्त करने के लिए एक बाँझ swab का प्रयोग करें और कमरे के तापमान पर एक बाँझ ट्यूब में swab स्टोर।
  4. यदि आवश्यक हो, कमरे के तापमान पर लाली का नमूना प्राप्त करें और एक बाँझ ट्यूब में स्टोर करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो ये नमूने भविष्य के जीनोटाइपिंग और ऊतक मिलान के लिए उपयोग किए जा सकते हैं।

3. नमूनों की रिकॉर्डिंग

  1. रोगी के नमूनों की चेकलिस्ट से बायोरपोसिटरी डेटाबेस में स्थानांतरण करें। मरीज की जानकारी और डायरी शामिल करेंरोगी चार्ट से न्योसिस
  2. प्रत्येक नमूने के लिए एक बारकोड के साथ लेबल प्रिंट करें और प्रत्येक डेटा को रोगी डेटा के साथ लिंक करने के लिए प्रत्येक डेटाबेस को रिकॉर्ड करें।
  3. अनुसंधान प्रयोगशाला के नमूनों को स्थानांतरित करने से पहले बायोरपोसिटरी डेटाबेस में डी-पहचान किए गए नमूनों का वितरण रिकॉर्ड करें।

4. प्रोटीन अलगाव और पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण

  1. प्रत्येक ऊतक के नमूने (एससीसी और / या एएनटी) को एक 500 मिलीलीटर सेल लसीस बफर युक्त एक शीशी में रखें, जिसमें ऊतक को गीला करने के लिए प्रति 100 मिलीग्राम ऊतक प्रति प्रोटीज अवरोधक होते हैं।
    नोट: हमने 50 मिमी ट्रास पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl, 0.5% सोडियम डीओओसाइकॉलेट, 1.0% एनपी -40, और 0.1% एसडीएस से बना एक रेडियोममोनोप्रॉरेबेशन परख (आरआईपीए) बफर का इस्तेमाल किया। अन्य सेल lysis बफ़र्स इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड के अंतराल में 5 मिनट के लिए ऊतक होमोजिजिएज़र का उपयोग करके ऊतकों को होमोजेनइज़ करें नमूने 21,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए स्पिन करें और एक ताजे ट्यू में प्रोटीन वाली सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करेंहो। समान स्थितियों का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को फिर से स्पिन करें और अंतिम सतह पर तैरनेवाला एक ताजा ट्यूब में जमा करें।
  3. प्रत्येक 4-20% एसडीएस-पॉलीएक्लाइमाइड ग्रेडिएंट जेल का उपयोग करके प्रत्येक नमूना से 30 से 50 μg प्रोटीन से इलेक्ट्रोफोरस। प्रोटीन बैंड की कल्पना करने के लिए, यदि वांछित हो तो कॉमॉसी ब्लू के साथ जेल दाग लें।
  4. यदि व्यक्त किए गए प्रोटीन का पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण आवश्यक है, तो मानक प्रोटोकॉल के बाद प्रोटीन को जेल से एक पॉलीविनाइलीइडिन फ्लू्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में स्थानांतरित करें। स्थानांतरण के बाद, पोंसेऊ प्रोटीन बैंड की कल्पना करने के लिए पीवीडीएफ झिल्ली को दागते हैं, अगर वांछित।
  5. मानक प्रोटोकॉल के बाद ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए पीवीडीएफ झिल्ली और जांच को रोकें। पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के लिए निर्माता द्वारा अनुशंसित सांद्रता पर, प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ, ब्याज की प्रोटीन (एस) के लिए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें।
  6. एक चीमिल्मिनेन्सेंट सब्सट्रेट का उपयोग करके जांच की गई झिल्ली का प्रयोग करें और एक कल्पना का प्रयोग करके झिल्ली को चित्रित करेंएनजी सिस्टम

5. आरएनए अलगाव और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR)

