Summary
Кожные опухоли часто отбрасываются после микрографической хирургии Мооса. Здесь описывается протокол, который позволяет персоналу клинической поддержки эффективно обрабатывать и хранить образцы кожного новообразования ( например, плоскоклеточный рак, базально-клеточный рак и меланома) для последующих лабораторных исследований без вмешательства в клинические операции.
Abstract
За последние несколько лет заболеваемость раком кожи ( например, плоскоклеточный рак, базально-клеточная карцинома и меланома) увеличивается. Ожидается, что параллельно будет спрос на образцы кожного новообразования для биомедицинских исследований. Однако доступность тканей ограничена из-за стоимости создания биоресурсов и отсутствия протоколов, доступных для получения клинических образцов, которые не влияют на клинические операции. Был установлен протокол для сбора и обработки кожных опухолей и связанных с ними проб крови и слюны, которые оказывают минимальное влияние на обычные клинические процедуры в день операции Мооса. Образцы опухолей собираются и обрабатываются у пациентов, перенесших первый слой хирургической операции Мооса для биопсии, подтвержденной кожными злокачественными новообразованиями гистонолога Мооса. Прилегающая нормальная ткань собирается во время хирургического закрытия. Дополнительные образцы, которые могут быть собраны, - цельная кровь и щечные тампоны, Используя образцы ткани, которые обычно отбрасываются, был создан биоресурс, который предлагает несколько ключевых преимуществ, основываясь на клинике и лабораторных условиях. Они включают в себя широкий спектр собранных образцов; Доступ к дефинированным записям пациентов, включая отчеты о патологии; И для типичного донора - доступ к дополнительным выборкам во время последующих визитов.
Introduction
Исследования рака и биомаркеров основаны на поставке качественных образцов тканей человека, а ограниченное предложение затрудняет исследования 1 , 2 . Многие дерматологические исследования ограничены недостаточным предложением, изменчивым качеством и затратами, связанными с использованием тканей человека. Стоимость создания крупного специализированного биобанка оценивается примерно в 2 миллиона долларов 3 , и эти затраты ставят использование человеческих тканей недоступным для многих исследователей. Кроме того, процесс создания и хранения исследовательских образцов создает риск влияния на клинические операции и откладывание ухода за пациентом, если его не выполнить тщательно. Создан рентабельный, основанный на клиниках биоресурс, который фокусируется на образцах рака кожи, следуя рекомендуемым передовым методам и валидации образцов 4 , 5 , 6 .
Цель техники микрографической хирургии Мооса заключается в том, чтобы удалить всю раковую ткань, сохраняя при этом как можно больше здоровых тканей. Процедура включает постепенное удаление тонких слоев опухолевой ткани. Каждый последующий слой - его(После криосекции опухолевой ткани и проведения окрашивания H & E) дерматологом, чтобы определить, была ли удалена вся раковая ткань. Иссечение и исследование последующих слоев тканей выполняется, пока пациент остается в кабинете. Этот метод считается лучшим вариантом лечения для SCC 9 . В этот момент рана закрывается, и для улучшения исцеления и косметического эффекта часто вырезается смежная нормальная ткань (ANT). Таким образом, эта хирургическая процедура для удаления опухоли идеально подходит для сбора гистологически охарактеризованной ткани для будущих исследований.
Процедура закупок для получения опухолевой ткани, смежных нормальных тканей, слюны и образцов крови была разработана для минимального воздействия на обычные обязанности персонала ( рисунок 1 ). Медицинские помощники выполняют анализ крови при подготовке пациента к процедуре. После завершения процедуры Мооса M Ohs histotechnologist готовит дополнительные гистологические слайды образца и переносит ткань в биоресурсор. Затраты, связанные с созданием биоресурсов, включают покупку морозильных камер для морозильной камеры, создание скромного клинического лабораторного пространства и разработку программы отслеживания запасов.
