Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Etablering av et klinisk-basert biorepository

Published: May 29, 2017 doi: 10.3791/55583
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3, 1
1Affiliated Dermatology & Affiliated Laboratories, Midwestern University Osteopathic Postdoctoral Training Institute, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Arizona College of Osteopathic Medicine, Midwestern University, 3Biomedical Sciences Program, College of Health Sciences, Midwestern University

Summary

Kutane svulster blir ofte kastet etter Mohs mikrografisk kirurgi. En protokoll er beskrevet her som gjør det mulig for klinisk hjelpepersonell å effektivt behandle og lagre kutan tumor ( f.eks. Squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma og melanoma) prøver for nedstrøms laboratorieapplikasjoner uten å forstyrre klinisk operasjon.

Abstract

Forekomsten av hudkreft ( f. Eks. Squamisk cellekarcinom, basalcellekarcinom og melanom) har økt de siste årene. Det forventes at det vil være en parallell etterspørsel etter kutane tumorprøver for biomedisinsk forskning. Vevtilgjengelighet er imidlertid begrenset på grunn av kostnaden ved å etablere en biorepository og mangelen på protokoller tilgjengelig for å oppnå kliniske prøver som ikke forstyrrer klinisk operasjon. En protokoll ble opprettet for å samle og behandle kutan tumor og tilhørende blod- og spyttprøver som har minimal innvirkning på rutinemessige kliniske prosedyrer på datoen for en Mohs-kirurgi. Tumorprøver oppsamles og behandles fra pasienter som gjennomgår Mohs-histoteknologens første lag med Mohs-kirurgi for biopsi-beprøvde kutane maligniteter. Tilstøtende normalt vev oppsamles ved kirurgisk lukning. Ytterligere prøver som kan samles er helblod og buccal swabs. Ved å bruke vevsprøver som normalt kasseres, ble det utviklet en biorepository som tilbyr flere viktige fordeler ved å være basert i klinikken versus laboratorieinnstillingen. Disse inkluderer et bredt spekter av innsamlede prøver; Tilgang til deidentifiserte pasientopptegnelser, inkludert patologiske rapporter; Og, for den typiske giveren, tilgang til ytterligere prøver under oppfølgingsbesøk.

Introduction

Kreft- og biomarkørforskning er avhengig av forsyning av humane vevsprøver av høy kvalitet, og begrenset tilgang har hindret forskningen 1 , 2 . Mange dermatologiske studier er begrenset av utilstrekkelig tilførsel, variabel kvalitet og kostnader forbundet med bruk av humant vev. Kostnaden ved å etablere en stor, dedikert biobank har blitt anslått til om lag to millioner dollar 3 , og disse kostnadene legger bruken av menneskelig vev utenfor rekkevidde av mange forskere. Videre utgjør prosessen med å generere og lagre forskningsprøver risikoen for å påvirke klinisk operasjon og forsinke pasientomsorgen dersom den ikke utføres forsiktig. En kostnadseffektiv klinisk-basert biorepository er etablert som fokuserer på hudkreftprøver etter anbefalte beste praksis og prøvevalidering 4 , 5 , 6 .

7 , 8 .

Målet med Mohs mikrografisk kirurgi teknikk er å sikre at alt kreftvev blir fjernet, samtidig som det opprettholder så mye sunt vev som mulig. Prosedyren innebærer progressiv fjerning av tynne lag av tumorvev. Hvert påfølgende lag er hansTologisk undersøkt (etter kryoseksjonering av tumorvevet og utførelse av H & E-farging) av en hudlege for å avgjøre om alt kreftvev har blitt fjernet. Excisionen og undersøkelsen av påfølgende lag av vev utføres mens pasienten forblir på kontoret. Denne teknikken anses som det beste behandlingsalternativet for SCC 9 . På dette tidspunktet er såret lukket, og for å forbedre helbredelse og kosmetisk utseende, blir nærliggende normalt vev (ANT) ofte skåret ut. Dermed er denne kirurgiske prosedyren for å fjerne en svulst ideell til å samle histologisk karakterisert vev for fremtidige studier.