  1. तत्काल ताजे टिशू नमूनों (एससीसी और / या एएनटी) को एक आरएनए स्थिरीकरण समाधान युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में रखकर और निर्माता के अनुशंसाओं के बाद जमे हुए ऊतक संक्रमण समाधान वाले 1.5 एमएल ट्यूब में पोस्ट-मोह ऊतक नमूनों को जगह दें। सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से विसर्जित हो गया है। इन नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस तक उपयोग करें।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस से आरएनए नमूनों को निकालें और बर्फ पर पिघलना करें। टिशू को 50-100 मिलीग्राम ऊतक प्रति 1 एनएलएल युक्त आरएनए निष्कर्षण बफर (फिनोल / गिनिडाइन थीसाइनेट) युक्त एक 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण करें।
  3. एक ऊतक homogenizer का उपयोग कर ऊतक Lyse होमोजिनायझेशन के छह चक्रों को पूरा करें, नमूना कूलिंग की अवधि के बाद; प्रत्येक चक्र में 4 डिग्री सेल्सियस और एक 40 एस शीतलन अवधि में 20 एस के होमोजनाइज़ेशन होते हैं। होमोजीनाइजेशन के बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूना सेते।
  4. 0.2 जोड़ेंआरएलए निष्कर्षण बफर के प्रति 1 एमएल प्रति क्लोरोफॉर्म एमएल और 15 सेकंड के लिए हाथ से तेजी से ट्यूब हिला कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. नमूने को 12,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए स्पिन करें नमूना के जलीय चरण को निकालें और इसे एक नया 1.5 एमएल ट्यूब में रखें।
  6. आरए निष्कर्षण बफर के 1 एमएल प्रति 100% आयोप्रोपेनोल को जलीय चरण में चरण 5.2 में इस्तेमाल किया जाता है और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: यदि आरएनए की पैदावार कम होने का अनुमान है ( यानी, प्रारंभिक ऊतक मात्रा 10 मिलीग्राम से कम है), नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर उपजी हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, आरएनए निष्कर्षण बफर के 500 μL प्रति आरएनस मुक्त ग्लाइकोजेन के 5 ग्राम आरआईएनए पैदावार में सुधार के लिए आईसोप्रोणोल वर्षा चरण के दौरान जोड़ा जा सकता है।
  7. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 xg पर नमूना स्पिन करें सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली को 1 एमएल 75% इथेनॉल के साथ धो लें।
  8. संक्षेप में नमूना भंवर करें और फिर इसे 7,500 xg और 4 डिग्री पर स्पिन करें5 मिनट के लिए सी धोने और 5-10 मिनट के लिए गोली मारो हवा सूखी
  9. 20 μL आरएनज मुक्त पानी में आरएनए गोली को फिर से खोलें।
    1. यदि वांछित हो, निर्माता की सिफारिशों के बाद आरएनए क्लीनअप किट का उपयोग कर प्रत्येक आरएनए नमूना को शुद्ध करें।
      नोट: यदि इस कदम पर प्रदर्शन किया जाता है तो छोटे आरएनए नमूने से खो जाएंगे।
  10. आरएफए की गुणवत्ता का विश्लेषण करने के लिए 1.2% फॉर्मलाडिहाइड-मोप्स agarose जेल का उपयोग कर एक 1 μg नमूना का इलैक्ट्रोप्रोसेस।
    नोट: एक विकल्प के रूप में, आरआईएन नंबर 13 प्राप्त करने के लिए बायोएनिलाइज़र का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण करें।
  11. रिवर्स-आरएनए को सीडीएनए के लिए रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन प्रोटोकॉल का उपयोग करके ब्याज के लक्ष्य एमआरएनए (या माइआरएनए) के qPCR विश्लेषण के लिए रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट करें।

