Summary
皮膚腫瘍は、しばしば、モース顕微鏡手術後に捨てられる。臨床支援スタッフが、臨床操作を妨害することなく、下流の実験室用途のための皮膚腫瘍（ 例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、および黒色腫）試料を効果的に処理および保存することを可能にするプロトコールがここに記載される。
Abstract
皮膚癌（ 例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌および黒色腫）の発生率は、過去数年間にわたって増加している。生物医学研究研究のための皮膚腫瘍サンプルが並行して要求されることが期待される。しかしながら、組織の入手可能性は、バイオリポジトリを確立するコストと、臨床操作を妨害しない臨床サンプルを得るために利用可能なプロトコルがないために限定されている。モース外科手術の日にルーチンの臨床手順に最小限の影響を与える皮膚腫瘍および関連する血液および唾液サンプルを収集および処理するためのプロトコルが確立された。腫瘍試料は、モース組織工学者による生検で証明された皮膚悪性腫瘍のための第1層のモース手術を受けている患者から収集され、処理される。隣接する正常組織は、手術終了時に収集される。採取することができる追加のサンプルは、全血および口腔スワブ。通常は廃棄される組織サンプルを利用することにより、診療所と臨床検査室の設定に基づいていくつかの重要な利点を提供するバイオリポジトリが生成された。これらには、幅広い収集サンプルが含まれています。病理学的報告を含む、識別されていない患者記録へのアクセス;典型的なドナーの場合、フォローアップ訪問中の追加サンプルへのアクセス。
Introduction
がんやバイオマーカーの研究は質の高いヒトの組織サンプルの供給に依存しており、限られた供給は研究1,2を妨げている。多くの皮膚科学的研究は、供給不足、品質の変化、およびヒト組織の使用に関連するコストによって制限される。大規模な専用バイオバンクを構築するコストは約200万ドルと推定されており、これらのコストは人体組織の使用を多くの研究者の手の届かないところに置きます。さらに、研究サンプルを生成し保存するプロセスは、注意深く実行されなければ、臨床操作に影響を与え、患者のケアを遅らせるリスクをもたらす。推奨されるベストプラクティスとサンプルのバリデーション4,5,6に従って、皮膚癌サンプルに焦点を当てた費用効果の高いクリニックベースのバイオリポジトリが確立されました。
Mohs顕微鏡手術技術の目標は、可能な限り多くの健康な組織を保存しながら、すべての癌組織を確実に除去することです。この手順は、腫瘍組織の薄層の漸進的除去を含む。それぞれの連続する層は彼のものです皮膚科医によって（腫瘍組織を凍結切除し、H＆E染色を行った後に）論理的に検査して、すべての癌組織が除去されたかどうかを決定する。患者がオフィスに留まる間、組織の次の層の切除および検査が実行される。この手法は、SCC 9の最良の治療選択肢と考えられています。この時点で、創傷は閉鎖され、治癒および美容的外観を改善するために、隣接する正常組織（ANT）が頻繁に摘出される。したがって、腫瘍を除去するためのこの外科的処置は、将来の研究のために組織学的に特徴付けられた組織を収集するのに理想的に適している。
腫瘍組織、隣接する正常組織、唾液、および血液サンプルを取得するための調達手順は、通常の職務に最小限の影響を及ぼすように設計されています（ 図1 ）。医療アシスタントは、手順のために患者を準備しながら血液採取を行う。 Mohs手順の完了後、Mオハイオ組織学者は標本の追加の組織スライドを準備し、その組織をバイオリポジトリに移す。バイオリポジトリの確立に関連するコストには、凍結保存フリーザの購入、適度な臨床検査スペースの作成、および在庫追跡プログラムの開発が含まれる。
図1：サンプル収集と責任スタッフのシーケンス。患者のチェックインと患者の同意が得られると、医療アシスタントは頬の綿棒を採取して採血を行う。皮膚科医および医療補助員は、腫瘍を切除し、創傷を閉鎖し、その間SCCおよびANT標本をそれぞれ収集する。専用の実験技術者が血液を処理し、組織培養、保存、およびバイオリポジトリへの入室についてSCCおよびANT標本を区分する。ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
収集されたサンプルの多様性は、さまざまな実験的アプローチを可能にします（ 図2 ）。患者から採取した試料は、頬拭き（唾液も必要に応じて採取することができる）、全血、および切除組織である。口腔スワブおよび全血由来のサンプルは、遺伝子タイピングおよび組織適合のために、処理することなく保存される。将来の分析のために、全血を白血球（WBC）と血漿画分に分離する。モース処理後、凍結した腫瘍を液体窒素に直接入れ、-80℃の冷凍庫に移す。新鮮な生存可能な腫瘍組織およびANT試料を、以前の技術10,11の改変を用いて培養し、次いで凍結保存する。収集中、各サンプルタイプの数は、スプレッドシートに記録されてから正確な処理を容易にする在庫追跡プログラム（ 表1 ）。