Anskaffelsesprosedyren for å skaffe svulstvev, tilstøtende normalt vev, spytt og blodprøver, er utformet for å få minimal innvirkning på vanlige ansatteoppgaver ( figur 1 ). Medisinske assistenter utfører bloddragene mens du forbereder pasienten for prosedyren. Etter fullføring av Mohs-prosedyren, M Åh histoteknologen forbereder ytterligere histologiske lysbilder av prøven og overfører vevet til biorepositoryet. Kostnader knyttet til etablering av biorepository inkluderer kjøp av kryopreserveringsfrysere, opprettelse av beskjedent klinisk laboratorierom og utvikling av et oppfølgingssporingsprogram.

Figur 1
Figur 1: Sekvens av prøveinnsamling og ansvarlig personale. Ved pasientens innsjekking og oppnåelse av pasientens samtykke samler den medisinske assistenten en bukkalpinne og utfører en blodtrekk. Dermatologen og den medisinske assistenten beskytter deretter svulsten og lukker såret, i løpet av hvilken tid SCC og ANT prøver samles, henholdsvis. En dedikert laboratorie tekniker behandler blodet og deler SCC og ANT prøver for vevskultur, bevaring og inngang i biorepository.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Mangfoldet av samlede prøver muliggjør en rekke eksperimentelle tilnærminger ( figur 2 ). Prøver oppsamlet fra pasienten er buccal swabs (spytt kan også samles om nødvendig), helblod og skåret vev. Buccal swabs og en prøve fra hele blodet blir lagret, uten behandling, for genotyping og vevsmatching. Hele blodet separeres i hvite blodlegemer (WBC) og plasmafraksjoner for fremtidige analyser. Etter Mohs-prosessering, plasseres den frosne svulsten direkte i flytende nitrogen og overføres til en -80 ° C fryser. Friskt, levedyktig tumorvev og ANT-prøver dyrkes ved å bruke modifikasjoner av tidligere teknikker 10 , 11 og deretter kryokonservert. Under samlingen registreres nummeret på hver prøvetype på et regneark før inngangen til Inventar sporing programmet for å lette nøyaktig bearbeiding ( tabell 1 ).

Figur 2
Figur 2: Oversikt over klinikkbasert biorepositorprøveinnsamling og -behandling. En bukkalpinne og blodprøve oppsamles fra pasienten og lagres for nedstrøms genotyping og vevsmatching. Hele blodet blir videre behandlet for isolering av hvite blodlegemer og CTC-analyser, samt for plasmainnsamling og væskebiopsianalyse. Vev utskåret under Mohs prosedyren er histologisk behandlet for diagnostiske formål, hvoretter de histologiske lysbildene kan brukes eksperimentelt for ytterligere immunhistokemiske analyser. Forutsatt at den utskårne vevsprøven er stor nok, fjernes en del av ferskt vev og deles for protein- og RNA-isolasjon og for etablering av dyrkede cellelinjer.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Samlingsdato:
Pasient 1 Pasient 2 Pasient 3 Pasient 4 Pasient 5
Initialer og fødselsdato
Øyenfarge
Eksempel Type
Eksempelplassering
Spytt
WHull blod
Plasma
Tumor levedyktig
Vev Normal Levende
Tumor Mohs Flytende nitrogen
Vev Normal Flytende Kväve
lysbilder

Tabell 1: Sjekkliste for å registrere samlinger. Data spores og registreres med hver samplet samling inkluderer pasientens initialer, fødselsdato og øyenfarge (for hudtyping), så vel som lokaliseringenPå prøvefjerning. Antall spyttprøver, blodoppsamlingsvolumer og antall levedyktige og konserverte vevsprøver samlet inn registreres også som referanser for tildelinger til senere bruk. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

For å validere prøveinnsamlingsprosedyrer, har hver prøvetype blitt testet i nedstrømsapplikasjoner. Ved bruk av modifikasjoner av tidligere teknikker 12 har tumor og ANT blitt vellykket brukt i protein- og RNA-isolasjon og kan potensielt brukes til DNA-isolasjon. Levende eksplanter som er etablert fra vevseksjonene, er blitt evaluert ved mikroskopi, mens lagrede histologiske lysbilder har blitt brukt til immunhistokjemi og immunfluorescens.