Рисунок 1: Последовательность сбора проб и ответственный персонал. После регистрации пациента и достижения согласия пациента медицинский ассистент собирает трансбуккальный тампон и выполняет забор крови. Дерматолог и медицинский ассистент затем вырезают опухоль и закрывают рану, в течение которой собирают образцы SCC и ANT, соответственно. Специализированный лаборант обрабатывает кровь и разделы SCC и ANT образцов для культуры тканей, сохранения и входа в биоресурсы.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Разнообразие собранных проб позволяет использовать различные экспериментальные подходы ( рис. 2 ). Образцами, собранными у пациента, являются щечные тампоны (слюна также может быть собрана при необходимости), цельная кровь и иссеченная ткань. Буккальные тампоны и образец из цельной крови сохраняются без обработки для генотипирования и подбора тканей. Цельная кровь разделяется на лейкоциты (WBC) и фракции плазмы для будущих анализов. После обработки Мооса замороженную опухоль помещают непосредственно в жидкий азот и переносят в морозильник -80 ° C. Свежую, жизнеспособную опухолевую ткань и образцы ANT культивируют с использованием модификаций предыдущих методик 10 , 11 и затем замораживают. Во время сбора данных количество каждого типа выборки записывается в электронную таблицу до Программа отслеживания запасов для упрощения точной обработки ( таблица 1 ).
Рисунок 2: Схема сбора и обработки проб биоресурсов на базе клиник. Буккальный мазок и образец крови собираются у пациента и хранятся для последующего генотипирования и тканевого соответствия. Цельная кровь дополнительно обрабатывается для выделения белых кровяных клеток (WBC) и анализа CTC, а также для сбора плазмы и анализа жидкой биопсии. Ткань, вырезанная во время процедуры Мооса, гистологически обрабатывается в диагностических целях, после чего гистологические слайды могут быть использованы экспериментально для дальнейших иммуногистохимических анализов. При условии, что образец иссеченной ткани достаточно велик, часть свежей ткани удаляют и секционируют для выделения белков и РНК и для установления культивируемых клеточных линий.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Дата сбора: | |||||
| Пациент 1 | Пациент 2 | Пациент 3 | Пациент 4 | Пациент 5 | |
| Инициалы и дата рождения | |||||
| Цвет глаз | |||||
| Тип образца | |||||
| Пример местоположения | |||||
| слюна | |||||
| WДыра в крови | |||||
| плазма | |||||
| Опухоль жизнеспособна | |||||
| Ткань нормальная жизнеспособная | |||||
| Жидкий азот опухоли Мооса | |||||
| Ткань Нормальный жидкий азот | |||||
| Слайды |
Таблица 1: Контрольный список для записи выборочных наборов. Данные, отслеживаемые и регистрируемые с каждым собранным образцом, включают инициалы пациентов, дату рождения и цвет глаз (для опечатывания кожи), а также локатиНа удаление образца. Количество образцов слюны, объемы сбора крови и количество собранных жизнеспособных и консервированных образцов тканей также записываются в качестве ссылок для распределения для последующего использования. Нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Чтобы проверить процедуры сбора образцов, каждый тип образца был протестирован в последующих приложениях. Используя модификации предыдущих методик 12 , опухоль и ANT успешно используются в изоляции белков и РНК и могут потенциально использоваться для выделения ДНК. Жизнеспособные экспланты, созданные из срезов тканей, были оценены с помощью микроскопии, тогда как сохраненные гистологические слайды использовались для иммуногистохимии и иммунофлюоресценции.
Следуя описанному здесь протоколу, можно распространить эту модель на другие дерматологические клиники, другие типы опухолей (такие как меланома), И другие хирургические специальности и практики для обеспечения образцов человеческой ткани для многогранных исследований рака человека. Небольшие модификации этого протокола, вероятно, будут необходимы для других практик, но в принципе этот протокол применим к любой хирургической практике, которая рутинно отбирает образцы пациентов, собранные в ходе лечения пациента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на образцах тканей человека были одобрены Western IRB (WIRB Protocol # 20142461). Единственным критерием для сбора тканей для этих процедур является проверенный биопсией диагноз ГТК. В оригинальном протоколе IRB не было указано никаких критериев исключения, но образцы от пациентов с известным передаваемым кровью инфекционным заболеванием не использовались. Информированное согласие было получено до сбора кожных тканей, крови и слюны. Совет по обзору институтов в Среднем Западе одобрил работу по валидации с образцами биоресурсов на базе клиник в Университете Среднего Запада (AZ # 807).