6. ऊतक स्पष्टीकरण संस्कृतियों

  1. ऊतक को 70% इथेनॉल में डुबकी करके संस्कृति से पहले excised ऊतक को जीवाणुरहित करें।
  2. ऊतक को एक स्लाइड या डिश पर रखें और पर्याप्त संस्कृति माध्यम जोड़ें (1: 1 डीएमईएम का मिश्रण: हैम & #ऊतक (सूखने से ऊतक को रोकने के लिए) को कवर करने के लिए 10% एफबीएस, 25 मिमी एचईपीईएस, पेनिसिलिन के 100 आईयू / एमएल, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के पूरक के साथ एफएच -1 9; स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके टुकड़ों में टिशू को ध्यान से काट लें (<1 मिमी 3 )
  3. ऊतक के टुकड़े को 35 मिमी टिशू कल्चर डिश में ट्रांसफर करें और प्रत्येक टुकड़े के ऊपर लगभग 20 μL भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) जोड़ें।
  4. पकवान को 20-30 मिनट तक संस्कृति के हुड में खोल दें, या लगभग सूखा तक।
  5. 1 एमएल ऑफ कल्चर मिडियम (1: 1 डीएमईएम का मिश्रण: 10% एफबीएस, 25 मिमी एचईपीईएस, 100 आईयू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक प्रत्येक डिश में और 37 डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक। सी में 5% सीओ 2 संस्कृतियों की उप-संस्कृति या उप-क्लोन, यदि आवश्यक हो

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Representative Results

ट्यूमर और एएनटी को प्रोटीन अलगाव में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है और पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा परीक्षण किया गया है। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, हमारे क्लिनिक-आधारित बायोरेपोसिटरी में संग्रहीत और संग्रहीत रोगी के नमूनों में, त्वचीय स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा मार्कर (Muc1 14 , FHL-1 15 , और p40 16 , 17 ) का पता लगाया जा सकता है।

चित्र तीन
चित्रा 3: एएनटी और एससीसी से निकाले गए प्रोटीनों का विश्लेषण। कुल प्रोटीन एएनटी और एससीसी नमूनों से पृथक किया गया था, और एससीसी के लिए ज्ञात मार्करों की अभिव्यक्ति पश्चिमी ब्लॉट द्वारा जांच की गई थी। प्रतिनिधि पश्चिमी मुस्कान 1 (एमयूसी 1), फैक्टर एच जैसे-1 (एफएचएल -1), और पी 40 (पैनल बी) का दिखाया गया है। दलीलसे इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

उपरोक्त तकनीकों का उपयोग कर पृथक आरएनए जेल वैद्युतकणसंचलन, qPCR, और आरएनए अखंडता विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया गया है। चित्रा 4 चित्रा 4 दो रोगी के नमूनों से पता चलता है जिसमें से उच्च गुणवत्ता, बरकरार आरएनए पृथक किया गया था। आरएनए सभी डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।

चित्रा 4
चित्रा 4: आरएनए अखंडता विश्लेषण बायोएनालिसिस का उपयोग कर। जेल वैद्युतकणसंचलन (पैनल ए) द्वारा आरएनए आकार और अखंडता का आकलन आरएनए नमूने के इलेक्ट्रोफोरेक्टिक ट्रेस पर आधारित प्रत्येक नमूना के लिए एक आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) उत्पन्न होती है, जिसमें राइबोसोमल आरएनए का अनुपात और गिरावट उत्पादों की उपस्थिति या अनुपस्थिति (पैनल बी) शामिल है। "10" का एक आरआईएन एक परिपूर्ण आरएनए नमूना का प्रतिनिधित्व करता है, बिना किसी गिरावट वाले उत्पादों के, जबकि "1" पूरी तरह से अपमानित होता हैmple। बैंड के डेन्सिटोमेट्री प्रोफाइल को एससीसी और एटीआईटी रोगी टिशू से प्रतिनिधि आरएनए नमूने के लिए प्रतिदीप्ति इकाइयों (एफयू) बनाम न्यूक्लियोटाइड (एनटी) (पैनल सी) के रूप में रखा गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

ऊतक वर्गों से स्थापित व्यवहार्य explants माइक्रोस्कोपी ( चित्रा 5 ए ) द्वारा मूल्यांकन किया गया है। ट्यूमर और एएनटी नमूनों से उत्पन्न इन अन्वेषण संस्कृतियों, मिश्रित केराटिनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियां हैं। इन संस्कृतियों को उपसंकुष्ट किया जा सकता है या भविष्य के सेल लाइन विकास के लिए उपयोग किया जा सकता है संग्रहीत हिस्टोलॉजिकल स्लाइड्स का उपयोग इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए किया गया है। चित्रा 5 बी में दिखाया गया, एक एससीसी नमूना एससीसी 18 में एपीथेलियल-टू-मेसेनचिमल ट्रांज़िशन मार्कर के लिए सकारात्मक धुंधला दिखाता है।