Ved å følge protokollen beskrevet her, er det mulig å utvide denne modellen til andre dermatologiklinikker, andre svulstetyper (som melanom), Og andre kirurgiske spesialiteter og praksiser for å gi humane vevsprøver for mangfoldig forskning i humane kreftformer. Små modifikasjoner av denne protokollen vil trolig være nødvendig for annen praksis, men i prinsippet er denne protokollen gjeldende for enhver kirurgisk praksis som rutinemessig sletter pasientprøver samlet i løpet av pasientbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter på humane vevsprøver ble godkjent av Western IRB (WIRB Protocol # 20142461). Det enkle kriteriet for oppsamling av vev for disse prosedyrene er en biopsi-bevist diagnose av SCC. Ingen ekskluderingskriterier ble skissert i den opprinnelige IRB-protokollen, men prøver fra pasienter med en kjent blodbåren smittsom sykdom ble ikke brukt. Informert samtykke ble oppnådd før oppsamling av kutant vev, blod og spytt. Midwestern Institutional Review Board godkjente valideringsarbeidet med klinikkbaserte biorepository prøver ved Midwestern University (AZ # 807).

1. Kutan tumorvævsprosessering

MERK: Dette skal utføres av en Mohs histotekniker.

  1. Behandling av friskt squamouscellekarcinom (SCC) Tissue for RNA og Explant Culture
    1. Etter at vevet er blitt skåret av Mohs kirurg, høst en 10 til 50 mg (≥ 10 mm 3 MERK: Dette er bare mulig hvis svulsten er stor nok til at en prøve på 10-50 mg (≥ 10 mm 2 ) skal fjernes før den histologiske vurderingen, som er en del av Mohs-prosedyren. Hvis svulsten ikke er stor nok til å tillate at minst 2 mm 3 fjernes, fortsett ikke med behandling for RNA (hopp trinn 5).
    2. Overfør det levedyktige vevet til et merket 1,5 ml rørholdig dyrkningsmedium (1: 1 blanding av DMEM: Ham's F-12, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) ved hjelp av pinsetter og sikre at Vevet er helt nedsenket i mediet. Oppbevar dette røret ved 4 ° C før ytterligere behandling.
    3. Bruk vevet til RNA-isolasjon og ekspresjonsanalyse (se trinn 5) og / eller etableringenEnt av en explant kultur (se trinn 6) innen 24 timer.
    4. Plasser resten av svulstprøven som ble fjernet fra pasienten (trinn 1.1.1) på en kryostatvevsholder (eller "chuck"). Embed vevet i optimal skjæringstemperatur (OCT) -forbindelse, frys vevet i holderen, for å tillate ferdigstillelse av Mohs histologi og for fremstilling av ytterligere histologiske lysbilder for eksperimentell analyse.
  2. Fremstilling av histologiske lysbilder
    1. Skjær vevseksjoner 7 μm tykk ved hjelp av en kryostat og opprett to (eller flere) lysbilder for hver svulsteksempel. Sørg for at hvert lysbilde inneholder opptil tre deler av den komplette svulsten.
      MERK: En av de to lysbildene blir farget ved hjelp av H & E av Mohs histoteknolog, og de ekstra lysbildene kan behandles med IF, IHC eller FISH analyse.
    2. Plasser lysbildene i aceton i 1-2 s for å fikse vevet. Sett disse lysbildene til side for å tørke. Ikke H & EFlekk eller dekselglasset som skal brukes til fremtidig immunfluorescens (IF), immunhistokjemi (IHC) eller fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse, avhengig av eksperimentell protokoll.
  3. Behandling av Post-Mohs Tissue
    1. Når Mohs-prosessering er fullført (trinn 1.1-1.2), arbeid i kryostatkammeret og pry prøven fra det kryo-embedende medium og legg vevet i et merket kryogenrør.
    2. Legg det merkede hetteglasset i flytende nitrogen før vevet har tint. Hvis prøver skal brukes til protein- og / eller DNA-analyse, kan de overføres til flytende nitrogen eller en -80 ° C fryser innen noen få minutter for å bli lagret for fremtidig proteinekspresjon og DNA-mutasjonsanalyse (se trinn 4-5) .
      MERK: Hvis intakt RNA er ønsket fra post-Mohs-prøven, er det viktig å holde prøven frossen under fjerning fra kryo-innlejringsmediet. Hvis ekstrem omsorg ikke utøves påDette trinnet, post-Mohs-prøven bør reserveres for protein og / eller DNA-analyse.
  4. Behandling av fersk ANT
    1. På tidspunktet for Mohs lukking, få ANT fra Mohs kirurg.
    2. Fjern en like eller større mengde ANT som høstet fra SCC-prøven (se ovenfor) fra apikalsiden av det normale vevet og overfør det til et merket 1,5 ml rørholdig dyrkningsmedium (1: 1 blanding av DMEM: Ham's F- 12 tilsatt 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) ved bruk av pincett.
    3. Fullstendig dyp vevet i samme kulturmedium og lagre ved 4 ° C til etterfølgende behandling (se trinn 4-6).