1. Кожная обработка опухолевой ткани
ПРИМЕЧАНИЕ. Это должно быть выполнено гистонологом Мооса.
- Обработка тканевой карциномы свежей плоской клетки (SCC) для РНК и эксплантированной культуры
- После того, как ткань была вырезана хирургом Мооса, собрать 10-50 мг (≥10 мм 3 ПРИМЕЧАНИЕ. Это возможно только в том случае, если опухоль достаточно большая, чтобы можно было удалить образец размером 10-50 мг (≥10 мм 2 ) до проведения гистологической оценки, что является частью процедуры Mohs. Если опухоль не достаточно велика, чтобы можно было удалить как минимум 2 мм 3 , не начинайте обработку для РНК (пропустите шаг 5).
- Перенесите жизнеспособную ткань в пробирку с 1,5 мл метки, содержащую культуральную среду (смесь 1: 1 DMEM: F-12 Ham, 25 мМ HEPES, 100 IU / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) с помощью пинцета и убедитесь, что Ткань полностью погружена в среду. Перед дополнительной обработкой храните эту пробирку при температуре 4 ° C.
- Используйте ткань для выделения и анализа экспрессии РНК (см. Шаг 5) и / или установкиКультивирования эксплантов (см. Шаг 6) в течение 24 часов.
- Поместите остальную часть образца опухоли, который был удален у пациента (шаг 1.1.1), на держателе ткани криостата (или «патроне»). Вставьте ткань в соединение оптимальной температуры резания (OCT), замораживая ткань внутри держателя, чтобы обеспечить завершение гистологии Мооса и для подготовки дополнительных гистологических слайдов для экспериментального анализа.
- Подготовка гистологических препаратов
- Отрежьте срезы ткани толщиной 7 мкм с использованием криостата и создайте два (или более) слайда для каждого образца опухоли. Убедитесь, что каждый слайд содержит до трех разделов полной опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ. Один из двух слайдов будет окрашен с помощью H & E гистонологом Mohs, а дополнительный слайд (ы) можно обработать с помощью анализа IF, IHC или FISH. - Поместите слайды в ацетон на 1-2 с для фиксации ткани. Установите эти слайды в сторону для просушки. Не H & EПятна или покровное стекло для использования в будущих иммунофлюоресценции (IF), иммуногистохимия (IHC) или флуоресцентный анализ in situ гибридизации (FISH), в зависимости от экспериментального протокола.
- Отрежьте срезы ткани толщиной 7 мкм с использованием криостата и создайте два (или более) слайда для каждого образца опухоли. Убедитесь, что каждый слайд содержит до трех разделов полной опухоли.
- Обработка ткани пост-Мооса
- Как только обработка Мооса будет завершена (шаги 1.1-1.2), работайте в камере криостата и вытащите образец из среды для впитывания криогенных веществ и поместите ткань в промаркированную криогенную трубку.
- Помещенный маркированный флакон в жидком азоте прежде, чем ткань оттаяла. Если образцы должны использоваться для анализа белка и / или ДНК, они могут быть перенесены в жидкий азот или замораживатель -80 ° С в течение нескольких минут для хранения для будущей экспрессии белка и анализа мутации ДНК (см. Шаги 4-5) ,
ПРИМЕЧАНИЕ. Если от образца после Мооса требуется интактная РНК, важно сохранить образец замороженным во время удаления из среды для криосадочного впитывания. Если чрезмерная забота неНа этом этапе образец после Мооса следует зарезервировать для анализа белка и / или ДНК.
- Переработка свежего ANT
- Во время закрытия Мооса, получите АНТ от хирурга Мооса.
- Удалите равное или большее количество ANT, как было собрано из образца SCC (см. Выше), с апикальной стороны нормальной ткани и перенесите его в пробирку с 1,5 мл метки, содержащую культуральную среду (смесь DMEM: F- 12 с добавлением 25 мМ HEPES, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) с использованием пинцета.
- Полностью погрузить ткань в ту же культуральную среду и хранить при 4 ° С до последующей обработки (см. Шаги 4-6).
