Summary
I tumori cutanei vengono spesso scartati dopo la chirurgia microscopica di Mohs. Qui viene descritto un protocollo che consente al personale di supporto clinico di elaborare e memorizzare in modo efficace campioni tumorali cutanei ( ad esempio, carcinoma delle cellule squamose, carcinoma delle cellule basali e melanoma) per applicazioni di laboratorio a valle senza interferire con le operazioni cliniche.
Abstract
L'incidenza del cancro della pelle ( es., Carcinoma delle cellule squamose , carcinoma delle cellule basali e melanoma) è in aumento negli ultimi anni. Si prevede che ci sarà una domanda parallela per campioni tumorali cutanei per studi di ricerca biomedica. La disponibilità dei tessuti, tuttavia, è limitata a causa del costo della creazione di un bioreposito e della mancanza di protocolli disponibili per ottenere campioni clinici che non interferiscono con le operazioni cliniche. È stato stabilito un protocollo per raccogliere e elaborare campioni tumorali cutanei e associati di sangue e saliva che hanno un impatto minimo sulle procedure cliniche di routine alla data di una chirurgia Mohs. I campioni tumorali vengono raccolti e trattati da pazienti sottoposti al primo strato di chirurgia Mohs per tumori maligni cutanei provenienti da biopsia da parte del histotechnologista Mohs. Il tessuto normale adiacente viene raccolto all'atto della chiusura chirurgica. Ulteriori campioni che possono essere raccolti sono sangue intero e tampone buccale. Utilizzando campioni di tessuti normalmente scartati, è stato generato un bioreposito che offre diversi vantaggi fondamentali basandosi sulla clinica rispetto all'ambiente di laboratorio. Questi includono una vasta gamma di campioni raccolti; L'accesso ai dischi identificati, inclusi i rapporti patologici; E, per il tipico donatore, l'accesso a campioni aggiuntivi durante le visite di follow-up.
Introduction
La ricerca sul cancro e sul biomarker si basa su una fornitura di campioni di tessuti umani di qualità e l'offerta limitata ha ostacolato la ricerca 1 , 2 . Molti studi dermatologici sono limitati dall'inadeguata offerta, qualità variabile e costi associati all'uso del tessuto umano. Il costo della creazione di una grande banca bio-dedicata è stato stimato di circa due milioni di dollari3 e questi costi collocano l'uso del tessuto umano fuori dalla portata di molti ricercatori. Inoltre, il processo di generazione e conservazione di campioni di ricerca pone il rischio di influenzare le operazioni cliniche e di ritardare la cura del paziente se non eseguita con attenzione. È stato stabilito un bioreposito a basso costo basato su una clinica che si concentra sui campioni di cancro della pelle seguendo le migliori pratiche raccomandate e la convalida dei campioni 4 , 5 , 6 .
L'obiettivo della tecnica di chirurgia microscopica di Mohs è assicurare che tutti i tessuti del cancro siano rimossi mantenendo il più possibile il tessuto sano possibile. La procedura prevede la progressiva rimozione di strati sottili di tessuto tumorale. Ogni livello successivo è il suoEsaminato tologicamente (dopo la criocuzione del tessuto tumorale e la colorazione H & E) da un dermatologo per determinare se è stato rimosso tutto il tessuto tumorale. L'esclusione e l'esame di strati successivi di tessuti vengono eseguiti mentre il paziente rimane nell'ufficio. Questa tecnica è considerata la migliore opzione di trattamento per SCC 9 . A questo punto, la ferita è chiusa e, per migliorare la guarigione e l'aspetto estetico, il tessuto normale adiacente (ANT) viene spesso eliminato. Così, questa procedura chirurgica per rimuovere un tumore è ideale per raccogliere tessuto istologicamente caratterizzato per studi futuri.
La procedura di aggiudicazione dell'appalto per ottenere il tessuto tumorale, i tessuti normali adiacenti, la saliva e i campioni di sangue è stata progettata per avere un impatto minimo sui compiti normali del personale ( Figura 1 ). Gli assistenti medici eseguono il sangue durante la preparazione del paziente per la procedura. Dopo la conclusione della procedura Mohs, la M Lo histotechnologo di OHS prepara ulteriori diapositive istologiche del campione e trasferisce il tessuto al bioreposito. I costi associati alla creazione del bioreposito includono l'acquisto di congelatori di crioconservazione, la creazione di un modesto spazio di laboratorio clinico e lo sviluppo di un programma di monitoraggio delle scorte.