2. Blod-, spytt- og bukkalpinneprosessering

  1. Oppnå ca. 10 ml blod i EDTA-oppsamlingsrør via venepunktur.
  2. Overfør blodet fra oppsamlingsrørene til et sterilt 15- eller 50 ml-sentrifugerør. Fjern ca. 200 μL i et 1,5 ml kryogenrør, unngå bobler; Lagre denne helblodprøven ved -80 ° C, som skal brukes til fremtidig genotyping og vevtilpasning, om nødvendig.
    1. Spin det gjenværende blodet ved 1000 xg i 30 minutter og følg standard prosedyrer for å samle plasmafraksjonen.
    2. Aliquot plasmaet i 1 ml trinn i 1,5 ml kryogenrør og lagre ved -80 ° C for bruk under fremtidige væskebiopsianalyser.
  3. Bruk en steril vattpinne for å oppnå en bukkalpinneprøve og oppbevar vattpinnen i et sterilt rør ved romtemperatur.
  4. Ta om nødvendig en spyttprøve og lagre i et sterilt rør ved romtemperatur.
    MERK: Disse prøvene kan brukes til fremtidig genotyping og vevsmatching, om nødvendig.

3. Registrering av prøver

  1. Overfør informasjon fra sjekkliste over pasientprøver til biorepositorydatabasen. Inkluder pasientinformasjon og diagNose fra pasientdiagrammet.
  2. Skriv ut etiketter med strekkode for hver prøve og registrer hver i databasen for å koble hver samlet prøve med pasientdata.
  3. Registrere distribusjonen av de-identifiserte prøvene i biorepositorydatabasen før overføring av prøver til forskningslabben.

4. Proteinisolasjon og Western Blot Analysis

  1. Plasser hver vevsprøve (SCC og / eller ANT) i et hetteglass som inneholder 500 μl cellelysebuffer som inneholder proteaseinhibitorer per 100 mg vev for å lyse vevet.
    MERK: Vi brukte en radioimmunprecipitasjonsanalyse (RIPA) buffer, sammensatt av 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdeokoksolat, 1,0% NP-40 og 0,1% SDS. Andre celle lysis buffere kan brukes.
  2. Homogeniser vevene ved hjelp av et vev homogenisator i 5 minutter i 20-s intervaller ved 4 ° C. Spinn prøvene ved 21 000 xg og 4 ° C i 20 minutter og samle supernatantholdig protein inn i en frisk tuvære. Spinn supernatanten på nytt med de samme forholdene og samle den endelige supernatanten i et friskt rør.
  3. Elektroforese 30-50 μg protein fra hver prøve ved bruk av en 4-20% SDS-polyakrylamidgradientgel. Legg gelen med Coomassie Blue for å visualisere proteinbånd, hvis ønskelig.
  4. Hvis Western blot-analyse av uttrykte proteiner trengs, overfør proteinene fra gelen til en polyvinyliden-difluorid-membran (PVDF) etter standardprotokoller. Etter overføring, pynter Ponceau PVDF-membranen for å visualisere proteinbånd, om ønskelig.
  5. Blokker PVDF-membranen og sonden for å oppdage proteiner av interesse etter standardprotokoller. Bruk primære antistoffer som er spesifikke for protein (er) av interesse, sammen med tilsvarende sekundære antistoffer som er spesifikke for de primære antistoffene, ved konsentrasjoner anbefalt av produsenten for Western blot-analyse.
  6. Utsett den probed membranen ved hjelp av et kjemiluminescerende substrat og bilde membranen ved hjelp av en imagiNg system.