2. Кровь, слюна и буккальная обработка мазка
- Получают приблизительно 10 мл крови в пробирках для сбора ЭДТА через венопунктуру.
- Перенесите кровь из приемных трубок в стерильную 15- или 50 мл центрифужную пробирку, Удалить около 200 мкл в 1,5 мл криогенной трубки, избегая пузырей; Храните этот образец цельной крови при -80 ° C, который будет использоваться для будущего генотипирования и тканевого соответствия, если это необходимо.
- Вращайте оставшуюся кровь при 1000 мкг в течение 30 мин и следуйте стандартным процедурам для сбора фракции плазмы.
- Алиготе плазмы в 1 мл приращения в 1,5 мл криогенных труб и хранить при температуре -80 ° C для использования во время будущих анализов жидкой биопсии.
- Используйте стерильный тампон, чтобы получить образец щечного тампона, и храните тампон в стерильной пробирке при комнатной температуре.
- Если необходимо, возьмите пробу слюны и храните в стерильной пробирке при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти образцы могут быть использованы для будущего генотипирования и тканевого соответствия, если это необходимо.
3. Ведение документации образцов
- Передайте информацию из контрольного перечня образцов пациентов в базу данных биоресурсов. Включить информацию о пациенте и диагнозНос из таблицы пациентов.
- Напечатайте этикетки со штрих-кодом для каждого образца и запишите каждую в базу данных, чтобы связать каждый собранный образец с данными пациента.
- Запишите распределение неидентифицированных образцов в базе данных биоресурсов до передачи образцов в исследовательскую лабораторию.
4. Выделение белка и анализ вестерн-блоттинга
- Поместите каждый образец ткани (SCC и / или ANT) в пробирку, содержащую 500 мкл буфера для лизиса клеток, содержащего ингибиторы протеазы на 100 мг ткани для лизиса ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мы использовали буфер для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA), состоящий из 50 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,5% дезоксихолата натрия, 1,0% NP-40 и 0,1% SDS. Могут использоваться другие буферы для лизиса клеток. - Гомогенизируйте ткани с использованием тканевого гомогенизатора в течение 5 мин с интервалом 20 с при 4 ° С. Спиновые образцы при 21000 xg и 4 ° C в течение 20 минут и собирают супернатант, содержащий белок, в свежеебыть. Повторно открутите супернатант, используя те же условия, и соберите конечный супернатант в свежую пробирку.
- Электрофорез 30-50 мкг белка из каждого образца с использованием 4-20% SDS-полиакриламидного градиентного геля. При необходимости окрасьте гель с помощью Coomassie Blue, чтобы визуализировать полосы белка.
- Если необходим вестерн-блот анализ экспрессированных белков, перенесите белки из геля в мембрану из поливинилидендифторида (PVDF), следуя стандартным протоколам. После переноса Ponceau окрашивает PVDF мембрану для визуализации белковых полос, если это необходимо.
- Заблокируйте PVDF-мембрану и зонд, чтобы обнаружить интересующие белки согласно стандартным протоколам. Используйте первичные антитела, специфичные к интересующему белку (белкам), наряду с соответствующими вторичными антителами, специфичными к первичным антителам, в концентрациях, рекомендованных производителем для вестерн-блот-анализа.
- Выявление зондированной мембраны с использованием хемилюминесцентной подложки и изображение мембраны с использованием imagiНг системы.
5. Выделение РНК и количественная полимеразная цепная реакция (qPCR)
- Сразу же поместите свежие образцы тканей (SCC и / или ANT) в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую раствор для стабилизации РНК, и поместите образцы ткани после Мооса в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую раствор для замороженных тканей, в соответствии с рекомендациями производителя. Убедитесь, что ткань полностью погружена. Храните эти образцы при температуре -80 ° C до использования.
- Удалить образцы РНК от -80 ° C и разморозить на льду. Перенесите ткань в новую пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл буфера для экстракции РНК (фенол / гуанидинтиоцианат) на 50-100 мг ткани.
- Lyse тканей с использованием тканевого гомогенизатора. Выполните шесть циклов гомогенизации с последующим периодом охлаждения образца; Каждый цикл состоит из 20 с гомогенизации при 4 ° C и 40 секунд охлаждения. После гомогенизации инкубируйте образец в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавить 0,2Мл хлороформа на 1 мл буфера для экстракции РНК и энергично встряхивают пробирку вручную в течение 15 с. Инкубируйте в течение 2-3 мин при комнатной температуре.
- Отжимайте образцы при 12000 xg и 4 ° C в течение 15 минут. Удалите водную фазу образца и поместите ее в новую 1,5 мл пробирку.
- Добавить 0,5 мл 100% изопропанола на 1 мл буфера для экстракции РНК, используемого на стадии 5.2, в водную фазу и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если ожидается, что выход РНК будет низким ( т.е. начальный объем ткани меньше 10 мг), образцы могут осаждаться в течение ночи при -80 ° C. Кроме того, на этапе осаждения изопропанола можно добавить 5 мкг гликогена без РНКазы на 500 мкл буфера для экстракции РНК для улучшения выхода РНК. - Отжимайте образец при 12000 xg при 4 ° C в течение 10 минут. Удалить надосадочную жидкость и промыть гранулы 1 мл 75% этанола.
- Медленно встряхните образец и затем поверните его на 7500 xg и 4 °С в течение 5 мин. Отменить промывку и высушить на воздухе в течение 5-10 мин.
- Ресуспендируют гранулу РНК в 20 мкл воды, свободной от РНКазы.
- Если необходимо, очистите каждый образец РНК с помощью набора для очистки РНК, следуя рекомендациям изготовителя.
ПРИМЕЧАНИЕ. Малые РНК будут потеряны из образца, если этот шаг будет выполнен.
- Если необходимо, очистите каждый образец РНК с помощью набора для очистки РНК, следуя рекомендациям изготовителя.
- Электрофорез в 1 мкг образца с использованием 1,2% формальдегида-MOPS агарозного геля для анализа качества РНК.
ПРИМЕЧАНИЕ. В качестве альтернативы, анализируйте образцы, используя биоанализатор, чтобы получить RIN номер 13 . - Обратный транскрипт РНК кДНК с использованием протокола обратной транскрипции для qPCR-анализа интересующих мишеней мРНК (или miRNAs).
6. Тканевые культуры эксплантатов
- Стерилизовать иссеченную ткань до культивирования путем погружения ткани в 70% этанола.
- Поместите ткань на предметное стекло или блюдо и добавьте достаточное количество питательной среды (смесь 1: 1 DMEM: Ham & #39; s F-12 с добавлением 10% FBS, 25 мМ HEPES, 100 IU / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) для покрытия ткани (для предотвращения высыхания ткани). Тщательно разрежьте ткань на фрагменты (<1 мм 3 ), используя лезвие скальпеля.
- Передайте фрагменты ткани в 35-миллиметровую чашку для культуры ткани и добавьте приблизительно 20 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS) поверх каждого фрагмента.
- Оставьте блюдо открытым в капот культуры в течение 20-30 минут, или до почти сухой.
- Добавить 1 мл культуральной среды (смесь 1: 1 DMEM: F-12 Ham с добавлением 10% FBS, 25 мМ HEPES, 100 IU / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) в каждую чашку и инкубировать при 37 ° C в 5% CO 2 . Субкультура или субклонировать культуры, если это необходимо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Опухоль и ANT успешно использовались в изоляции белка и тестировались с помощью Вестерн-блоттинга. Как показано на рисунке 3 , маркеры кожной чешуйчатой плоскоклеточной карциномы (Muc1 14 , FHL-1 15 и p40 16 , 17 ) могут быть обнаружены в образцах пациентов, собранных и хранящихся в нашем биоресурсоре, основанном на клинике.
Рисунок 3: Анализ белков, извлеченных из ANT и SCC. Общий белок выделяли из образцов ANT и SCC, а экспрессию известных маркеров для SCC исследовали с помощью Вестерн-блоттинга. Показаны репрезентативные вестерн-блоты муцина 1 (MUC1), фактора H Like-1 (FHL-1) и p40 (панель B). мольбаНажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
РНК, выделенная с использованием вышеуказанных методов, была протестирована гель-электрофорезом, qPCR и анализом целостности РНК. На рисунке 4 показаны два образца пациентов, из которых была выделена высококачественная интактная РНК. РНК подходит для всех последующих приложений.
Рисунок 4: Анализ целостности РНК с использованием биоанализа. Оценка размера и целостности РНК гель-электрофорезом (панель А). Для каждого образца генерировали номер целостности РНК (RIN) на основании электрофоретического следа образца РНК, включая отношение рибосомальной РНК и наличие или отсутствие продуктов разложения (панель В). RIN «10» представляет собой образец идеальной РНК без каких-либо продуктов разложения, тогда как «1» обозначает полностью деградированную саmple. Денситометрические профили полос наносят на график как флуоресцентные единицы (FU) в сравнении с нуклеотидами (nt) (панель C) для образцов репрезентативной РНК из SCC и ткани пациента ANT. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Жизнеспособные экспланты, созданные из срезов ткани, были оценены с помощью микроскопии ( рис. 5А ). Эти культуры эксплантов, полученные из образцов опухоли и ANT, представляют собой смешанные культуры кератиноцитов и фибробластов. Эти культуры могут быть субкультивированы или использованы для развития клеточной линии в будущем. Сохраненные гистологические слайды использовались для иммуногистохимии и иммунофлюоресценции. Показано на рисунке 5B , образец SCC показывает положительное окрашивание для маркера переходного эпителия к мезенхимуму в SCC 18 .
Рисунок 5: Культура эксплантатов и окрашивание IFC срезов SCC. Фазоконтрастное изображение эксплантата ткани плоскоклеточного рака карциномы (панель А, шкала шкалы = 50 мкм) и срезов ткани, собранных как часть микрографической хирургии Мооса, окрашенных анти-pSnail / Slug первичных антител (панель B, шкала шкалы = 25 мкм ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Мы экспериментально установили, что ткань может храниться при 4 ° C в течение 24-48 часов до выделения РНК (стадия 5) или культивирования эксплантатов (этап 6) без влияния на результаты. Выход или целостность РНК, оцениваемые с помощью гель-электрофореза или биоанализатора и номера RIN, не подвергаются риску. Кроме того, культуры эксплантатов легко получить, используя ткань, хранящуюся при 4 ° С для тиS продолжительность времени. Это обеспечивает повышенную гибкость при передаче проб между клиникой и исследовательской лабораторией. Поскольку изоляция РНК и культура эксплантов выполняются в исследовательской лаборатории, а не в клинике, эта функция делает биоресурсор на базе клиник более надежной моделью, чем мы ожидали ранее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Насколько известно автору, этот протокол является первым в своем роде, который фокусируется на клинических закупках образцов кожных тканей как с точки зрения затрат, так и с быстрым подходом. Пациенты, проходящие микрохирургию Мооса, как правило, назначаются в определенные периоды времени, и их сбор ограничивается этими периодами. Сбор образцов включает в себя усилия медицинского ассистента, вовлеченного в лечение пациентов, гистонолога Мооса, который обрабатывает образцы опухоли, и назначенного сотрудника лаборатории, который обрабатывает пробы и обрабатывает кровь.
Тщательная координация между тремя членами коллекторской группы ( то есть медицинским ассистентом, гистонозом Мооса и лаборантом), мы обнаружили, что существующий медицинский ассистирующий персонал может выполнить дополнительные задачи, связанные с сбором 3-5 образцов тканей В день без каких-либо видимых отсрочек в клинических операциях. Получение согласия пациента И сбор буккальных мазков и крови завершается в течение обычных периодов ожидания, связанных с процедурой микрохирургии Мооса. Помимо принятия решения о том, как образец должен быть обработан, задачи, за которые отвечает гистонолог Мооса, завершаются в конце обработки Mohs образцов пациентов и, как правило, добавляют примерно 30 мин к ежедневному графику. Как правило, один из сотрудников клиники несет ответственность за маркировку и обработку образцов крови и за любую передачу и ввод образцов в базу данных. В зависимости от количества обработанных образцов эти обязанности могут потребовать значительного времени от существующих обязанностей; Таким образом, сбор образцов должен проводиться только тогда, когда имеется достаточное количество персонала лаборатории. В частности, если в течение одного дня будет собрано более 5 проб или если у пациентов будет собрано несколько проб крови, потребуется несколько часов дополнительных усилий со стороны лаборанта.
Jove_content "> В дни сбора медицинские помощники (MA) получают согласие пациентов на пожертвования тканей.Материал впоследствии получает щечный тампон (и слюну, если необходимо) и собирает кровь для обработки лабораторным персоналом. Пациент после сбора этих образцов, поэтому с точки зрения пациента, оставшаяся часть посещения клиники остается неизменной (хотя их просят сдавать кровь во время любого последующего визита). В настоящее время мы можем оценить, что 70% пациентов согласны Пожертвовать ткани, причем ~ 30% этих пациентов также сдавали кровь, 30% отказываются от участия. В настоящее время только пациенты с подтвержденной биопсией диагностикой рака включаются в биоресурсы. Пациенты с известным передаваемым кровью инфекционным заболеванием исключаются ,Сотрудник лаборатории несет ответственность за координацию с двумя другими членами группы сбора и за регистрацию образцов, которые собраны (Таблица 1). ПослеN первоначальный сбор образцов, заполненная форма согласия, кровь и трансбуккальные тампоны передаются сотруднику лаборатории, и записываются инициалы донора, дата рождения и другая соответствующая информация, такая как тип образца. Это позволяет регистрировать числа и типы образцов, собранных с каждым пациентом в процессе сбора. Блок-схемы, суммирующие обработку обеих тканей SCC ( рисунок 6 ) и ANT (рисунок 7), являются полезными инструментами для обучения новых сотрудников процедурам сбора.
Рисунок 6: Блок-схема, определяющая обработку образцов SCC. После удаления опухоли оценивают размер образца. Если образец ≤ 2 мм 3 , весь образец используется для переработки Мооса, так как оценка чистых полей (показательУдаление полной опухоли) является высшим приоритетом. После переработки Mohs любая оставшаяся ткань замораживается в жидком азоте и переносится в биоресурсор. Если образец достаточно большой, так что часть ткани <> 2 мм 3 может быть удалена, эту часть собирают и помещают в пробирку, содержащую среду для культивирования клеток, а оставшуюся часть используют для обработки Мооса и хранят, как указано выше. Часть образца, удаленную в клеточную культуральную среду, далее сегментируют с удалением фрагмента ~ 0,5 мм 3 и используют для установления линии культуры клеток; Оставшийся фрагмент ткани переносится в биоресурсор для последующего анализа белка и экспрессии генов. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
er.within-страница = "1"> 
Рисунок 7: Блок-схема, определяющая обработку образцов ANT. Во время закрытия Мооса часть смежной нормальной ткани (ANT) удаляется и собирается хирургом Мооса. Если размер образца составляет ≤ 2 мм 3 , весь образец помещают в криогенную трубку и замораживают в жидком азоте перед переносом в биоресурсор. Если образец> 2 мм 3 , весь образец сначала помещают в пробирку, содержащую среду для культивирования клеток. Затем образец дополнительно разделяют на фрагмент размером ~ 0,5 мм 3 , который используется для установления линий клеточной культуры. Оставшийся участок ткани переносится в биоресурсор для хранения для последующего анализа белка и экспрессии генов.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Этот протокол разработан, чтобы минимизировать различия между выборками в биорекордере. Координация и эффективная коммуникация между персоналом клиники и между клиниками и всем лабораторным персоналом важны для минимизации изменчивости и максимального достижения высококачественных ДНК, РНК и белка из тканей. Несмотря на то, что ДНК и белок в тканях являются надежными, если требуется РНК, важно сохранять холодные ткани и в соответствующей среде во время сбора, транспортировки и обработки, чтобы сохранить целостность РНК. Точное ведение записей также имеет жизненно важное значение для связывания образцов пациентов с их историей и диагнозом, поскольку эта информация часто необходима при анализе результатов из нижестоящих приложений.