चित्रा 5: स्पष्ट संस्कृति और यदि एससीसी वर्गों के धुंधला हो। एक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा टिशू एक्सप्टान्ट (पैनल ए, स्केल बार = 50 माइक्रोन) के चरण के विपरीत छवि और ऊतक वर्ग मोएस माइक्रोग्राफिक सर्जरी के एक हिस्से के रूप में इकट्ठे हुए, जो एक विरोधी पीएसएन / स्लग प्राथमिक एंटीबॉडी (पैनल बी, स्केल बार = 25 माइक्रोन )। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

हमने प्रयोगात्मक रूप से यह निर्धारित किया है कि परिणाम को प्रभावित किए बिना आरएनए अलगाव (चरण 5) या स्पष्टीकरण संस्कृति (चरण 6) से 24-48 घंटे पूर्व ऊतक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। आरएनए उपज या अखंडता, जेल वैद्युतकणसंचलन या बायोएनिलाइज़र और आरआईएन संख्या द्वारा मूल्यांकन के रूप में, समझौता नहीं किया जाता है। इसके अलावा, खोज संस्कृतियों को आसानी से 4 डिग्री सेल्सियस के लिए थाई में संग्रहीत ऊतक का उपयोग कर प्राप्त किया जाता हैसमय की लंबाई यह क्लिनिक और शोध प्रयोगशाला के बीच नमूनों को स्थानांतरित करते समय बढ़ती लचीलापन प्रदान करता है। जैसा कि आरएनए अलगाव और स्पष्टीकरण संस्कृति अनुसंधान प्रयोगशाला में किया जाता है और क्लिनिक में नहीं, यह सुविधा क्लिनिक-आधारित बायोरेपोसिटरी को हम पहले की तुलना में अधिक मजबूत मॉडल बनाते हैं।

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Discussion

लेखक के ज्ञान के लिए, यह प्रोटोकॉल अपनी तरह का पहला तरीका है जो एक लागत प्रभावी और तेज दृष्टिकोण दोनों में त्वचेय ऊतक नमूनों की नैदानिक ​​खरीद पर केंद्रित है। Mohs microsurgery के दौर से गुजर मरीजों को आम तौर पर समय के विशिष्ट ब्लॉकों के दौरान निर्धारित किया जाता है, और संग्रह इन अवधि तक सीमित है। नमूना संग्रह में रोगी देखभाल में शामिल चिकित्सा सहायक, मोहस हिस्टोटेक्नोलॉजिस्ट से ट्यूमर के नमूनों को संसाधित करने और नमूने प्रविष्टि और रक्त प्रसंस्करण को संभालने वाला एक नियुक्त प्रयोगशाला स्टाफ सदस्य शामिल है।