5. RNA-isolasjon og kvantitativ polymerase-kjedereaksjon (qPCR)

  1. Plasser ferske vevsprøver (SCC og / eller ANT) umiddelbart i et 1,5 ml rør som inneholder en RNA-stabiliseringsoppløsning, og plasser post-Mohs vevsprøver i et 1,5 ml rør som inneholder en frossen vevsovergangsløsning, i henhold til produsentens anbefalinger. Sørg for at vevet er helt nedsenket. Oppbevar disse prøvene ved -80 ° C til bruk.
  2. Fjern RNA-prøvene fra -80 ° C og tine på is. Overfør vevet til et nytt 1,5 ml rør som inneholder 1 ml RNA-ekstraksjonsbuffer (fenol / guanidintiocyanat) per 50-100 mg vev.
  3. Lyse vevene ved hjelp av en vevshomogenisator. Utfør seks sykluser av homogenisering, etterfulgt av en periode med prøvekjøling; Hver syklus består av 20 s homogenisering ved 4 ° C og en 40 s kjøleperiode. Etter homogenisering inkuberes prøven i 5 minutter ved romtemperatur.
  4. Legg til 0,2Ml kloroform per 1 ml RNA-ekstraksjonsbuffer og rist tuben kraftig for hånd i 15 s. Inkubér i 2-3 minutter ved romtemperatur.
  5. Spinn prøvene ved 12 000 xg og 4 ° C i 15 minutter. Fjern den vandige fasen i prøven og sett den inn i et nytt 1,5 ml rør.
  6. Tilsett 0,5 ml 100% isopropanol per 1 ml av RNA-ekstraksjonsbufferen som ble anvendt i trinn 5.2 til den vandige fase og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.
    MERK: Hvis RNA-utbyttene forventes å være lave ( dvs. startvevvolumet er mindre enn 10 mg), kan prøvene utfelles natten over ved -80 ° C. I tillegg kan 5 μg RNase-fri glykogen per 500 μl RNA-ekstraksjonsbuffer bli tilsatt under isopropanol-utfellingstrinnet for å forbedre RNA-utbytter.
  7. Spinn prøven ved 12 000 xg ved 4 ° C i 10 minutter. Fjern supernatanten og vask pelleten med 1 ml 75% etanol.
  8. Vortex prøven kort og drei den deretter på 7.500 xg og 4 °C i 5 min. Kast vaskingen og lufttør pelleten i 5-10 minutter.
  9. Resuspender RNA-pellet i 20 ul RNase-fri vann.
    1. Hvis det ønskes, rens hver RNA-prøve ved hjelp av et RNA-opprydningssett etter produsentens anbefalinger.
      MERK: Små RNA vil gå tapt fra prøven hvis dette trinnet utføres.
  10. Elektroforese en 1 μg prøve ved hjelp av en 1,2% formaldehyd-MOPS agarosegel for å analysere kvaliteten på RNA.
    MERK: Som et alternativ, analyser prøver ved hjelp av en bioanalysator for å få et RIN nummer 13 .
  11. Omvendt transkriber RNA til cDNA ved hjelp av en revers transkripsjonsprotokoll for qPCR analyse av målmRNAer (eller miRNAer) av interesse.

6. Tissue Explanting Cultures

  1. Steriliser det utskårne vevet før kulturen ved å dyppe vevet i 70% etanol.
  2. Plasser vevet på et lysbilde eller fat og legg til nok kulturmedium (1: 1 blanding av DMEM: Ham & #39; s F-12 suppleret med 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin) for å dekke vevet (for å hindre at vevet tørker). Skar forsiktig vevet i fragmenter (<1 mm 3 ) ved hjelp av et skalpellblad.
  3. Overfør vævsfragmentene til en 35 mm vevskulturskål og tilsett ca. 20 ul føtalt bovint serum (FBS) på toppen av hvert fragment.
  4. La oppfatet stå åpent i en kultur hette i 20-30 minutter, eller til det er nesten tørt.
  5. Tilsett 1 ml kulturmedium (1: 1 blanding av DMEM: Ham's F-12 tilsatt 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin) til hver tallerken og inkuber ved 37 ° C C i 5% CO 2 . Subkultur eller subklone kulturer om nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tumor og ANT har blitt brukt med suksess i proteinisolasjon og testet ved Western blotting. Som vist i figur 3 kan kutane skivepitelcellekarcinommarkører (Muc1 14 , FHL-1 15 og p40 16 , 17 ) detekteres i pasientprøver oppsamlet og lagret i vår klinikkbaserte biorepository.

Figur 3
Figur 3: Analyse av proteiner ekstrahert fra ANT og SCC. Totalt protein ble isolert fra ANT- og SCC-prøver, og ekspresjonen av kjente markører for SCC ble undersøkt av Western blot. Representative Western blots av mucin 1 (MUC1), Factor H Like-1 (FHL-1) og p40 (panel B) er vist. PleaSe klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

RNA isolert ved hjelp av ovennevnte teknikker har blitt testet ved gelelektroforese, qPCR og RNA-integritetsanalyse. Figur 4 viser to pasientprøver hvorfra høy kvalitet, intakt RNA ble isolert. RNA er egnet for alle nedstrøms applikasjoner.