図2：臨床医ベースのバイオリポジトリのサンプル収集と処理の概要。頬側スワブおよび血液サンプルを患者から採取し、下流の遺伝子型決定および組織適合のために保存する。全血は、白血球（WBC）単離およびCTC分析ならびに血漿採取および液体生検分析のためにさらに処理される。 Mohs手順中に切除された組織は、診断目的のために組織学的に処理され、その後、組織学的スライドはさらなる免疫組織化学的分析のために実験的に使用され得る。切除された組織試料が十分に大きい場合、新鮮な組織の一部を取り出し、タンパク質およびRNAの単離および培養細胞系の確立のために切片化する。55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| コレクション日： | |||||
| 患者1 | 患者2 | 患者3 | 患者4 | 患者5 | |
| 頭文字と誕生日 | |||||
| 目の色 | |||||
| サンプルタイプ | |||||
| サンプルの場所 | |||||
| 唾液 | |||||
| W穴の血 | |||||
| プラズマ | |||||
| 腫瘍の生存率 | |||||
| 組織正常Viable | |||||
| 腫瘍モース液体窒素 | |||||
| 組織正常液体窒素 | |||||
| スライド |
表1：サンプルコレクションを記録するチェックリスト収集された各サンプルと共に追跡され、記録されたデータには、患者のイニシャル、生年月日、および肌の色のための目の色、試験片除去のオン。唾液サンプル数、採血量、および採取した生存および保存された組織標本の数も、後の使用のための参考文献として記録される。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
サンプル収集手順を検証するために、各サンプルタイプはダウンストリームアプリケーションでテストされています。以前の技術12の改変を用いて、腫瘍およびANTはタンパク質およびRNA単離に首尾よく用いられ、DNA単離のために潜在的に使用され得る。組織切片から確立された生存外植片を顕微鏡検査し、保存された組織スライドを免疫組織化学および免疫蛍光のために使用した。
本明細書に記載されたプロトコールに従って、このモデルを他の皮膚科診療所、他の腫瘍型（メラノーマなど）にまで拡張することが可能であり、、およびヒト癌への多面的研究のためのヒト組織サンプルを提供するための他の外科的専門性および実践を含む。このプロトコルのわずかな変更は、他のプラクティスにとって必要である可能性が高いが、原則として、このプロトコルは、患者治療の過程で収集された患者サンプルを日常的に廃棄する任意の外科手術に適用可能である。
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Protocol
ヒト組織サンプルに関する全ての実験は、Western IRB（WIRB Protocol＃20142461）によって承認された。これらの処置のための組織収集の単一の基準は、生検で証明されたSCCの診断である。除外基準は元のIRBプロトコルで概説されていませんが、血液媒介性伝染性疾患の患者のサンプルは使用されませんでした。皮膚組織、血液、および唾液の採取に先立ち、インフォームドコンセントが得られた。 Midwestern Institutional Review Boardは、Midwestern University（AZ＃807）の診療所ベースのバイオリポジトリサンプルでの検証作業を承認しました。
1.皮膚腫瘍組織の処理
注：これは、モズの組織学者によって行われます。
- RNAおよび外植片培養のための新鮮な扁平上皮癌（SCC）組織の処理
- 組織をモース外科医が切除した後、10〜50mg（≧10mm 3 注：これは、腫瘍がMohs手術の一部である組織学的評価の前に10〜50mgのサイズの試料（10mm 2以上 ）を除去するのに十分な大きさである場合にのみ可能です。腫瘍の大きさが最小で2mm 3を除去するのに十分でない場合は、RNAの処理を続行しないでください（ステップ5をスキップしてください）。
- ピンセットを用いて、培養培地（DMEM：Ham's F-12,25mM HEPES、100IU / mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシンの1：1混合物）を含有する標識1.5mLチューブに生存可能な組織を移し、組織は完全に培地に浸される。このチューブを4℃で保存してから処理してください。
- 組織をRNA単離および発現解析（ステップ5を参照）および/または構築するために使用する24時間以内に外植培養（ステップ6参照）を行う。
- クライオスタットの組織ホルダー（または「チャック」）に、患者から取り出した腫瘍サンプルの残りの部分（ステップ1.1.1）を置きます。最適な切断温度（OCT）の化合物に組織を埋め込み、モース組織学の完成および実験分析のためのさらなる組織学的スライドの調製を可能にするために、ホルダー内の組織を凍結する。
- 組織学的スライドの調製
- クライオスタットを使用して7μmの厚さの組織切片を切断し、各腫瘍サンプルに対して2つ（またはそれ以上）のスライドを作成する。各スライドに完全腫瘍の3つのセクションが含まれていることを確認します。
注：2つのスライドのうちの1つは、Mohs histotechnologistによってH＆Eで染色され、追加のスライドはIF、IHC、またはFISH解析で処理されます。 - スライドを1〜2秒間アセトンに入れて組織を固定する。これらのスライドを乾燥させておく。 H＆Eをしないでください実験プロトコルに応じて、将来の免疫蛍光（IF）、免疫組織化学（IHC）、または蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）分析に使用するスライドを染色またはカバースリップする。
- クライオスタットを使用して7μmの厚さの組織切片を切断し、各腫瘍サンプルに対して2つ（またはそれ以上）のスライドを作成する。各スライドに完全腫瘍の3つのセクションが含まれていることを確認します。
- モホ組織の処理
- モースの処理が完了したら（ステップ1.1-1.2）、クライオスタットチャンバー内で作業し、クライオ包埋培地からサンプルを取り出し、標識された極低温チューブに組織を入れる。
- 組織が融解する前に、ラベルされたバイアルを液体窒素に入れます。サンプルをタンパク質および/またはDNA分析に使用する場合は、液体窒素または-80℃のフリーザーに数分以内で移して、将来のタンパク質発現およびDNA変異解析のために保存することができます（ステップ4-5を参照） 。
注：ポストモースサンプルからインタクトなRNAが望まれる場合は、クライオ包埋培地からの除去中にサンプルを凍結した状態に保つことが不可欠です。極端な注意が行使されない場合このステップでは、モース後サンプルは、タンパク質および/またはDNA分析のために予約する必要があります。
- 新しいANTの処理
- モースの閉鎖時に、モース外科医からANTを入手する。
- 正常組織の頂端側からSCCサンプル（上記参照）から採取したものと等しいかそれ以上の量のANTを除去し、それを培地（DMEM：Ham's F- 12に、25mM HEPES、100IU / mLのペニシリン、および100μg/ mLのストレプトマイシンを補充したもの）を使用した。
- 同じ培養液に組織を完全に浸し、その後の処理まで4℃で保存します（ステップ4-6参照）。
2.血液、唾液および口腔スワブ処理
- 約10mLの血液を静脈穿刺を介してEDTA採取チューブで採取する。
- 収集チューブから滅菌した15または50 mLの遠心チューブに血液を移します。気泡を避けて、約200μLを1.5mLの極低温管に移す。この全血サンプルを-80°Cで保存し、必要に応じて将来の遺伝子型同定および組織マッチングに使用します。
- 残りの血液を1000 xgで30分間遠心し、標準的な手順に従って血漿画分を集める。
- 分注した血漿を1.5 mLの低温チューブで1 mL刻みに分け、将来の液体生検分析で使用するために-80°Cで保存します。
- 口腔内スワブサンプルを得るために滅菌スワブを使用し、室温で滅菌チューブにスワブを保存する。
- 必要に応じて、唾液サンプルを入手し、室温で滅菌チューブに保存します。
注：これらのサンプルは、必要に応じて、将来の遺伝子型同定および組織マッチングに使用することができます。
3.サンプルの記録保管
- 情報を患者サンプルのチェックリストからバイオリポジトリデータベースに転送する。患者情報と診断情報を含める患者の表からの鼻。
- 各サンプルのバーコード付きラベルを印刷し、データベースにそれぞれ記録して、収集した各サンプルを患者データとリンクさせます。
- サンプルを研究室に移す前に、識別されていないサンプルの分布をバイオリポジトリデータベースに記録する。
4.タンパク質単離およびウエスタンブロット分析
- 各組織サンプル（SCCおよび/またはANT）を、100mgの組織当たりプロテアーゼインヒビターを含む500μLの細胞溶解バッファーを含むバイアルに入れ、組織を溶解する。
注：50mMトリスpH8.0,150mM NaCl、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1.0％NP-40、および0.1％SDSからなるラジオイムノ沈降アッセイ（RIPA）緩衝液を使用した。他の細胞溶解緩衝液を使用することができる。 - 組織ホモジナイザーを用いて4℃で20秒間隔で5分間組織をホモジナイズする。サンプルを21,000 xgおよび4℃で20分間スピンし、タンパク質を含む上清を新鮮なtuに集めるさあ。同じ条件を用いて上清を再遠心し、最終上清を新しいチューブに集める。
- 電気泳動4〜20％SDS-ポリアクリルアミドグラジエントゲルを用いて各サンプルから30〜50μgのタンパク質を抽出する。必要に応じて、クーマシーブルーでゲルを染色し、タンパク質バンドを可視化します。
- 発現されたタンパク質のウェスタンブロット分析が必要な場合は、標準プロトコールに従ってゲルからポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜にタンパク質を移す。移動後、PonceauはPVDF膜を染色して、必要に応じてタンパク質バンドを可視化する。
- PVDF膜とプローブをブロックして、標準プロトコールに従って目的のタンパク質を検出します。ウェスタンブロット分析のために製造業者が推奨する濃度で、主要な抗体に特異的な対応する二次抗体と共に、目的のタンパク質に特異的な一次抗体を使用する。
- 化学発光基質を用いてプローブされた膜を露出させ、imagiシステム。
RNA単離および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）
- 直ちに、RNA安定化溶液を含む1.5mLチューブに新鮮な組織サンプル（SCCおよび/またはANT）を置き、凍結組織転移溶液を入れた1.5mLチューブにMohs組織サンプルを置き、製造元の推奨に従ってください。組織が完全に浸漬されていることを確認します。これらのサンプルは、使用するまで-80℃で保存してください。
- RNAサンプルを-80℃から取り出し、氷上で解凍する。 50〜100mgの組織当たり1mLのRNA抽出バッファー（フェノール/グアニジンチオシアネート）を含む新しい1.5mLチューブに組織を移す。
- 組織ホモジナイザーを用いて組織を溶解する。 6サイクルのホモジナイゼーションを行い、続いてサンプルを冷却します。各サイクルは、4℃および40秒の冷却期間で20秒の均質化からなる。ホモジナイゼーション後、サンプルを室温で5分間インキュベートする。
- 0.2を加える1mLのRNA抽出バッファーあたり1mLのクロロホルムで洗浄し、チューブを15秒間手で激しく振とうする。室温で2〜3分間インキュベートする。
- サンプルを12,000 xg、4℃で15分間スピンします。サンプルの水相を取り出し、新しい1.5 mLチューブに入れます。
- 水相にステップ5.2で使用したRNA抽出バッファー1 mLあたり100 mLのイソプロパノール0.5 mLを加え、室温で10分間インキュベートする。
注：RNA収量が低いと予想される場合（ すなわち、開始組織量が10mg未満の場合）、サンプルは-80℃で一晩沈殿する可能性があります。さらに、500μLのRNA抽出バッファーあたり5μgのRNaseフリーグリコーゲンを、イソプロパノール沈殿工程の間に添加してRNA収量を改善することができる。 - サンプルを12,000 xgで4℃で10分間スピンします。上清を除去し、ペレットを1mLの75％エタノールで洗浄する。
- サンプルを短時間ボルテックスしてから、7,500 xgと4°で回転させます5分間Cで処理した。洗浄液を捨て、ペレットを5〜10分間風乾します。
- RNAペレットを20μLのRNaseフリー水に再懸濁します。
- 必要に応じて、製造元の推奨に従ってRNAクリーンアップキットを使用して各RNAサンプルを精製します。
注：このステップを実行すると、サンプルからRNAが失われます。
- 必要に応じて、製造元の推奨に従ってRNAクリーンアップキットを使用して各RNAサンプルを精製します。
- 1.2％ホルムアルデヒド-MOPSアガロースゲルを用いて1μgのサンプルを電気泳動し、RNAの品質を分析する。
注：代替として、バイオアナライザーを使用してサンプルを分析し、RIN番号13を得る。 - 関心対象の標的mRNA（またはmiRNA）のqPCR分析のために逆転写プロトコールを用いてRNAをcDNAに逆転写する。
6.組織外植片培養
- 組織を70％エタノールに浸すことにより、培養前に切除した組織を滅菌する。
- スライドまたはディッシュ上に組織を置き、十分な培地（DMEM：Ham＆＃1の1：1混合物）組織を（組織の乾燥を防ぐために）覆うために、10％FBS、25mM HEPES、100IU / mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシンを補充したF-12。メスを用いて、組織を砕いて（<1 mm 3 ）破砕します。
- 組織断片を35mm組織培養皿に移し、各断片の上に約20μLの胎児ウシ血清（FBS）を加える。
- 培養フード内で20〜30分間、またはほとんど乾燥するまで、ディッシュを開いたままにしておきます。
- 各ディッシュに1mLの培地（10％FBS、25mM HEPES、100IU / mLペニシリンおよび100μg/ mLストレプトマイシンを補充したDMEM：Ham's F-12の1：1混合物）を添加し、37℃でインキュベートする5％CO 2中のC。必要に応じて継代培養するか、培養物をサブクローニングする。
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Representative Results
腫瘍およびANTは、タンパク質単離において首尾よく使用され、ウェスタンブロッティングによって試験された。 図3に示すように、皮膚扁平上皮癌腫マーカー（Muc1 14 、FHL-1 15 、およびp40 16,17 ）は、本発明者らの診療所ベースのバイオリポジトリに収集および保存された患者サンプルで検出することができる。
図3：ANTおよびSCCから抽出されたタンパク質の分析。全タンパク質をANTおよびSCC試料から単離し、SCCについての既知のマーカーの発現をウエスタンブロットによって調べた。ムチン1（MUC1）、H因子様1（FHL-1）、およびp40（パネルB）の代表的なウェスタンブロットを示す。 歓喜この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
上記技術を用いて単離されたRNAは、ゲル電気泳動、qPCRおよびRNA完全性分析によって試験されている。図4は、高品質のインタクトなRNAが単離された2つの患者サンプルを示す。 RNAはすべての下流のアプリケーションに適しています。
図4：バイオアナリシスを用いたRNA完全性分析。ゲル電気泳動によるRNAサイズおよび完全性の評価（パネルA）。 RNAサンプルの電気泳動トレース（リボソームRNAの比および分解産物の有無を含む）（パネルB）に基づいて、RNA完全性数（RIN）を各サンプルについて生成した。 「10」のRINは分解産物を含まない完全RNAサンプルを表し、「1」は完全に分解されたsaを示すmple。 SCCおよびANT患者の組織からの代表的なRNAサンプルについて、バンドのデンシトメトリープロファイルを蛍光単位（FU）対ヌクレオチド（nt）（パネルC）としてプロットする。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
組織切片から確立された生存外植片を顕微鏡検査によって評価した（ 図5A ）。腫瘍およびANTサンプルから生成されたこれらの外植体培養物は、ケラチノサイトおよび線維芽細胞混合培養物である。これらの培養物は継代培養してもよいし、将来の細胞株の開発に使用してもよい。保存された組織スライドは、免疫組織化学および免疫蛍光のために使用されている。 図5Bに示すように、SCC試料は、SCC18における上皮 - 間葉系移行マーカーの陽性染色を示す。
図5：SCC切片の外植培養およびIF染色。抗pSnail / Slug一次抗体（パネルB、スケールバー=25μm）で染色した扁平上皮細胞癌組織切片（パネルA、スケールバー=50μm）およびモース顕微鏡手術の一部として集めた組織切片の位相差画像）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
我々は実験結果に影響を与えずに、RNA単離（ステップ5）または外植体培養（ステップ6）の前に、組織を4℃で24〜48時間保存できることを実験的に決定した。ゲル電気泳動またはバイオアナライザおよびRIN数によって評価されるRNA収量または完全性は損なわれない。加えて、外植培養は、4℃で保存された組織を用いて容易に得られる時間の長さ。これにより、診療所と研究室の間でサンプルを移送する際の柔軟性が向上します。 RNA分離および外植体培養は研究室ではなく臨床研究室で行われるため、この機能により、クリニックベースのバイオリポジトリは、以前に予想されていたよりも堅牢なモデルになります。
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Discussion
著者らの知る限り、このプロトコールは、費用対効果と迅速なアプローチの両方で皮膚組織サンプルの臨床調達に焦点を当てた最初のものです。 Mohsマイクロサージャリーを受けている患者は、通常、特定の時間帯にスケジュールされ、収集はこれらの期間に限定されます。サンプル収集には、患者のケアに携わる医療補助員、腫瘍サンプルを処理するモース組織学者、サンプルの採取および血液処理を担当する指定検査スタッフからの努力が含まれる。
収集チームの3人のメンバー（ すなわち、医療アシスタント、モースの組織工学者、および実験技師）との間の綿密な調整により、既存の医療支援スタッフは、3-5個の組織サンプルの収集に関連する追加の作業を完了できることを見出したクリニックの手術で明らかな遅れを伴わずに1日あたり。患者の同意を得る口腔内綿棒および血液の採取は、モース顕微鏡手術に伴う通常の待機期間中に完了する。サンプルをどのように処理するかについての意思決定以外に、モースの組織工学者が担当するタスクは、患者サンプルのモース処理の終了時に完了し、通常、毎日のスケジュールに約30分を追加します。典型的には、診療所スタッフの1人のメンバーが、血液サンプルのラベル付けおよび処理、およびサンプルのデータベースへの移入および入力を行う責任を負っている。処理される試料の数に応じて、これらの義務は既存の職務からかなりの時間を要するかもしれない。したがって、サンプル収集は、十分な実験室スタッフが利用できるときにのみ実施されるべきである。具体的には、1日に5つ以上のサンプルが採取された場合、または複数の血液サンプルが患者から採取された場合、実験技術者から数時間の追加の努力が必要です。
jove_content ">採取日には、医療アシスタント（MA）が組織の寄付について患者から同意を得た後、MAは口腔スワブ（必要に応じて唾液）を採取し、実験担当者の処理のために血液を採取する。これらのサンプルを採取した後の患者の関与であり、したがって、患者の観点から、診療所訪問の残りの部分は変更されない（追跡調査中に血液を提供するように依頼されているにも関わらず）。現在のところ、生検で証明されたがんの診断を受けた患者のみがバイオリポジトリに含まれています。伝染性の伝染性疾患が知られている患者は除外されています。研究所スタッフは、収集チームの他の2人のメンバーと調整を行い、収集されたサンプルを記録する（表1）。後完了した同意書、血液、および頬のスワブは、検査スタッフに転送され、供血者の頭字語、生年月日およびサンプルタイプなどの他の関連情報が記録される。これにより、採取手順中に各患者と共に採取された試料の数およびタイプの記録が可能になる。 SCC組織（ 図6 ）とANT（図7）の両方の処理を要約したフローチャートは、収集手順における新しい職員の訓練のための有用なツールである。
図6： SCCサンプルの処理を説明するフローチャート。腫瘍切除の際に、試料のサイズが評価される。試料が2 mm 3以下であれば、試料全体がモース加工に利用され、クリーンマージンの評価（指標完全な腫瘍除去の必要性）が最優先事項です。モース処理後、残りの組織は液体窒素中で凍結され、バイオリポジトリに移される。組織の2mm 3以上の部分が除去されるように試料が十分に大きい場合、この部分を収集し、細胞培養培地を含むチューブに入れ、残りの部分をモース加工に利用し、上記のように保存する。細胞培養培地に取り出された試料の部分はさらに細分化され、約0.5mm 3断片が除去され、細胞培養系の確立に利用される。残りの組織断片は、下流のタンパク質および遺伝子発現分析のためにバイオリポジトリに移される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図7： ANTサンプルの処理を示すフローチャート。モース閉鎖時に、隣接する正常組織（ANT）の一部が除去され、モース外科医によって収集される。サンプルサイズが2 mm 3以下の場合、試料全体を低温管に入れ、液体窒素で凍結してからバイオリポジトリに移す。試料が> 2mm 3である場合、試料全体を最初に細胞培養培地を含むチューブに入れる。検体は、細胞培養系の確立に使用される〜0.5mm 3の断片にさらに切断される。残りの組織切片は、下流のタンパク質および遺伝子発現分析のために保存されるようにバイオリポジトリに移される。55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
このプロトコルは、バイオリポジトリ内のサンプル間のばらつきを最小限に抑えるように設計されています。臨床医スタッフと臨床医とすべての研究室スタッフとの間の調整と効果的なコミュニケーションは、変動性を最小限に抑え、組織からの高品質DNA、RNA、およびタンパク質の到達を最大限にするために不可欠です。組織内のDNAおよびタンパク質は堅牢であるが、RNAが望ましい場合、RNAの完全性を維持するために収集、輸送および処理中に組織を冷たく、適切な培地に保つことが重要である。正確な記録保存は、下流のアプリケーションの結果を分析する際にこの情報がしばしば必要となるため、患者のサンプルを履歴と診断とリンクさせるためにも不可欠です。
パーソナライズド・メディスおよびバイオに対する関心の高まりとともにマーカー研究では、最近、いくつかの生体レポジトリが確立されている。これらは、通常、大規模な学術センターの病院ベースの診療所に関連付けられており、設定や操作に多額の費用がかかります（2,8,19）。毎日の練習の一部として生成された皮膚癌サンプルのためのクリニックベースのバイオリポジトリの開発は、他の生体レポジトリーに対していくつかの重要な利点を有する。第1に、単一の収集およびサンプル処理サイトでは、下流のアプリケーションを危険にさらすことがあるサンプル処理のバリエーションが最小限に抑えられます。第2に、寄付されたこれらのサンプルが安定した患者集団から引き出されるので、識別されていない医療記録および患者の結果データへのアクセスは比類ないものである。これらのデータは、匿名化され、サンプル収集時またはフォローアップ訪問時に、患者図表からバイオリポジトリデータベースに転送されてもよい。第三に、忠実な患者ベースで、clinicベースのバイオリポジトリは、同じ患者の複数のサンプルを集めることができます。サンプルセットは、他の設定ではあまり得られません。このプロトコルの限界の1つは、Mohs顕微鏡写真手術で得られた皮膚サンプルに最適化されており、他のタイプの組織や臨床手順に変更する必要があるかもしれないということです。
全体として、バイオリポジトリの重要な目標の1つは、研究者が特に液体生検およびがんマーカーの開発に関する幅広い質問をすることを可能にするために、同じドナーからの広範なサンプルを提供することです。具体的には、mRNAおよびタンパク質レベルでの腫瘍組織学およびバイオマーカーの発現を血漿サンプルと相関させる能力、ならびに患者結果データを参照する能力は、唯一強力なデータセットを生成する。私たちは、臨床医ベースのバイオリポジトリモデルを利用して、生物医学研究における患者サンプルの不足を緩和することを願っています。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、中西部大学健康科学研究助成助成金、EEHに授与された資金、およびKJLに授与された中西部大学研究およびスポンサープログラムの教員補助プログラムの助成を受けて行われました。 Affiliated LaboratoriesおよびAffiliated Dermatologyが追加サポートを提供しました。彼らの技術的支援のためにSarah Potekhen、Jamie Barto、Stefani Fawks、Cody Jording、Stacie Schimke、Heather Kissel、Ali Zaidiに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA | ThermoFisher Scientific | 02-685-2B | |
| Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades | ThermoFisher Scientific | 50-949-411 | |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | ThermoFisher Scientific | 16-100-110 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-138 | |
| Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium | ThermoFisher Scientific | NC9791321 | |
| Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound | ThermoFisher Scientific | 50-363-579 | |
| Leica CM1950 Cryostat | Leica Biosystems | 14047743909 | |
| Frosted Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-343 | |
| Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 99-900-01 | |
| Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes | ThermoFisher Scientific | 03-337-7X | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| Boca Scientific BuccalT-Swab | ThermoFisher Scientific | NC9679349 | |
| Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer | ThermoFisher Scientific | 50-195-822 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | PI78443 | |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 05-401-203 | |
| Pellet Morter Cordless Homogenizer | ThermoFisher Scientific | 12-141-3 | |
| RNAse Free Pellet Pestle | ThermoFisher Scientific | 121-141-364 | |
| Forma SteriCycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 13-998-089 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | SH30071.02 | |
| Gibco Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12-634-028 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140148 | |
| Gibco 1 M Hepes | ThermoFisher Scientific | 15-630-130 | |
| Nunc Cell Culture 35 mm with Vent | ThermoFisher Scientific | 1256591 | |
| Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 | Abnova | MAB12583 | |
| Anti-p40 (p63 delta) antibody | Abnova | ABX-144A | |
| Anti MUC-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-7313 | |
| Anti-Snail + Slug (phospho S246) | Abcam | Ab63568 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 568 Phallodin | Molecular Probes | A12380 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P36941 | |
| Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera | Zeiss | 4300009901 | |
| Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera | Olympus | IX511F3 |
References
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