С ростом интереса к персонализированной медицине и биоМаркерных исследований, недавно был создан ряд биорепозиторий. Они обычно связаны с больничными клиниками в крупных академических центрах и требуют значительных затрат на установку и эксплуатацию 2 , 8 , 19 . Создание на базе клиники биоресурса для образцов кожного рака, созданных в рамках повседневной практики, имеет несколько ключевых преимуществ по сравнению с другими биорепозиториями. Во-первых, с одной коллекцией и узлом обработки образцов различия в обработке образцов, которые могут нарушить работу нижестоящих приложений, сводятся к минимуму. Во-вторых, поскольку эти пожертвованные образцы взяты из стабильной популяции пациентов, доступ к де-идентифицированным медицинским картам и данным о результатах лечения пациентов не имеет аналогов. Эти данные могут быть анонимизированы и перенесены из схемы пациентов в базу данных биоресурсов во время сбора образцов или во время последующего посещения. В-третьих, с лояльной базой пациентов,Inic-based biorepository может собирать несколько выборок от одного и того же пациента, набор образцов, не часто получаемый в других настройках. Одним из ограничений этого протокола является то, что он был оптимизирован для кожных проб, полученных с помощью микрографической хирургии Мооса, и, возможно, его необходимо модифицировать для других типов тканей или клинических процедур.
В целом, одной из ключевых целей биоресурса является предоставление широкого спектра проб от одного и того же донора, чтобы исследователи могли задавать широкий спектр вопросов, в частности, для разработки жидких биопсий и маркеров рака. В частности, способность сопоставлять гистологию опухоли и экспрессию биомаркеров на уровне мРНК и белка с образцами плазмы, а также способность ссылаться на данные о результатах лечения пациента, создает уникальный набор данных. Мы надеемся, что модель биоресурсов на базе клиник может быть использована для облегчения нехватки образцов пациентов в биомедицинских исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана фондами из Колледжа медико-санитарных наук Университета штата Мидвестерн, предоставленными EEH, и Канцелярией исследований и спонсируемых программ Университета Среднего Запада, которая была присуждена KJL. Дополнительная поддержка была оказана аффилированными лабораториями и аффилированной дерматологией. Мы благодарим Сару Потехен, Джейми Барто, Стефани Фокса, Коди Джоржана, Стейси Шимке, Хезер Кисел и Али Заиди за их техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA | ThermoFisher Scientific | 02-685-2B | |
| Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades | ThermoFisher Scientific | 50-949-411 | |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | ThermoFisher Scientific | 16-100-110 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-138 | |
| Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium | ThermoFisher Scientific | NC9791321 | |
| Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound | ThermoFisher Scientific | 50-363-579 | |
| Leica CM1950 Cryostat | Leica Biosystems | 14047743909 | |
| Frosted Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-343 | |
| Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 99-900-01 | |
| Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes | ThermoFisher Scientific | 03-337-7X | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| Boca Scientific BuccalT-Swab | ThermoFisher Scientific | NC9679349 | |
| Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer | ThermoFisher Scientific | 50-195-822 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | PI78443 | |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 05-401-203 | |
| Pellet Morter Cordless Homogenizer | ThermoFisher Scientific | 12-141-3 | |
| RNAse Free Pellet Pestle | ThermoFisher Scientific | 121-141-364 | |
| Forma SteriCycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 13-998-089 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | SH30071.02 | |
| Gibco Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12-634-028 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140148 | |
| Gibco 1 M Hepes | ThermoFisher Scientific | 15-630-130 | |
| Nunc Cell Culture 35 mm with Vent | ThermoFisher Scientific | 1256591 | |
| Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 | Abnova | MAB12583 | |
| Anti-p40 (p63 delta) antibody | Abnova | ABX-144A | |
| Anti MUC-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-7313 | |
| Anti-Snail + Slug (phospho S246) | Abcam | Ab63568 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 568 Phallodin | Molecular Probes | A12380 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P36941 | |
| Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera | Zeiss | 4300009901 | |
| Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera | Olympus | IX511F3 |
References
- Baker, M.
- Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
- Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
- National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
- Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
- Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
- Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
- Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
- Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
- Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
- Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
- Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
- Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
- Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
- Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
- Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
- Vaught, J.