Figura 1: sequenza di raccolta dei campioni e personale responsabile. All'atto del check-in del paziente e del raggiungimento del consenso del paziente, l'assistente medico raccoglie un tampone bucale e svolge un prelievo di sangue. Il dermatologo e l'assistente medico poi accise il tumore e chiude la ferita, durante il quale vengono raccolti rispettivamente gli esemplari SCC e ANT. Un tecnico specializzato di laboratorio elabora il sangue e le sezioni dei campioni SCC e ANT per la coltura, la conservazione e l'ingresso nel bioreposito.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La diversità dei campioni raccolti consente una varietà di approcci sperimentali ( Figura 2 ). I campioni raccolti dal paziente sono tamponi bucali (saliva può anche essere raccolta se necessario), sangue intero e tessuto esclasti. I tamponi bucali e un campione di tutto il sangue vengono salvati, senza elaborazione, per la genotipizzazione e il matching dei tessuti. Il sangue intero è separato in cellule del sangue bianco (WBC) e frazioni plasmatiche per analisi future. Dopo la trasformazione di Mohs, il tumore congelato viene posto direttamente in azoto liquido e trasferito a un congelatore -80 ° C. I campioni tumorali freschi, vitali e ANT vengono coltivati utilizzando modifiche delle tecniche precedenti 10 , 11 e poi criopreservate. Durante la raccolta, il numero di ciascun tipo di esempio viene registrato su un foglio di calcolo prima di entrare Il programma di monitoraggio dell'inventario per facilitare l'elaborazione accurata ( tabella 1 ).
Figura 2: Struttura della raccolta e dell'elaborazione dei campioni biorepositivi basati su clinica. Un tampone e un campione di sangue buccale vengono raccolti dal paziente e memorizzati per il genotipizzazione a valle e la corrispondenza dei tessuti. Il sangue intero viene ulteriormente elaborato per l'isolamento delle cellule del sangue bianco (WBC) e l'analisi CTC, nonché per la raccolta del plasma e l'analisi biopsia liquida. Il tessuto prelevato durante la procedura Mohs è trattato istologicamente per scopi diagnostici, dopo di che le diapositive istologiche possono essere utilizzate sperimentalmente per ulteriori analisi immunohistochemiche. A condizione che il campione di tessuto ecceduto sia abbastanza grande, una porzione di tessuto fresco viene rimossa e tagliata per isolamento proteico e RNA e per la creazione di linee cellulari colte.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Data di raccolta: | |||||
| Paziente 1 | Paziente 2 | Paziente 3 | Paziente 4 | Paziente 5 | |
| Iniziali e data di nascita | |||||
| Colore degli occhi | |||||
| Tipo di esempio | |||||
| Posizione campione | |||||
| Saliva | |||||
| WBuco sangue | |||||
| Plasma | |||||
| Tumore Viable | |||||
| Tessuto Normale Resistente | |||||
| Tumore Mohs Liquido Azoto | |||||
| Tessuto normale azoto liquido | |||||
| Slides |
Tabella 1: Lista di controllo per registrare le collezioni di campioni. I dati tracciati e registrati con ciascun campione raccolto comprendono le iniziali del paziente, la data di nascita e il colore degli occhi (per la tipizzazione della pelle), nonché i locatiSulla rimozione del campione. Il numero di campioni salivari, i volumi di raccolta del sangue e il numero di esemplari di tessuti vitali e conservati sono registrati anche come riferimenti per le allocazioni agli usi successivi. Clicca qui per scaricare questo file.
Per convalidare le procedure di raccolta dei campioni, ciascun tipo di esempio è stato testato nelle applicazioni a valle. Utilizzando modifiche delle tecniche precedenti 12 , il tumore e ANT sono stati utilizzati con successo nell'isolamento di proteine e RNA e possono essere utilizzati potenzialmente per l'isolamento del DNA. Le esplosioni vitali stabilite dalle sezioni del tessuto sono state valutate mediante microscopia, mentre le diapositive istologiche memorizzate sono state utilizzate per immunohistochemistry e immunofluorescenza.
Seguendo il protocollo qui descritto, è possibile estendere questo modello ad altre cliniche di dermatologia, altri tipi di tumore (come il melanoma), E altre specialità e pratiche chirurgiche per fornire campioni di tessuti umani per una ricerca multidimensionale nei tumori umani. Le modifiche leggere di questo protocollo sono probabilmente necessarie per altre pratiche, ma in linea di principio questo protocollo è applicabile a qualsiasi pratica chirurgica che scarta frequentemente i campioni dei pazienti raccolti durante il trattamento del paziente.