Figur 4
Figur 4: RNA integritetsanalyse ved bruk av bioanalyse. Vurdering av RNA-størrelse og integritet ved gelelektroforese (panel A). Et RNA-integritetnummer (RIN) ble generert for hver prøve basert på det elektroforetiske spor av RNA-prøven, inkludert forholdet mellom ribosomalt RNA og tilstedeværelsen eller fraværet av nedbrytningsprodukter (panel B). En RIN på "10" representerer en perfekt RNA-prøve, uten noen nedbrytningsprodukter, mens "1" markerer en fullstendig nedbrytet sample. Densitometri profiler av båndene er plottet som fluorescens-enheter (FU) versus nukleotider (nt) (panel C) for representative RNA-prøver fra SCC og ANT pasientvev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Levende eksplanter som er etablert fra vevseksjonene, er blitt evaluert ved mikroskopi ( figur 5A ). Disse eksplanterte kulturer, generert fra tumor- og ANT-prøver, er blandede keratinocytter og fibroblastkulturer. Disse kulturer kan subcultured eller brukes til fremtidig cellelinjeutvikling. Lagrede histologiske lysbilder har blitt brukt til immunhistokjemi og immunfluorescens. Vist i figur 5B viser en SCC-prøve positiv farging for en epithelial-til-mesenkymal overgangsmarkør i SCC 18 .


Figur 5: Eksplosjonskultur og IF-farging av SCC-seksjoner. Fasekontrastbilde av et eksplosiv cellekarsinomvæv (panel A, Scale bar = 50 μm) og vevseksjoner samlet som en del av Mohs mikrografisk kirurgi, farget med et anti-pSnail / Slug primært antistoff (panel B, skaleringsbjelke = 25 μm ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vi har eksperimentelt bestemt at vev kan lagres ved 4 ° C i 24-48 timer før RNA-isolasjon (trinn 5) eller eksplanteringskultur (trinn 6) uten å påvirke resultatene. RNA-utbytte eller -integritet, som vurderes ved gelelektroforese eller bioanalysator og RIN-nummer, blir ikke kompromittert. I tillegg blir eksplante kulturer enkelt oppnådd ved å bruke vev lagret ved 4 ° C for denneS tid. Dette gir økt fleksibilitet ved overføring av prøver mellom klinikken og forskningslabben. Siden RNA-isolasjon og eksplanteringskultur utføres i laboratoriet og ikke i klinikken, gjør denne funksjonen den klinikkbaserte biorepository en mer robust modell enn vi tidligere hadde forventet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forfatterens kunnskap er denne protokollen den første i sitt slag som fokuserer på klinisk anskaffelse av kutane vevsprøver i både en kostnadseffektiv og rask tilnærming. Pasienter som gjennomgår Mohs-mikrokirurgi er typisk planlagt i bestemte tidsblokker, og samlingen er begrenset til disse periodene. Eksempelsamling innebærer innsats fra den medisinske assistenten som er involvert i pasientbehandling, Mohs histoteknologen som behandler svulstprøver, og et utpekt laboratoriemedarbeider som håndterer prøveinngang og blodbehandling.

Med forsiktig koordinering mellom de tre medlemmene av samlingslaget ( dvs. den medisinske assistenten, Mohs histoteknolog og laboratorietekniker), har vi funnet ut at eksisterende medisinsk assistentpersonell kan fullføre tilleggsoppgaver knyttet til innsamling av 3-5 vevsprøver Per dag uten tilsynelatende forsinkelse i klinisk operasjon. Innhenting av pasientens samtykke Og innsamling av buccal swabs og blod blir fullført under normale venteperioder involvert i Mohs-mikrokirurgi-prosedyren. Annet enn beslutningsprosessen om hvordan en prøve skal behandles, er oppgavene som Mohs histoteknologen er ansvarlig ferdig på slutten av Mohs-behandlingen av pasientprøver, og vil typisk legge til ca. 30 minutter til den daglige planen. Vanligvis er et medlem av klinikkpersonalet ansvarlig for å merke og behandle blodprøver og for å utføre overføring og oppføring av prøver i databasen. Avhengig av antall behandlede prøver, kan disse oppgavene kreve betydelig tid vekk fra eksisterende plikter; Eksempelvis må prøvetaking bare utføres når tilstrekkelig laboratoriepersonell er tilgjengelig. Spesifikt, hvis mer enn 5 prøver samles på en enkelt dag, eller hvis flere blodprøver samles fra pasienter, er det nødvendig med flere timer ekstra innsats fra laboratorietekniker.