संग्रह टीम के तीन सदस्यों ( यानी, चिकित्सा सहायक, मोहस हिस्टोटेक्नोलॉजिस्ट, और प्रयोगशाला तकनीशियन) के बीच सावधानी से समन्वय के साथ, हमने पाया है कि वर्तमान चिकित्सा सहायता स्टाफ 3-5 ऊतक नमूनों के संग्रह से संबंधित अतिरिक्त कार्यों को पूरा कर सकता है क्लिनिक परिचालन में कोई स्पष्ट देरी के बिना प्रति दिन। रोगी सहमति प्राप्त करना और मोहस माइक्रोस्कोरी प्रक्रिया के साथ जुड़े सामान्य इंतजार अवधि के दौरान ब्लेक swabs इकट्ठा और रक्त पूरा कर रहे हैं। नमूना को कैसे संसाधित किया जाए, इसके बारे में निर्णय लेने के अलावा, जो कार्यों के लिए मोहम्मद हिस्टोटैक्नोलॉजिस्ट जिम्मेदार हैं, रोगियों के नमूनों के मोहसे के प्रसंस्करण के अंत में पूरा किया जाता है और आमतौर पर दैनिक अनुसूची में लगभग 30 मिनट लगेंगे। आमतौर पर, क्लिनिक स्टाफ के एक सदस्य रक्त नमूने के लेबलिंग और प्रसंस्करण के लिए और डेटाबेस में नमूने के किसी भी स्थानांतरण और प्रवेश के लिए जिम्मेदार है। संसाधित नमूनों की संख्या के आधार पर, इन कर्तव्यों को मौजूदा कर्तव्यों से पर्याप्त समय की आवश्यकता हो सकती है; इस प्रकार, नमूना संग्रह केवल तब आयोजित किया जाना चाहिए जब पर्याप्त प्रयोगशाला स्टाफ उपलब्ध है। विशेष रूप से, यदि एक दिन में 5 से अधिक नमूने एकत्र किए जाते हैं, या यदि कई रक्त के नमूनों को रोगियों से एकत्र किया जाता है, तो प्रयोगशाला तकनीशियन के अतिरिक्त प्रयासों के कई घंटे आवश्यक हैं।

संग्रह के दिनों में, मेडिकल असिस्टेंट (एमए) ऊतक के दान के लिए रोगियों से सहमति प्राप्त करते हैं। एमए बाद में एक बूटल स्वास (और लार, यदि आवश्यक हो) प्राप्त करता है और प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा प्रसंस्करण के लिए रक्त इकट्ठा करता है। इन नमूनों के संग्रह के बाद रोगी की भागीदारी, इसलिए रोगी के नजरिए से, क्लिनिक की शेष शेष राशि अपरिवर्तित है (हालांकि उन्हें किसी भी अनुवर्ती यात्रा के दौरान रक्त दान करने के लिए कहा जाता है)। वर्तमान में, हम अनुमान लगा सकते हैं कि 70% रोगियों की सहमति ऊतक दान करने के लिए, उन 30% रोगियों ने रक्तदान भी किया, 30% भाग लेने से इनकार किया गया। वर्तमान में, केवल कैंसर के एक बायोप्सी सिद्ध निदान वाले रोगियों को बायोरपोसिटरी में शामिल किया गया है। ज्ञात रक्तजनित संचारी रोगों वाले मरीजों को बाहर रखा गया है ।

प्रयोगशाला स्टाफ सदस्य संग्रह टीम के अन्य दो सदस्यों के साथ समन्वय करने के लिए जिम्मेदार है और एकत्र किए गए नमूने (तालिका 1) रिकॉर्ड करता है। एक के बादप्रारंभिक नमूना संग्रह, पूरा सहमति फॉर्म, रक्त, और बुके हुए swabs प्रयोगशाला स्टाफ सदस्य को स्थानांतरित कर रहे हैं, और दाता के आद्याक्षर, जन्मतिथि, और नमूना प्रकार जैसे अन्य उचित जानकारी, दर्ज की जाती हैं। यह संग्रह प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक रोगी के साथ एकत्र किए गए नमूनों की संख्या और प्रकार की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। एससीसी ऊतक ( चित्रा 6 ) और एएनटी (चित्रा 7) दोनों के प्रसंस्करण के सारांश में प्रवाह चार्ट संकलन प्रक्रियाओं में नए कर्मचारियों के प्रशिक्षण के लिए उपयोगी उपकरण हैं।