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Protocol
Tutta la sperimentazione sui campioni di tessuto umano è stata approvata da Western IRB (Protocollo WIRB # 20142461). Il singolo criterio per la raccolta dei tessuti per queste procedure è una diagnosi bioscopica di SCC. Nessun criterio di esclusione è stato descritto nel protocollo originale IRB, ma non sono stati utilizzati campioni di pazienti con una nota patologia trasmessa dal sangue. Il consenso informato è stato ottenuto prima della raccolta del tessuto cutaneo, del sangue e della saliva. La commissione di revisione istituzionale del Midwest ha approvato il lavoro di convalida con campioni biorepositivi basati su cliniche presso la Midwestern University (AZ # 807).
1. Trattamento cutaneo del tessuto tumorale
NOTA: Questo deve essere eseguito da un histotechnologist di Mohs.
- Elaborazione del tessuto carcinoma squamoso fresco (SCC) per RNA e cultura esplosiva
- Dopo che il tessuto è stato tagliato dal chirurgo Mohs, raccogliere da 10 a 50 mg (≥10 mm 3 NOTA: Questo è possibile solo se il tumore è abbastanza grande per consentire la rimozione di un campione di 10-50 mg (≥10 mm 2 ) prima della valutazione istologica che fa parte della procedura Mohs. Se il tumore non è abbastanza grande per consentire la rimozione di un minimo di 2 mm 3 , non procedere con l'elaborazione per l'RNA (saltare la fase 5).
- Trasferire il tessuto vitale a un tubo da 1,5 ml contenente un mezzo di coltura (miscela 1: 1 di DMEM: Ham's F-12, 25 mM HEPES, 100 UI / ml di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) utilizzando le pinzette e assicurare che il Il tessuto è completamente immerso nel mezzo. Conservare questo tubo a 4 ° C prima di procedere con ulteriore lavorazione.
- Utilizzare il tessuto per l'analisi dell'isolamento e dell'espressione di RNA (vedere la fase 5) e / o lo stabilimentoDi una cultura esplante (vedere la fase 6) entro 24 h.
- Posizionare il resto del campione tumorale che è stato rimosso dal paziente (punto 1.1.1) su un supporto di tessuto criostato (o "mandrino"). Incorporare il tessuto in un composto ottimale di taglio (OCT), congelando il tessuto all'interno del supporto, per consentire il completamento dell'istologia Mohs e per la preparazione di diapositive istologiche aggiuntive per l'analisi sperimentale.
- Preparazione di diapositive istologiche
- Tagliare sezioni di tessuto 7 μm utilizzando un criostato e creare due (o più) diapositive per ogni campione tumorale. Assicurarsi che ciascuna diapositiva contiene fino a tre sezioni del tumore completo.
NOTA: Una delle due diapositive sarà macchiata usando H & E dal histotechnologist di Mohs e le slide aggiuntive possono essere elaborate con l'analisi IF, IHC o FISH. - Mettere le diapositive in acetone per 1-2 secondi per fissare il tessuto. Impostare queste diapositive a parte per asciugare. Non H & EMacchia o copertura del vetrino da utilizzare per la futura immunofluorescenza (IF), l'immunohistochemistry (IHC) o l'analisi di ibridazione in fluorescenza in situ (FISH), a seconda del protocollo sperimentale.
- Tagliare sezioni di tessuto 7 μm utilizzando un criostato e creare due (o più) diapositive per ogni campione tumorale. Assicurarsi che ciascuna diapositiva contiene fino a tre sezioni del tumore completo.
- Elaborazione del Tessuto Post-Mohs
- Una volta completata l'elaborazione di Mohs (passaggi 1.1-1.2), lavorare nella camera di criosta e prelevare il campione dal supporto di crioconservazione e collocare il tessuto in un tubo criogenico etichettato.
- Mettere la fiala etichettata in azoto liquido prima che il tessuto abbia scongelato. Se i campioni devono essere utilizzati per l'analisi di proteine e / o DNA, possono essere trasferiti in un azoto liquido oa un congelatore -80 ° C in pochi minuti per essere conservati per un'espressione di proteine future e l'analisi del mutamento del DNA (vedere i passaggi 4-5) .
NOTA: Se si desidera un intatto RNA dal campione post-Mohs, è fondamentale mantenere il campione congelato durante la rimozione dal mezzo di incorporazione dei criomocchi. Se la cura estrema non viene esercitataQuesto passo, il campione post-Mohs dovrebbe essere riservato per analisi proteica e / o DNA.
- Lavorazione di ANT fresco
- Al momento della chiusura Mohs, ottenere ANT dal chirurgo Mohs.
- Rimuovere una quantità uguale o maggiore di ANT come raccolta dal campione SCC (vedi sopra) dal lato apicale del tessuto normale e trasferirla in un tubo da 1,5 mL etichettato contenente un mezzo di coltura (miscela 1: 1 di DMEM: Ham's F- 12 integrati con 25 mM HEPES, 100 UI / mL di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) utilizzando pinzette.
- Immergere completamente il tessuto nel medesimo mezzo di coltura e conservare a 4 ° C fino alla successiva lavorazione (vedere punti 4-6).
2. Sangue, saliva e processo di tampone buccale
- Ottieni circa 10 ml di sangue nei tubi di raccolta EDTA tramite venipunzione.
- Trasferire il sangue dai tubi di raccolta a un tubo sterile da centrifuga da 15 o 50 ml. Rimuovere circa 200 μl in un tubo criogenico da 1,5 ml, evitando le bolle; Conservare questo campione di sangue intero a -80 ° C, per essere utilizzato per future genotipizzazione e corrispondenza tissutale, se necessario.
- Spin il sangue rimanente a 1.000 xg per 30 minuti e seguire le procedure standard per raccogliere la frazione plasmatica.
- Aliquota il plasma in incrementi di 1 ml in tubi criogenici da 1,5 ml e conservare a -80 ° C per l'uso durante le future analisi bioptiche liquide.
- Utilizzare un tampone sterile per ottenere un campione di tampone buccale e memorizzare il tampone in un tubo sterile a temperatura ambiente.
- Se necessario, ottenere un campione di saliva e conservare in un tubo sterile a temperatura ambiente.
NOTA: Questi campioni possono essere usati per future genotipizzazioni e corrispondenza dei tessuti, se necessario.
3. Registrazione di campioni
- Trasferire informazioni dalla lista di controllo dei campioni dei pazienti al database biorepositivo. Includi informazioni sui pazienti e diagNosi dal grafico del paziente.
- Stampare le etichette con un codice a barre per ciascun campione e registrare ciascuno nel database per collegare ogni campione raccolto con i dati del paziente.
- Registrare la distribuzione dei campioni de-identificati nel database biorepositivo prima di trasferire i campioni al laboratorio di ricerca.
4. Isolamento della proteina e analisi del blot occidentale
- Posizionare ogni campione di tessuto (SCC e / o ANT) in un flaconcino contenente 500 μl di tampone di lisi cellulare contenente inibitori della proteasi per 100 mg di tessuto per lezzare il tessuto.
NOTA: Abbiamo utilizzato un tampone per la radioimmunoprecipitazione (RIPA), composto da 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% sodio deossolfato, 1,0% NP-40 e 0,1% SDS. Possono essere utilizzati altri tamponi di lisi cellulare. - Homogenizzare i tessuti utilizzando un omogeneizzatore tissutale per 5 minuti in intervalli di 20 a 4 ° C. Spin i campioni a 21.000 xg e 4 ° C per 20 minuti e raccogliere il supernatante contenente la proteina in un tu frescoessere. Riaccendere il surnatante utilizzando le stesse condizioni e raccogliere il supernatante finale in un tubo fresco.
- Elettroforesi 30-50 μg di proteine da ciascun campione utilizzando un gel gradiente SDS-poliacrilammide 4-20%. Macellare il gel con Coomassie Blue per visualizzare le bande di proteine, se lo si desidera.
- Se è necessaria un'analisi Western blot di proteine espresse, trasferire le proteine dal gel in una membrana di PVVF (PVVF) polivinilidene secondo protocolli standard. Dopo il trasferimento, Ponceau macchia la membrana PVDF per visualizzare bande di proteine, se lo si desidera.
- Bloccare la membrana e la sonda PVDF per rilevare le proteine di interesse seguendo protocolli standard. Usa gli anticorpi primari specifici per le proteine interessate, insieme agli anticorpi secondari corrispondenti specifici per gli anticorpi primari, a concentrazioni raccomandate dal produttore per l'analisi di blot western.
- Esporre la membrana esplorata usando un substrato chemiluminescente e rappresentare la membrana utilizzando un'immagineNg sistema.
5. Isolamento di RNA e reazione a catena quantitativa di polimerasi (qPCR)
- Immediatamente inserire campioni di tessuti freschi (SCC e / o ANT) in un tubo da 1,5 mL contenente una soluzione di stabilizzazione dell'RNA e inserire campioni di tessuto post-Mohs in un tubo da 1,5 ml contenente una soluzione di transizione tissutale congelata, seguendo le raccomandazioni del produttore. Assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso. Conservare questi campioni a -80 ° C fino all'uso.
- Rimuovere i campioni RNA da -80 ° C e scongelare sul ghiaccio. Trasferire il tessuto a un nuovo tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di tampone di estrazione RNA (fenolo / guanidino tiocianato) per 50-100 mg di tessuto.
- Lyse i tessuti utilizzando un omogeneizzatore tissutale. Eseguire sei cicli di omogeneizzazione, seguiti da un periodo di raffreddamento del campione; Ogni ciclo è costituito da 20 s di omogeneizzazione a 4 ° C e un periodo di raffreddamento a 40 s. Dopo l'omogeneizzazione, incubare il campione per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 0,2Ml di cloroformio per 1 ml di tampone di estrazione RNA e agitare vigorosamente il tubo a mano per 15 s. Incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente.
- Spin i campioni a 12.000 xg e 4 ° C per 15 minuti. Rimuovere la fase acquosa del campione e collocarla in un nuovo tubo da 1,5 ml.
- Aggiungere 0,5 mL di isopropanolo al 100% per 1 mL del tampone di estrazione RNA utilizzato nella fase 5.2 alla fase acquosa e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Se si prevede che i rendimenti RNA siano bassi ( cioè il volume del tessuto iniziale è inferiore a 10 mg), i campioni possono essere precipitati per una notte a -80 ° C. Inoltre, 5 μg di glicogeno privo di RNasi per 500 μL di tampone di estrazione RNA può essere aggiunto durante la fase di precipitazione isopropanolo per migliorare i rendimenti di RNA. - Spin il campione a 12.000 xg a 4 ° C per 10 min. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%.
- Vorticala brevemente il campione e poi giri a 7.500 xg e 4 °C per 5 min. Scartare il lavaggio e asciugare il pellet per 5-10 min.
- Resuspendere il pellet RNA in 20 μl di acqua priva di RNasi.
- Se si desidera, purificare ogni campione di RNA utilizzando un kit di pulizia RNA in base alle raccomandazioni del produttore.
NOTA: I piccoli RNA verranno persi dal campione se viene eseguito questo passaggio.
- Se si desidera, purificare ogni campione di RNA utilizzando un kit di pulizia RNA in base alle raccomandazioni del produttore.
- Elettroforesi un campione da 1 μg usando un gel agarosio di formaldeide-MOPS 1,2% per analizzare la qualità dell'RNA.
NOTA: in alternativa, analizzare i campioni utilizzando un bioanalizzatore per ottenere un numero RIN 13 . - Reverse-trascrono l'RNA a cDNA utilizzando un protocollo di trascrizione inversa per l'analisi qPCR di mRNA target (o miRNA) di interesse.
6. Culture intellettuali
- Sterilizzare il tessuto esclizzato prima della cultura immergendo il tessuto in etanolo del 70%.
- Posizionare il tessuto su uno scivolo o piatto e aggiungere abbastanza mezzo di coltura (miscela 1: 1 di DMEM: Ham & #39; s F-12 integrato con 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 UI / mL di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) per coprire il tessuto (per evitare che il tessuto venisse seccato). Tagliare con cautela il tessuto in frammenti (<1 mm 3 ) usando una lama del bisturi.
- Trasferire i frammenti di tessuto a un piatto da 35 mm di coltura tissutale e aggiungere circa 20 μL di siero fetale fetale (FBS) sopra ogni frammento.
- Lasciare il piatto aperto in una cappa di cultura per 20-30 minuti, o fino a quasi asciutto.
- Aggiungere a ciascun piatto 1 ml di campione di coltura (1: 1 di DMEM: Ham's F-12 con 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 UI / mL di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 . Se necessario, subcultura o sub-clona le culture.
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Representative Results
Tumore e ANT sono stati utilizzati con successo in isolamento proteico e testati da blotting occidentale. Come mostrato nella figura 3 , i marker di carcinoma cutanee squamose cutanee (Muc1 14 , FHL-1 15 e p40 16,17 ) possono essere rilevati nei campioni dei pazienti raccolti e conservati nel nostro bioreposito in base alla clinica.