Jove_content "> På samlingsdager får de medisinske assistentene samtykke fra pasientene til vevsgjennomgang. MA oppnår deretter en bukkalpinne (og spytt, om nødvendig) og samler blod til behandling av laboratoriepersonell. Det er ikke mer Pasientens engasjement etter samlingen av disse prøvene, så fra pasientens perspektiv er resten av klinikkbesøket uendret (selv om de blir bedt om å donere blod under et oppfølgingsbesøk). For tiden kan vi anslå at 70% av pasientene samtykker Å donere vev, med ~ 30% av disse pasientene donerer også blod, 30% avtar til å delta. For tiden er det kun pasienter med en biopsi-bevist bevis for kreft som er inkludert i biorepository. Pasienter med kjent overførbar sykdom i blod er utelukket .

Laboratoriemedlemmet er ansvarlig for koordinering med de to andre medlemmene i samlingslaget og registrerer prøvene som samles inn (Tabell 1). Etter enEn innledende prøveinnsamling, den utfylte samtykkeformen, blodet og buccalpinnen blir overført til laboratoriemedarbeiderne, og donorens initialer, fødselsdato og annen relevant informasjon, som eksempeltype, registreres. Dette muliggjør opptak av tallene og typene av prøvene som er samlet inn hos hver pasient under innsamlingsprosedyren. Flytdiagrammer som oppsummerer behandlingen av både SCC-vev ( Figur 6 ) og ANT (Figur 7) er nyttige verktøy for opplæring av nye ansatte i innsamlingsprosedyrer.

Figur 6
Figur 6: Flowchart avgrense behandlingen av SCC-prøver. Ved tumorutskillelse vurderes størrelsen på prøven. Hvis prøven er ≤2 mm 3, brukes hele prøven for Mohs-behandling, som vurdering av rene marginer (indikatorenAtion av fullstendig tumorfjerning) er topp prioritet. Etter Mohs-bearbeiding fryses eventuelt gjenværende vev i flytende nitrogen og overføres til biorepositoryet. Hvis prøven er stor nok, slik at en> 2 mm 3 porsjon av vevet kan fjernes, blir denne porsjon oppsamlet og plassert i et rørholdig cellekulturmedium mens den gjenværende del benyttes for Mohs-behandling og lagres som ovenfor. Delen av prøven fjernet til cellekulturmedium blir ytterligere segmentert, med et ~ 0,5 mm3 fragment fjernet og benyttet for etablering av en cellekulturlinje; Det gjenværende vevsfragmentet overføres til biorepositoryet for nedstrøms protein og geneekspresjonsanalyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

er.within-page = "1"> Figur 7
Figur 7: Flowchart avgrense behandlingen av ANT-prøver. På tidspunktet for Mohs-lukking fjernes en del av tilstøtende normalt vev (ANT) og samles inn av Mohs-kirurgen. Hvis prøvestørrelsen er ≤2 mm 3 , plasseres hele prøven i et kryogenrør og fryses i flytende nitrogen før overføring til biorepositoryet. Hvis prøven er> 2 mm 3 , plasseres hele prøven først i et rør som inneholder cellekulturmedium. Prøven blir deretter snittet inn i et ~ 0,5 mm3 fragment, som skal anvendes for etablering av cellekulturlinjer. Resterende vevsavsnitt overføres til biorepositoryet for å bli lagret for nedstrøms protein og geneksponeringsanalyse.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Denne protokollen er utformet for å minimere variasjon blant prøver i biorepository. Koordinering og effektiv kommunikasjon mellom klinikkpersonell og mellom klinikken og alle laboratoriepersonell er viktig for å minimere variabilitet og for å maksimere oppnåelsen av høy kvalitet DNA, RNA og protein fra vevet. Mens DNA og protein i vevet er robuste, hvis RNA er ønsket, er det kritisk å holde vevet kaldt og i passende medium under innsamling, transport og behandling for å opprettholde RNA-integritet. Nøyaktig opptak er også viktig for å knytte pasientprøver med sin historie og diagnose, da denne informasjonen ofte trengs når analyseres resultater fra nedstrømsapplikasjoner.