चित्रा 6
चित्रा 6: फ्लोचार्ट एससीसी नमूनों की प्रक्रिया को चित्रित करता है। ट्यूमर छांटने पर, नमूना का आकार मूल्यांकन किया जाता है। यदि नमूना ≤ 2 मिमी 3 है तो पूरे नमूना का प्रयोग महज प्रसंस्करण के लिए किया जाता है, जैसा कि साफ मार्जिन का मूल्यांकन (संकेतपूरी तरह से ट्यूमर हटाने का प्रयास) सर्वोच्च प्राथमिकता है Mohs प्रसंस्करण के बाद, किसी भी शेष ऊतक तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और बायोरपोसिटरी के लिए स्थानांतरित कर दिया है। यदि नमूना काफी बड़ा है, जैसे कि> ऊतक का 2 मिमी 3 भाग हटाया जा सकता है, तो यह भाग एकत्रित किया जाता है और सेल संस्कृति माध्यम युक्त एक ट्यूब में रखा जाता है, जबकि शेष भाग का उपयोग मोहों के प्रसंस्करण के लिए किया जाता है और इसके बाद के संस्करण में संग्रहीत किया जाता है। सेल संस्कृति माध्यम को हटाए गए नमूने के हिस्से को और खंडित किया गया है, जिसमें एक ~ 0.5 मिमी 3 टुकड़ा निकाला और एक सेल संस्कृति लाइन की स्थापना के लिए उपयोग किया गया; शेष टिशू टुकड़ा डाउनस्ट्रीम प्रोटीन और जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के लिए बायोरेपोसिटरी में स्थानांतरित कर दिया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

er.within-पेज = "1"> चित्रा 7
चित्रा 7: एएनटी नमूनों के प्रसंस्करण को चित्रित करने वाले फ्लोचार्ट Mohs बंद होने के समय, आसन्न सामान्य ऊतक (एएनटी) का एक हिस्सा हटा दिया जाता है और मोहस सर्जन द्वारा एकत्र किया जाता है। यदि नमूना आकार ≤2 मिमी 3 है , तो पूरे नमूना को क्रायोजेनिक ट्यूब में रखा गया है और बैरोपोसिटरी में स्थानांतरण के पहले तरल नाइट्रोजन में जमे हुए। यदि नमूना> 2 मिमी 3 है , तो पूरे नमूना को पहले सेल संस्कृति माध्यम युक्त एक ट्यूब में रखा गया है। नमूना को फिर से ~ 0.5 मिमी 3 टुकड़ा में विभाजित किया जाता है, जिसका उपयोग सेल संस्कृति लाइनों की स्थापना के लिए किया जाता है। शेष ऊतक अनुभाग को बायोरेपोसिटरी में स्थानांतरित किया जाता है जो कि डाउनस्ट्रीम प्रोटीन और जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया जाता है।55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यह प्रोटोकॉल जैवपोषक के भीतर नमूनों के बीच अंतर को कम करने के लिए बनाया गया है। क्लिनिक स्टाफ के बीच समन्वय और प्रभावी संचार और क्लिनिक और सभी प्रयोगशाला कर्मियों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने और उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए, आरएनए, और ऊतकों से प्रोटीन को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है। जबकि ऊतकों के भीतर डीएनए और प्रोटीन मजबूत होते हैं, यदि आरएनए की आवश्यकता होती है, तो आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए ऊतकों को ठंडा रखना और उचित माध्यम में संग्रह, परिवहन और प्रसंस्करण रखना महत्वपूर्ण है। रोगी के नमूनों को उनके इतिहास और निदान के साथ जोड़ने के लिए सटीक रिकॉर्ड रखने भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि इस जानकारी को अक्सर डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों से परिणाम का विश्लेषण करते समय ज़रूरी है।

व्यक्तिगत चिकित्सा और जैव में बढ़ती रुचि के साथमार्कर रिसर्च, हाल ही में स्थापित किया गया है एक biorepositories की संख्या। ये आम तौर पर बड़े अकादमिक केंद्रों में अस्पताल-आधारित क्लीनिक से जुड़े हैं और सेटअप और संचालन 2 , 8 , 1 9 के साथ बहुत अधिक लागतें हैं। दैनंदिन अभ्यास के भाग के रूप में बनाए गए त्वचिनित कैंसर के नमूनों के लिए क्लिनिक-आधारित बायोरेपोसिटरी का विकास अन्य बायोरेपॉजिटरीओं के ऊपर कई महत्वपूर्ण फायदे हैं। सबसे पहले, एक संग्रह और नमूना प्रसंस्करण साइट के साथ, नमूना हैंडलिंग में भिन्नताएं, जो डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन से समझौता कर सकती हैं, कम से कम की जाती हैं दूसरा, चूंकि ये दान किए गए नमूने स्थिर रोगी आबादी से आते हैं, अपरिचित चिकित्सा अभिलेखों तक पहुंच और मरीज के नतीजे डेटा अद्वितीय हैं। नमूना संग्रह के समय या फॉलो-अप विज़िट पर इन आंकड़ों का अनावरण किया जा सकता है और रोगी चार्ट से बायोरपोसिटरी डेटाबेस में स्थानांतरित किया जा सकता है। तीसरा, एक वफादार मरीज बेस के साथ, सीएलइनिक-बेस बायोरपोसिटरी उसी रोगी से कई नमूने इकट्ठा करने में सक्षम है, एक नमूना अक्सर अन्य सेटिंग्स में नहीं प्राप्त सेट। इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक यह है कि यह Mohs micrographic सर्जरी के माध्यम से प्राप्त छिटपुट नमूनों के लिए अनुकूलित किया गया है और अन्य प्रकार के ऊतकों या नैदानिक ​​प्रक्रियाओं के लिए संशोधित होने की आवश्यकता हो सकती है

कुल मिलाकर, बायोरपोसिटरी के प्रमुख लक्ष्यों में से एक, एक ही दाता से नमूने का एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदान करना है ताकि शोधकर्ताओं को विशेष रूप से तरल बायोप्सी और कैंसर मार्करों के विकास के लिए कई प्रश्न पूछ सकें। विशेष रूप से, ट्यूमर हिस्टोलोजी को सम्बंधित करने की क्षमता और एमआरएनए और प्रोटीन स्तर के प्लाज्मा नमूनों के साथ-साथ बायोमार्करों की अभिव्यक्ति, साथ ही रोगी परिणाम डेटा को संदर्भित करने की क्षमता, एक विशिष्ट शक्तिशाली डाटासेट बनाता है। हमें उम्मीद है कि जैव-चिकित्सा अनुसंधान में रोगी के नमूनों की कमी को कम करने में क्लिनिक आधारित जैवपोषक मॉडल का उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को मिडवेस्टर्न यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ हेल्थ साइंसेज रिसर्च फसिलिटिशन ग्रांट, ईईएच, और मिडवेस्टर्न यूनिवर्सिटी ऑफ़ रिसर्च एंड स्पॉन्सर प्रोग्राम्स इनट्रैमर ग्रांट, के जेएल से सम्मानित किया गया। सहबद्ध प्रयोगशालाओं और संबद्ध त्वचाविज्ञान द्वारा अतिरिक्त समर्थन प्रदान किया गया था। हम अपनी तकनीकी सहायता के लिए सारा पोटेकेन, जेमी बार्टो, स्टीफनी फॉक्स, कोडी जॉर्डिंग, स्टेसी शिमेक, हीथर किसेल और अली ज़ैदी को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA ThermoFisher Scientific 02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades ThermoFisher Scientific 50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps ThermoFisher Scientific 16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium ThermoFisher Scientific NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound ThermoFisher Scientific 50-363-579
Leica CM1950 Cryostat Leica Biosystems 14047743909
Frosted Microscope Slides ThermoFisher Scientific 12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit ThermoFisher Scientific 99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes ThermoFisher Scientific 03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab  ThermoFisher Scientific NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer ThermoFisher Scientific 50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer ThermoFisher Scientific 12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle ThermoFisher Scientific 121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific 13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140148
Gibco 1 M Hepes ThermoFisher Scientific 15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent ThermoFisher Scientific 1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 Abnova MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody Abnova ABX-144A
Anti MUC-1 antibody Santa Cruz Biotech sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246) Abcam Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin Molecular Probes  A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Molecular Probes  P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera Zeiss 4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera Olympus IX511F3

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References

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Belden, S. E., Uppalapati, C. K.,… More

Belden, S. E., Uppalapati, C. K., Pascual, A. S., Montgomery, M. R., Leyva, K. J., Hull, E. E., Averitte, R. L. Establishment of a Clinic-based Biorepository. J. Vis. Exp. (123), e55583, doi:10.3791/55583 (2017).

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