Figura 3: Analisi delle proteine estratte da ANT e SCC. La proteina totale è stata isolata da campioni ANT e SCC e l'espressione di marcatori conosciuti per SCC è stata esaminata mediante Western blot. Sono mostrate le macchie occidentali occidentali di mucina 1 (MUC1), fattore H Like-1 (FHL-1) e p40 (pannello B). richiestaSe clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'RNA isolato utilizzando le tecniche di cui sopra è stato testato mediante elettroforesi a gel, analisi di integrità qPCR e RNA. La figura 4 mostra due campioni di pazienti da cui è stato isolato l'RNA di alta qualità e intatto. L'RNA è adatto a tutte le applicazioni a valle.
Figura 4: Analisi dell'integrità di RNA mediante bioanalisi. Valutazione della dimensione e dell'integrità dell'RNA mediante elettroforesi a gel (pannello A). Un numero di integrità RNA (RIN) è stato generato per ogni campione in base alla traccia elettroforetica del campione RNA, compreso il rapporto RNA ribosomale e la presenza o l'assenza di prodotti di degradazione (pannello B). Un RIN di "10" rappresenta un campione di RNA perfetto, senza alcun prodotto di degradazione, mentre "1" segna un sample. I profili della densitometria delle fasce vengono tracciati come unità di fluorescenza (FU) contro nucleotidi (nt) (pannello C) per i campioni rappresentativi di RNA provenienti da tessuti del paziente SCC e ANT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Esplosivi vitali stabiliti dalle sezioni del tessuto sono state valutate mediante microscopia ( Figura 5A ). Queste colture esplanti, generate da campioni tumorali e ANT, sono colture miste di cheratinociti e fibroblasti. Queste culture possono essere subculturate o utilizzate per lo sviluppo futuro della linea cellulare. I vetrini istologici conservati sono stati utilizzati per immunohistochemistry e immunofluorescence. Mostrato nella figura 5B , un campione SCC mostra una colorazione positiva per un marcatore di transizione epiteliale-mesenchimale in SCC 18 .
Figura 5: Cultura esplosiva e colorazione IF delle sezioni SCC. Immagine di contrasto di fase di un esplante di tessuto carcinoma squamoso di cellule (pannello A, barra di scala = 50 μm) e sezioni di tessuto raccolte come parte della chirurgia microscopica Mohs, colorate con un anticorpo primario anti-pSnail / Slug (pannello B, barra di scala = 25 μm ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Abbiamo determinato sperimentalmente che il tessuto può essere conservato a 4 ° C per 24-48 h prima dell'isolamento di RNA (fase 5) o della coltura dell'esplante (fase 6) senza influenzare i risultati. La resa o l'integrità del RNA, valutata mediante elettroforesi a gel o bioanalizzatore e numero RIN, non sono compromessi. Inoltre, colture esplosive sono facilmente ottenute usando tessuti conservati a 4 ° C per questoS di durata. Ciò garantisce una maggiore flessibilità durante il trasferimento di campioni tra la clinica e il laboratorio di ricerca. Poiché l'isolamento di RNA e la cultura dell'esplante vengono eseguiti nel laboratorio di ricerca e non nella clinica, questa caratteristica rende il bioreposito a base clinica un modello più robusto di quanto previsto in precedenza.
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Discussion
Alla conoscenza dell'autore, questo protocollo è il primo del suo genere che si concentra sull'approvazione clinica di campioni di tessuto cutaneo in un approccio economico e veloce. I pazienti sottoposti a microchirurgia di Mohs sono in genere pianificati durante specifici blocchi di tempo e la raccolta è limitata a questi periodi. La raccolta di campioni comporta l'impegno dell'assistente medico coinvolto nella cura del paziente, del histotechnolog Mohs che elabora i campioni tumorali e un membro del personale di laboratorio designato che gestisce l'ingresso del campione e l'elaborazione del sangue.
Con un attento coordinamento tra i tre membri del gruppo di raccolta ( cioè l'assistente medico , il tecnico di istruzione e di laboratorio di Mohs) e il tecnico di laboratorio, abbiamo scoperto che l'attuale assistente medico può completare i compiti addizionali associati alla raccolta di 3-5 campioni di tessuti Al giorno senza alcun ritardo apparente nelle operazioni cliniche. Ottenere il consenso del paziente E la raccolta di tamponi e sangue bucali vengono completati durante i normali periodi di attesa con la procedura di microchirurgia Mohs. Oltre al processo decisionale su come un campione deve essere elaborato, i compiti per i quali è responsabile il histotechnolog Mohs vengono completati alla fine del trattamento dei campioni dei pazienti Mohs e tipicamente aggiungeranno circa 30 minuti al programma giornaliero. In genere, un membro del personale clinico è responsabile dell'etichettatura e dell'elaborazione dei campioni di sangue e per effettuare qualsiasi trasferimento e l'immissione di campioni nel database. A seconda del numero di campioni trattati, questi dazi possono richiedere tempo sostanziale dai dazi esistenti; Quindi, la raccolta dei campioni dovrebbe essere eseguita solo quando è disponibile un personale sufficiente di laboratorio. In particolare, se vengono raccolti più di 5 campioni in un solo giorno o se vengono raccolti diversi campioni di sangue dai pazienti, sono necessarie diverse ore di sforzo supplementare dal tecnico di laboratorio.
Jove_content "> Nei giorni di raccolta, gli assistenti medici (MA) ricevono il consenso dei pazienti per donazioni di tessuti. L'MA ottiene poi un tampone bucale (e saliva, se necessario) e raccoglie il sangue per l'elaborazione da parte del personale di laboratorio. Il coinvolgimento del paziente dopo la raccolta di questi campioni, quindi dalla prospettiva del paziente il resto della visita clinica è invariato (anche se viene richiesto di donare il sangue durante una visita di follow-up) Attualmente possiamo stimare che il 70% dei pazienti Per donare i tessuti, con il ~ 30% di questi pazienti anche donando il sangue, il 30% di declino di partecipare Attualmente, solo i pazienti con una biopsia-provata diagnosi di cancro sono inclusi nel bioreposito.Patienti con una nota malattia trasmissibile dal sangue sono esclusi .L'agente del laboratorio è responsabile del coordinamento con gli altri due membri del gruppo di raccolta e registra i campioni raccolti (tabella 1). Dopo unN la raccolta iniziale del campione, il modulo di consenso completo, il sangue e gli tamponi bucali vengono trasferiti all'organico del laboratorio e vengono registrate le iniziali del donatore, il data di nascita e altre informazioni pertinenti, come il tipo di esempio. Ciò consente la registrazione dei numeri e dei tipi di campioni raccolti con ciascun paziente durante la procedura di raccolta. I diagrammi di flusso che riassumono l'elaborazione del tessuto SCC ( Figura 6 ) e ANT (Figura 7) sono strumenti utili per la formazione del nuovo personale nelle procedure di raccolta.
Figura 6: Diagramma di flusso che delinea la lavorazione dei campioni SCC. Al momento dell'escissione tumorale, viene valutata la dimensione del campione. Se il campione è ≤2 mm3, l'intero campione viene utilizzato per la lavorazione Mohs, in quanto la valutazione dei margini puliti (l'indicazioneDella rimozione tumorale completa) è la priorità assoluta. Dopo l'elaborazione di Mohs, qualsiasi tessuto residuo viene congelato in azoto liquido e trasferito nel bioreposito. Se il campione è abbastanza grande, in modo tale che una porzione di tessuto superiore a 2 mm3 possa essere rimossa, questa parte viene raccolta e collocata in un tubo contenente un mezzo di coltura cellulare, mentre la restante parte viene utilizzata per la lavorazione di Mohs e memorizzata come sopra. La porzione del campione prelevata nel mezzo di coltura cellulare viene ulteriormente segmentata, con un frammento di ~ 0,5 mm3 rimosso e utilizzato per la creazione di una linea di coltura cellulare; Il restante frammento di tessuto viene trasferito nel bioreposito per l'analisi a valle di proteine e espressione genica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 7: Diagramma di flusso che delinea la lavorazione di campioni ANT. Al momento della chiusura di Mohs, una parte del tessuto normale adiacente (ANT) viene rimossa e raccolta dal chirurgo Mohs. Se la dimensione del campione è ≤2 mm3, l'intero campione viene posizionato in un tubo criogenico e congelato in azoto liquido prima del trasferimento al bioreposito. Se il campione è> 2 mm3, l'intero campione viene prima collocato in un tubo contenente un mezzo di coltura cellulare. Il campione viene ulteriormente tagliato in un frammento di ~ 0,5 mm3, da utilizzare per la creazione di linee di coltura cellulare. La restante sezione del tessuto viene trasferita al bioreposito da memorizzare per l'analisi a valle di proteine e espressione genica.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Questo protocollo è stato progettato per minimizzare la variazione tra i campioni all'interno del bioreposito. Coordinamento e comunicazione efficace tra il personale clinico e tra la clinica e tutto il personale di laboratorio è essenziale per minimizzare la variabilità e per massimizzare il raggiungimento di DNA, RNA e proteine di alta qualità dai tessuti. Mentre il DNA e la proteina all'interno dei tessuti sono robusti, se si desidera l'RNA, è fondamentale mantenere i tessuti freddi e nel mezzo appropriato durante la raccolta, il trasporto e l'elaborazione al fine di mantenere l'integrità del RNA. La registrazione accurata è inoltre fondamentale per collegare i campioni dei pazienti con la loro storia e la loro diagnosi, in quanto queste informazioni sono spesso necessarie quando si analizzano i risultati delle applicazioni a valle.
Con l'interesse crescente di medicina personalizzata e bioRicerca di marcatori, sono stati recentemente istituiti diversi bioresistemi. Questi sono tipicamente associati alle cliniche ospedaliere in grandi centri accademici e presentano costi sostanziali con l'installazione e l'esercizio 2 , 8 , 19 . Lo sviluppo di un bioreposito a base clinica per campioni di cancro cutaneo generato come parte della pratica quotidiana ha diversi vantaggi fondamentali rispetto ad altri bioresistenti. Innanzitutto, con una singola raccolta e un sito di elaborazione dei campioni, le variazioni nella gestione dei campioni, che possono compromettere le applicazioni a valle, vengono minimizzate. In secondo luogo, poiché questi campioni donati sono stati prelevati da una popolazione stabile del paziente, l'accesso a dati medici non identificati e ai dati sui risultati del paziente sono ineguagliabili. Questi dati possono essere anonimi e trasferiti dal grafico del paziente al database bioreposito al momento della raccolta di campioni o in una visita di follow-up. In terzo luogo, con una base fedele del paziente, il clIl bioreposito a base iniziale è in grado di raccogliere più campioni dallo stesso paziente, un insieme di campioni spesso non ottenuti in altre impostazioni. Una delle limitazioni di questo protocollo è che è stata ottimizzata per i campioni cutanei ottenuti tramite la chirurgia microscopica di Mohs e potrebbe essere necessario modificare per altri tipi di tessuti o procedure cliniche.
Nel complesso, uno degli obiettivi chiave del bioreposito è quello di fornire un ampio spettro di campioni dello stesso donatore per consentire ai ricercatori di fare una vasta gamma di domande, in particolare per lo sviluppo di biopsie liquide e marker di cancro. In particolare, la capacità di correlare l'istologia tumorale e l'espressione dei biomarkers ai livelli mRNA e proteine ai campioni di plasma, nonché la capacità di riferimento dei dati di esito del paziente, crea un set di dati univoco. Speriamo che il modello biorepositivo basato su una clinica possa essere utilizzato per aiutare a alleviare la carenza di campioni di pazienti nella ricerca biomedica.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi del Midwestern University College of Health Sciences per la Facilitazione della Ricerca, concesso a EEH e all'Ufficio Midwestern Office of Research e ai Programmi Sponsorizzati Intramural Grant, assegnato a KJL. Ulteriori sostegno è stato fornito da Affiliated Laboratories e Dermatologia Affiliated. Ringraziamo Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel e Ali Zaidi per la loro assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA | ThermoFisher Scientific | 02-685-2B | |
| Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades | ThermoFisher Scientific | 50-949-411 | |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | ThermoFisher Scientific | 16-100-110 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-138 | |
| Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium | ThermoFisher Scientific | NC9791321 | |
| Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound | ThermoFisher Scientific | 50-363-579 | |
| Leica CM1950 Cryostat | Leica Biosystems | 14047743909 | |
| Frosted Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-343 | |
| Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 99-900-01 | |
| Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes | ThermoFisher Scientific | 03-337-7X | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| Boca Scientific BuccalT-Swab | ThermoFisher Scientific | NC9679349 | |
| Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer | ThermoFisher Scientific | 50-195-822 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | PI78443 | |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 05-401-203 | |
| Pellet Morter Cordless Homogenizer | ThermoFisher Scientific | 12-141-3 | |
| RNAse Free Pellet Pestle | ThermoFisher Scientific | 121-141-364 | |
| Forma SteriCycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 13-998-089 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | SH30071.02 | |
| Gibco Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12-634-028 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140148 | |
| Gibco 1 M Hepes | ThermoFisher Scientific | 15-630-130 | |
| Nunc Cell Culture 35 mm with Vent | ThermoFisher Scientific | 1256591 | |
| Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 | Abnova | MAB12583 | |
| Anti-p40 (p63 delta) antibody | Abnova | ABX-144A | |
| Anti MUC-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-7313 | |
| Anti-Snail + Slug (phospho S246) | Abcam | Ab63568 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 568 Phallodin | Molecular Probes | A12380 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P36941 | |
| Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera | Zeiss | 4300009901 | |
| Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera | Olympus | IX511F3 |
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