Med den økende interessen for personlig medisin og bioMarkørforskning, har en rekke biorepositorier nylig blitt etablert. Disse er vanligvis knyttet til sykehusbaserte klinikker i store akademiske sentre og har betydelige kostnader forbundet med oppsett og operasjon 2 , 8 , 19 . Utviklingen av en klinikkbasert biorepository for kutane kreftprøver generert som en del av daglig praksis har flere viktige fordeler over andre biorepositorier. For det første, med en enkelt samling og prøvebehandlingssted, blir variasjoner i prøvehåndtering, som kan kompromittere nedstrømsapplikasjoner, minimert. For det andre, da disse donerte eksemplene er hentet fra en stabil pasientpopulasjon, er tilgang til de-identifiserte medisinske journaler og pasientutfallsdata uovertruffen. Disse dataene kan bli anonymisert og overført fra pasientdiagrammet til biorepositorydatabasen på tidspunktet for prøveinnsamling eller på et oppfølgingsbesøk. For det tredje, med en lojal pasientbase, klInic-baserte biorepository er i stand til å samle flere prøver fra samme pasient, et utvalg sett ikke ofte oppnådd i andre innstillinger. En av begrensningene i denne protokollen er at den har blitt optimalisert for kutane prøver oppnådd gjennom Mohs mikrografisk kirurgi, og må kanskje modifiseres for andre typer vev eller kliniske prosedyrer.

Samlet sett er et av de viktigste målene for biorepository å gi et bredt spekter av prøver fra den samme giveren slik at forskere kan stille et bredt spekter av spørsmål, spesielt for utvikling av flytende biopsier og kreftmarkører. Spesifikt kan evnen til å korrelere tumorhistologi og uttrykket av biomarkører ved mRNA- og proteinnivåene til plasmaprøver, samt muligheten til å referere til pasientutfallsdata, skape et unikt kraftig datasett. Vi håper at den klinikkbaserte biorepositorymodellen kan bli brukt til å lette mangelen på pasientprøver i biomedisinsk forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant, tildelt EEH, og Midwestern University Office of Research og sponsede programmer Intramural Grant, tildelt KJL. Ytterligere støtte ble gitt av tilknyttede laboratorier og tilknyttet dermatologi. Vi takker Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel og Ali Zaidi for teknisk hjelp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA ThermoFisher Scientific 02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades ThermoFisher Scientific 50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps ThermoFisher Scientific 16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium ThermoFisher Scientific NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound ThermoFisher Scientific 50-363-579
Leica CM1950 Cryostat Leica Biosystems 14047743909
Frosted Microscope Slides ThermoFisher Scientific 12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit ThermoFisher Scientific 99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes ThermoFisher Scientific 03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab  ThermoFisher Scientific NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer ThermoFisher Scientific 50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer ThermoFisher Scientific 12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle ThermoFisher Scientific 121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific 13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140148
Gibco 1 M Hepes ThermoFisher Scientific 15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent ThermoFisher Scientific 1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 Abnova MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody Abnova ABX-144A
Anti MUC-1 antibody Santa Cruz Biotech sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246) Abcam Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin Molecular Probes  A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Molecular Probes  P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera Zeiss 4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera Olympus IX511F3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, M. Biorepositories: Building better biobanks. Nature. 486, 141-146 (2012).
  2. Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
  3. Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
  4. National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
  5. Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
  6. Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
  7. Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
  8. Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
  9. Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
  10. Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
  11. Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
  12. Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
  13. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
  14. Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
  15. Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
  16. Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
  17. Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
  18. Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
  19. Vaught, J. Developments in biospecimen research. Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).

Tags

Medisin utgave 123 klinikkbasert biorepository hudkreft Mohs-kirurgi squamouscellekarcinom vevbehandling vevsbank
Etablering av et klinisk-basert biorepository
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Belden, S. E., Uppalapati, C. K.,… More

Belden, S. E., Uppalapati, C. K., Pascual, A. S., Montgomery, M. R., Leyva, K. J., Hull, E. E., Averitte, R. L. Establishment of a Clinic-based Biorepository. J. Vis. Exp. (123), e55583, doi:10.3791/55583 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter