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Medicine

Establecimiento de un Biorepository basado en la Clínica

Published: May 29, 2017 doi: 10.3791/55583
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3, 1
1Affiliated Dermatology & Affiliated Laboratories, Midwestern University Osteopathic Postdoctoral Training Institute, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Arizona College of Osteopathic Medicine, Midwestern University, 3Biomedical Sciences Program, College of Health Sciences, Midwestern University

Summary

Los tumores cutáneos se descartan a menudo después de la cirugía micrográfica de Mohs. Se describe aquí un protocolo que permite al personal de soporte clínico procesar y almacenar eficazmente muestras de tumores cutáneos ( por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular y melanoma) para aplicaciones de laboratorio aguas abajo sin interferir con las operaciones clínicas.

Abstract

La incidencia de cáncer de piel ( por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular y melanoma) ha aumentado en los últimos años. Se espera que haya una demanda paralela de muestras tumorales cutáneas para estudios de investigación biomédica. Sin embargo, la disponibilidad de tejidos es limitada debido al costo de establecer un depósito biológico y la falta de protocolos disponibles para obtener muestras clínicas que no interfieran con las operaciones clínicas. Se estableció un protocolo para recolectar y procesar el tumor cutáneo y las muestras asociadas de sangre y saliva que tienen un impacto mínimo en los procedimientos clínicos de rutina en la fecha de la cirugía de Mohs. Las muestras tumorales se recogen y procesan a partir de pacientes sometidos a su primera capa de cirugía Mohs para neoplasias cutáneas probadas por biopsia por el histotecnólogo Mohs. El tejido normal adyacente se recoge en el momento del cierre quirúrgico. Las muestras adicionales que se pueden recoger son hisopos de sangre entera y bucal. Mediante la utilización de muestras de tejido que normalmente se desechan, se generó un depósito biológico que ofrece varias ventajas clave basándose en la clínica frente al laboratorio. Estos incluyen una amplia gama de muestras recogidas; Acceso a los registros de pacientes no identificados, incluidos los informes de patología; Y, para el donante típico, el acceso a muestras adicionales durante las visitas de seguimiento.

Introduction

La investigación sobre el cáncer y los biomarcadores se basa en un suministro de muestras de tejido humano de calidad, y la oferta limitada ha obstaculizado la investigación 1 , 2 . Muchos estudios dermatológicos están limitados por la oferta inadecuada, la calidad variable y los costos asociados con el uso de tejido humano. El costo de establecer un gran biobanco dedicado se ha estimado en aproximadamente dos millones de dólares 3 , y estos costos colocan el uso de tejido humano fuera del alcance de muchos investigadores. Además, el proceso de generación y almacenamiento de muestras de investigación plantea el riesgo de afectar las operaciones clínicas y retrasar la atención al paciente si no se ejecuta cuidadosamente. Se ha establecido un biorepository rentable, basado en clínicas, que se centra en las muestras de cáncer de piel siguiendo las mejores prácticas recomendadas y la validación de muestras 4 , 5 , 6 .

7 , 8 .

El objetivo de la técnica de cirugía micrográfica Mohs es asegurar que todo el tejido canceroso se elimina mientras se preserva el mayor número posible de tejidos sanos. El procedimiento implica la eliminación progresiva de capas delgadas de tejido tumoral. Cada capa sucesiva es suExaminado tologically (después de cryosectioning el tejido del tumor y de realizar la mancha de H & E) por un dermatologist para determinar si todo el tejido del cáncer se ha quitado. La extirpación y examen de capas posteriores de tejidos se realiza mientras el paciente permanece en la oficina. Esta técnica se considera la mejor opción de tratamiento para SCC 9 . En este punto, la herida se cierra y, para mejorar la cicatrización y la apariencia estética, el tejido normal adyacente (ANT) es frecuentemente extirpado. Por lo tanto, este procedimiento quirúrgico para extirpar un tumor es idealmente adecuado para recoger tejidos histológicamente caracterizados para futuros estudios.

El procedimiento de adquisición para obtener tejido tumoral, tejido adyacente normal, saliva y muestras de sangre ha sido diseñado para tener un impacto mínimo en las tareas normales del personal ( Figura 1 ). Asistentes médicos realizar la sangre dibuja mientras se prepara al paciente para el procedimiento. Después de completar el procedimiento de Mohs, el M Ohs histotechnologist prepara más diapositivas histológicas de la muestra y transfiere el tejido al biorepository. Los costos asociados con el establecimiento del depósito biológico incluyen la compra de congeladores de crioconservación, la creación de un espacio de laboratorio clínico modesto y el desarrollo de un programa de seguimiento de inventario.

Figura 1
Figura 1: Secuencia de recolección de muestras y personal responsable. Tras el ingreso del paciente y el logro del consentimiento del paciente, el asistente médico recoge un hisopo bucal y realiza un drenaje de sangre. El dermatólogo y el asistente médico luego excisan el tumor y cierran la herida, durante el cual se recogen las muestras de SCC y ANT, respectivamente. Un técnico de laboratorio dedicado procesa la sangre y secciona las muestras de SCC y ANT para el cultivo de tejidos, la preservación y la entrada en el biorepository.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La diversidad de muestras recogidas permite una variedad de enfoques experimentales ( Figura 2 ). Las muestras recogidas del paciente son hisopos bucales (la saliva también se puede recoger si es necesario), sangre entera y tejido extirpado. Los hisopos bucales y una muestra de la sangre entera se guardan, sin procesar, para el genotipado y el emparejamiento de tejidos. La sangre entera se separa en glóbulos blancos (WBC) y fracciones de plasma para análisis futuros. Después del procesamiento de Mohs, el tumor congelado se coloca directamente en nitrógeno líquido y se transfiere a un congelador a -80ºC. Las muestras frescas, viables de tejido tumoral y de ANT se cultivan usando modificaciones de las técnicas anteriores 10 , 11 y luego se crioconservan. Durante la recolección, el número de cada tipo de muestra se registra en una hoja de cálculo antes de El programa de seguimiento de inventarios para facilitar el procesamiento preciso ( Tabla 1 ).

Figura 2
Figura 2: Esquema de la recolección y procesamiento de muestras de biorrepositores basados ​​en la clínica. Se recoge un hisopo bucal y una muestra de sangre del paciente y se almacena para genotipificación y emparejamiento de tejido aguas abajo. La sangre entera se procesa posteriormente para el aislamiento de glóbulos blancos (WBC) y el análisis de CTC, así como para la colección de plasma y el análisis de biopsia de líquido. El tejido excisado durante el procedimiento de Mohs se procesa histológicamente para fines de diagnóstico, después de lo cual las diapositivas histológicas pueden usarse experimentalmente para análisis inmunohistoquímicos adicionales. Siempre que la muestra de tejido extirpada sea lo suficientemente grande, una porción de tejido fresco se elimina y secciona para aislamiento de proteína y ARN y para el establecimiento de líneas celulares cultivadas.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fecha de colección:
Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4 Paciente 5
Iniciales y fecha de nacimiento
Color de los ojos
Tipo de ejemplo
Ubicación de la muestra
Saliva
WAgujero de sangre
Plasma
Tumor Viable
Tejido Normal Viable
Tumor Mohs Nitrógeno Líquido
Nitrógeno líquido normal del tejido
Diapositivas

Tabla 1: Lista de verificación para registrar las colecciones de muestras. Los datos rastreados y registrados con cada muestra recogida incluyen iniciales del paciente, fecha de nacimiento y color de los ojos (para la tipificación de la piel), así como la locatiEn la extracción de la muestra. El número de muestras de saliva, los volúmenes de recolección de sangre y el número de especímenes de tejidos viables y conservados recolectados también se registran como referencias para asignaciones a usos posteriores. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Para validar los procedimientos de recolección de muestras, cada tipo de muestra se ha probado en aplicaciones descendentes. Utilizando modificaciones de las técnicas anteriores 12 , el tumor y la ANT se han utilizado con éxito en el aislamiento de proteínas y ARN y pueden usarse potencialmente para aislar el ADN. Los explantes viables establecidos a partir de las secciones de tejido se han evaluado mediante microscopía, mientras que las diapositivas histológicas almacenadas se han utilizado para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia.

Siguiendo el protocolo descrito aquí, es posible extender este modelo a otras clínicas de dermatología, otros tipos de tumores (como el melanoma), Y otras especialidades y prácticas quirúrgicas para proporcionar muestras de tejido humano para la investigación multifacética en cánceres humanos. Es probable que algunas modificaciones de este protocolo sean necesarias para otras prácticas pero, en principio, este protocolo es aplicable a cualquier práctica quirúrgica que descarte rutinariamente muestras de pacientes recolectadas durante el tratamiento del paciente.

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Protocol

Toda la experimentación en muestras de tejidos humanos fue aprobada por Western IRB (WIRB Protocol # 20142461). El único criterio para la recolección de tejidos para estos procedimientos es un diagnóstico de SCC probado con biopsia. No se describieron criterios de exclusión en el protocolo IRB original, pero no se utilizaron muestras de pacientes con una enfermedad transmisible transmitida por la sangre conocida. El consentimiento informado se obtuvo antes de la recolección de tejido cutáneo, sangre y saliva. La Junta de Revisión Institucional del Medio Oeste aprobó el trabajo de validación con muestras de biorepositores basadas en clínicas en la Universidad de Midwestern (AZ # 807).

1. Tratamiento de tejidos tumorales cutáneos

NOTA: Esto debe ser realizado por un histotechnologist de Mohs.

  1. Procesamiento de tejido de carcinoma de células escamosas (SCC) para ARN y cultivo de explosivos
    1. Después de que el tejido ha sido extirpado por el cirujano de Mohs, recolectar de 10 a 50 mg (≥ 10 mm 3 NOTA: Esto sólo es posible si el tumor es lo suficientemente grande para permitir que se elimine una muestra de 10-50 mg (≥ 10 mm 2 ) antes de la evaluación histológica, que es parte del procedimiento de Mohs. Si el tumor no es lo suficientemente grande como para permitir que se elimine un mínimo de 2 mm 3 , no proceda con el procesamiento de ARN (salte el paso 5).
    2. Transferir el tejido viable a un tubo de 1,5 ml marcado que contenga medio de cultivo (mezcla 1: 1 de DMEM: F-12 de Ham, HEPES 25 mM, penicilina 100 UI / ml y estreptomicina 100 mu g / ml) El tejido está completamente sumergido en el medio. Guarde este tubo a 4 ° C antes del procesamiento adicional.
    3. Utilice el tejido para el aislamiento de ARN y el análisis de expresión (ver paso 5) y / o el establecimientoDe un cultivo de explante (véase el paso 6) en 24 h.
    4. Colocar el resto de la muestra de tumor que se retiró del paciente (paso 1.1.1) en un soporte de tejido de criostato (o "mandril"). Incorpore el tejido en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT), congelando el tejido dentro del soporte, para permitir la terminación de la histología de Mohs y para la preparación de diapositivas histológicas adicionales para el análisis experimental.
  2. Preparación de diapositivas histológicas
    1. Corte cortes de tejido de 7 μm de espesor usando un criostato y cree dos (o más) diapositivas para cada muestra de tumor. Asegúrese de que cada diapositiva contenga hasta tres secciones del tumor completo.
      NOTA: Una de las dos diapositivas será teñida usando H & E por el histotecnólogo de Mohs, y las diapositivas adicionales pueden ser procesadas con análisis IF, IHC o FISH.
    2. Coloque los portaobjetos en acetona durante 1-2 s para fijar el tejido. Establezca estas diapositivas a un lado para secar. No H & EMancha o cubreobjetos la diapositiva que se utilizará para la futura inmunofluorescencia (IF), inmunohistoquímica (IHC), o análisis de hibridación in situ fluorescente (FISH), dependiendo del protocolo experimental.
  3. Procesamiento de Tejido Post-Mohs
    1. Una vez que se ha completado el procesado de Mohs (pasos 1.1-1.2), trabaje en la cámara de criostato y extraiga la muestra del medio de incrustación criogénica y coloque el tejido en un tubo criogénico marcado.
    2. Coloque el vial marcado en nitrógeno líquido antes de que el tejido se haya descongelado. Si se van a utilizar muestras para el análisis de proteínas y / o ADN, se pueden transferir a nitrógeno líquido oa un congelador de -80 ° C en unos pocos minutos para almacenarlos para la futura expresión de proteínas y el análisis de mutaciones de ADN (véanse los pasos 4-5) .
      NOTA: Si se desea un ARN intacto a partir de la muestra posterior a Mohs, es esencial mantener la muestra congelada durante la eliminación del medio de incrustación de crio. Si no se ejerce una extremaEn este paso, la muestra post-Mohs debe reservarse para análisis de proteínas y / o ADN.
  4. Procesamiento de Fresh ANT
    1. En el momento del cierre de Mohs, obtener ANT del cirujano Mohs.
    2. Eliminar una cantidad igual o mayor de ANT tal como se recolectó de la muestra de SCC (véase más arriba) del lado apical del tejido normal y transferirlo a un tubo de 1,5 ml marcado que contenía medio de cultivo (mezcla 1: 1 de DMEM: Ham F- 12 suplementado con HEPES 25 mM, penicilina 100 UI / ml y estreptomicina 100 mu g / ml) usando pinzas.
    3. Sumerja completamente el tejido en el mismo medio de cultivo y almacénelo a 4 ° C hasta su posterior procesamiento (vea los pasos 4-6).

2. Tratamiento de sangre, saliva y frotis bucal

  1. Obtenga aproximadamente 10 ml de sangre en tubos de recolección de EDTA mediante venipunción.
  2. Transferir la sangre de los tubos de recolección a un tubo estéril de centrífuga de 15 ó 50 ml. Eliminar aproximadamente 200 μl en un tubo criogénico de 1,5 ml, evitando burbujas; Almacene esta muestra de sangre entera a -80 ° C, para ser usada para futura genotipificación y afinación de tejidos, si es necesario.
    1. Hacer girar la sangre restante a 1,000 xg durante 30 min y seguir procedimientos estándar para recoger la fracción de plasma.
    2. Alícuota del plasma en incrementos de 1 mL en tubos criogénicos de 1,5 mL y almacénelos a -80 ° C para su uso durante futuros análisis de biopsia de líquido.
  3. Use un hisopo estéril para obtener una muestra de hisopo bucal y guarde el hisopo en un tubo estéril a temperatura ambiente.
  4. Si es necesario, obtenga una muestra de saliva y guárdela en un tubo estéril a temperatura ambiente.
    NOTA: Estas muestras pueden utilizarse para futura genotipificación y afinación de tejidos, si es necesario.

3. Registro de muestras

  1. Transferir la información de la lista de comprobación de las muestras de pacientes a la base de datos del depósito biológico. Incluir información del paciente y diagDe la tabla de pacientes.
  2. Imprima etiquetas con un código de barras para cada muestra y registre cada una en la base de datos para vincular cada muestra recogida con los datos del paciente.
  3. Anote la distribución de las muestras des-identificadas en la base de datos del biorepository antes de transferir las muestras al laboratorio de investigación.

4. Aislamiento de Proteínas y Análisis Western Blot

  1. Colocar cada muestra de tejido (SCC y / o ANT) en un vial que contenga 500 μl de tampón de lisis celular que contenga inhibidores de proteasa por 100 mg de tejido para lisar el tejido.
    Se utilizó un tampón de ensayo de radioimmunoprecipitación (RIPA), compuesto de Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio al 0,5%, NP-40 al 1,0% y SDS al 0,1%. Pueden usarse otros tampones de lisis celular.
  2. Homogeneizar los tejidos utilizando un homogeneizador de tejidos durante 5 minutos en intervalos de 20 segundos a 4 ° C. Hacer girar las muestras a 21.000 xg y 4 ° C durante 20 minutos y recoger el sobrenadante que contiene la proteína en un fresco tuser. Se vuelve a centrifugar el sobrenadante usando las mismas condiciones y se recoge el sobrenadante final en un tubo nuevo.
  3. Se electroforan 30-50 μg de proteína de cada muestra usando un gel de gradiente de SDS-poliacrilamida al 4-20%. Mancha el gel con Coomassie Blue para visualizar las bandas de proteínas, si lo desea.
  4. Si se necesita el análisis Western blot de proteínas expresadas, transfiera las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) siguiendo protocolos estándar. Después de la transferencia, Ponceau mancha la membrana de PVDF para visualizar bandas de proteína, si se desea.
  5. Bloquear la membrana y la sonda PVDF para detectar proteínas de interés siguiendo los protocolos estándar. Utilizar anticuerpos primarios específicos de la (s) proteína (s) de interés, junto con anticuerpos secundarios correspondientes específicos para los anticuerpos primarios, a concentraciones recomendadas por el fabricante para el análisis de transferencia Western.
  6. Exponer la membrana sondada utilizando un sustrato quimioluminiscente e imagen de la membrana utilizando un imagiNg.

5. Aislamiento de ARN y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)

  1. Coloque inmediatamente muestras de tejido fresco (SCC y / o ANT) en un tubo de 1,5 ml que contenga una solución de estabilización de ARN y coloque muestras de tejido post-Mohs en un tubo de 1,5 ml que contenga una solución de transición de tejido congelado, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido. Guarde estas muestras a -80 ° C hasta su uso.
  2. Retirar las muestras de ARN de -80 ° C y descongelar sobre hielo. Transferir el tejido a un nuevo tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de tampón de extracción de ARN (fenol / tiocianato de guanidina) por 50-100 mg de tejido.
  3. Lyse los tejidos utilizando un homogeneizador de tejidos. Realizar seis ciclos de homogeneización, seguido de un período de enfriamiento de la muestra; Cada ciclo consta de 20 s de homogeneización a 4 ° C y un período de enfriamiento de 40 s. Después de la homogeneización, incubar la muestra durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Añadir 0,2Ml de cloroformo por 1 ml de tampón de extracción de ARN y agitar vigorosamente el tubo a mano durante 15 s. Incubar durante 2-3 minutos a temperatura ambiente.
  5. Hacer girar las muestras a 12.000 xg y 4 ° C durante 15 min. Retirar la fase acuosa de la muestra y colocarla en un nuevo tubo de 1,5 ml.
  6. Añadir 0,5 ml de isopropanol al 100% por 1 ml del tampón de extracción de ARN utilizado en el paso 5.2 a la fase acuosa e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Si se anticipa que los rendimientos de ARN son bajos ( es decir, el volumen de tejido inicial es inferior a 10 mg), las muestras pueden precipitarse durante la noche a -80ºC. Adicionalmente, se pueden a~nadir 5 μg de glucógeno libre de ARNasa por 500 μl de tampón de extracción de ARN durante la etapa de precipitación con isopropanol para mejorar los rendimientos de ARN.
  7. Hacer girar la muestra a 12.000 xg a 4 ° C durante 10 min. Se retira el sobrenadante y se lava el sedimento con 1 ml de etanol al 75%.
  8. Vórtice brevemente la muestra y luego gírela a 7.500 xg y 4 °C durante 5 min. Desechar el lavado y secar al aire el gránulo durante 5-10 min.
  9. Resuspender el sedimento de ARN en 20 μl de agua libre de RNasa.
    1. Si se desea, purificar cada muestra de ARN utilizando un kit de limpieza de ARN siguiendo las recomendaciones del fabricante.
      NOTA: Si se realiza este paso, se perderán los ARN pequeños de la muestra.
  10. Se electroforó una muestra de 1 μg usando un gel de agarosa de formaldehído-MOPS al 1,2% para analizar la calidad del ARN.
    NOTA: Como alternativa, analizar las muestras utilizando un bioanalizador para obtener un número RIN 13 .
  11. Reverse-transcribir el ARN a cDNA utilizando un protocolo de transcripción inversa para qPCR análisis de mRNAs (o miRNAs) de interés de interés.

6. Culturas de explosivos de tejidos

  1. Esterilizar el tejido extirpado antes del cultivo sumergiendo el tejido en etanol al 70%.
  2. Coloque el tejido en una lámina o plato y agregue suficiente medio de cultivo (mezcla 1: 1 de DMEM: Ham & #39; s F-12 suplementado con FBS al 10%, HEPES 25 mM, penicilina 100 UI / mL y estreptomicina 100 mu g / ml) para cubrir el tejido (para evitar que el tejido se seque). Cuidadosamente cortar el tejido en fragmentos (<1 mm 3 ) con una cuchilla de bisturí.
  3. Transferir los fragmentos de tejido a un plato de cultivo de tejidos de 35 mm y agregar aproximadamente 20 μl de suero bovino fetal (FBS) sobre cada fragmento.
  4. Dejar el plato abierto en una campana de cultivo durante 20-30 min, o hasta casi seco.
  5. Añadir 1 ml de medio de cultivo (mezcla 1: 1 de DMEM: F-12 de Ham suplementado con FBS al 10%, HEPES 25 mM, penicilina 100 UI / ml y estreptomicina 100 mu g / ml) a cada placa e incubar a 37º C en CO _ { 2 } al 5%. Subculture o subclone los cultivos si es necesario.

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Representative Results

El tumor y la ANT se han utilizado con éxito en el aislamiento de proteínas y se han ensayado mediante transferencia Western. Como se muestra en la Figura 3 , se pueden detectar marcadores cutáneos de carcinoma de células escamosas (Muc1 14 , FHL- 15 y p40 16 , 17 ) en muestras de pacientes recogidas y almacenadas en nuestro depósito biológico clínico.

figura 3
Figura 3: Análisis de proteínas extraídas de ANT y SCC. La proteína total se aisló a partir de muestras de ANT y SCC, y la expresión de marcadores conocidos para SCC se examinó mediante transferencia de Western. Se muestran las transferencias Western representativas de mucina 1 (MUC1), Factor H Like-1 (FHL-1) y p40 (panel B). PeticiónHaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El ARN aislado usando las técnicas anteriores se ha probado por electroforesis en gel, qPCR, y análisis de integridad de ARN. La Figura 4 muestra dos muestras de pacientes de las que se aisló ARN intacto de alta calidad. El ARN es adecuado para todas las aplicaciones aguas abajo.

Figura 4
Figura 4: Análisis de integridad de ARN utilizando bioanálisis. Evaluación del tamaño e integridad del ARN mediante electroforesis en gel (panel A). Se generó un número de integridad de ARN (RIN) para cada muestra basándose en la traza electroforética de la muestra de ARN, incluyendo la relación de ARN ribosómico y la presencia o ausencia de productos de degradación (panel B). Un RIN de "10" representa una muestra perfecta de ARN, sin ningún producto de degradación, mientras que "1" marca unaMple. Los perfiles de densitometría de las bandas se representan como unidades de fluorescencia (FU) frente a nucleótidos (nt) (panel C) para muestras de ARN representativas de tejido de pacientes con SCC y ANT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los explantes viables establecidos a partir de las secciones de tejido se han evaluado mediante microscopía ( Figura 5A ). Estos cultivos de explantes, generados a partir de muestras de tumores y ANT, son cultivos mixtos de queratinocitos y fibroblastos. Estos cultivos pueden ser subcultivados o usados ​​para el futuro desarrollo de la línea celular. Se han utilizado lentes histológicos almacenados para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. En la figura 5B , una muestra de SCC muestra tinción positiva para un marcador de transición epitelial a mesenquimal en SCC 18 .


Figura 5: Cultivo de explantes y tinción IF de secciones de SCC. Imagen de contraste de fase de un explante de tejido de carcinoma de células escamosas (panel A, Barra de escala = 50 μm) y secciones de tejido recolectadas como parte de la cirugía micrográfica de Mohs, teñidas con un anticuerpo primario anti-pSnail / Slug (panel B, Barra de escala = 25 μm ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Hemos determinado experimentalmente que el tejido se puede almacenar a 4 ° C durante 24-48 h antes del aislamiento de ARN (etapa 5) o cultivo de explante (paso 6) sin afectar a los resultados. El rendimiento o la integridad del ARN, según se evalúa mediante electroforesis en gel o bioanalizador y número RIN, no se ponen en peligro. Además, los cultivos de explantes se obtienen fácilmente usando tejido almacenado a 4 ° C para esteS de tiempo. Esto proporciona una mayor flexibilidad al transferir muestras entre la clínica y el laboratorio de investigación. A medida que el aislamiento de ARN y el cultivo de explantes se realizan en el laboratorio de investigación y no en la clínica, esta característica hace que el biorepository basado en la clínica sea un modelo más robusto de lo que esperábamos.

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Discussion

A juicio del autor, este protocolo es el primero de su tipo que se centra en la adquisición clínica de muestras de tejido cutáneo en un enfoque rentable y rápido. Los pacientes sometidos a microcirugía de Mohs se programan típicamente durante bloques específicos del tiempo, y la colección se limita a estos períodos. La recolección de muestras involucra el esfuerzo del asistente médico involucrado en el cuidado del paciente, el histotecnólogo de Mohs que procesa las muestras tumorales y un miembro del personal de laboratorio designado que maneja la entrada de muestra y el procesamiento de la sangre.

Con una cuidadosa coordinación entre los tres miembros del equipo de recolección ( es decir, el asistente médico , el histotecnista de Mohs y el técnico de laboratorio), hemos encontrado que el personal de asistencia médica existente puede completar las tareas adicionales asociadas con la recolección de 3-5 muestras de tejido Por día sin ningún retraso aparente en las operaciones clínicas. Obtener el consentimiento del paciente Y la recolección de hisopados bucales y sangre se completan durante los períodos de espera normales involucrados con el procedimiento de microcirugía Mohs. Aparte de la toma de decisiones acerca de cómo se procesará una muestra, las tareas de las que es responsable el histotecnólogo Mohs se completan al final del procesamiento de muestras de pacientes de Mohs y normalmente agregarán aproximadamente 30 minutos al programa diario. Normalmente, un miembro del personal de la clínica es responsable de etiquetar y procesar las muestras de sangre y de realizar cualquier transferencia y entrada de muestras en la base de datos. Dependiendo del número de muestras procesadas, estos deberes pueden requerir un tiempo considerable lejos de los derechos existentes; Por lo tanto, la recolección de muestras sólo debe llevarse a cabo cuando se dispone de suficiente personal de laboratorio. Específicamente, si se recogen más de 5 muestras en un solo día, o si se recogen varias muestras de sangre de los pacientes, se necesitan varias horas de esfuerzo adicional del técnico de laboratorio.

Jove_content "> En los días de recolección, los asistentes médicos (MA) obtienen el consentimiento de los pacientes para las donaciones de tejido.La MA obtiene posteriormente un hisopo bucal (y la saliva, si es necesario) y recoge la sangre para su procesamiento por el personal de laboratorio. La participación del paciente después de la recogida de estas muestras, por lo que desde el punto de vista del paciente, el resto de la visita clínica no ha cambiado (aunque se les pide que donen sangre durante cualquier visita de seguimiento.) Actualmente, podemos estimar que el 70% Para donar tejido, con ~ 30% de los pacientes que también donan sangre, el 30% declinan a participar.En la actualidad, sólo los pacientes con una biopsia de diagnóstico probado de cáncer se incluyen en el depósito biológico.Los pacientes con una conocida transmisibles por vía sanguínea enfermedades están excluidos .

El miembro del personal del laboratorio es responsable de coordinar con los otros dos miembros del equipo de recolección y registra las muestras que se recogen (Tabla 1). Después deN la recogida inicial de muestras, el formulario de consentimiento completado, la sangre y los hisopos bucales se transfieren al miembro del personal del laboratorio, y se registran las iniciales, fecha de nacimiento y otra información pertinente del donante. Esto permite registrar los números y tipos de muestras recolectadas con cada paciente durante el procedimiento de recolección. Los diagramas de flujo que resumen el procesamiento tanto del tejido del SCC ( Figura 6 ) como del ANT (Figura 7) son herramientas útiles para la capacitación del nuevo personal en los procedimientos de recolección.

Figura 6
Figura 6: Diagrama de flujo que delinea el procesamiento de muestras de SCC. Tras la escisión tumoral, se evalúa el tamaño de la muestra. Si la muestra es ≤2 mm3, la muestra entera se utiliza para el procesado de Mohs, ya que la evaluación de los márgenes limpiosLa eliminación completa del tumor) es la prioridad máxima. Después del procesamiento de Mohs, cualquier tejido restante se congela en nitrógeno líquido y se transfiere al depósito biológico. Si la muestra es suficientemente grande, de modo que se pueda retirar una porción de más de 2 mm3 del tejido, esta porción se recoge y se coloca en un tubo que contiene medio de cultivo celular, mientras que la porción restante se utiliza para el procesado de Mohs y se almacena como anteriormente. La porción de muestra retirada al medio de cultivo de células se segmenta adicionalmente, con un fragmento de ~ 0,5 mm ^ { 3 } extraído y utilizado para el establecimiento de una línea de cultivo celular; El fragmento de tejido restante se transfiere al depósito biológico para el análisis de la proteína y el análisis de la expresión aguas abajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Er.within-page = "1"> Figura 7
Figura 7: Diagrama de flujo que delinea el procesamiento de las muestras de ANT. En el momento del cierre de Mohs, una porción de tejido normal adyacente (ANT) es retirada y recogida por el cirujano de Mohs. Si el tamaño de la muestra es ≤2 mm 3 , la muestra entera se coloca en un tubo criogénico y se congela en nitrógeno líquido antes de transferirla al depósito biológico. Si la muestra es> 2 mm 3 , la muestra entera se coloca primero en un tubo que contiene el medio de cultivo celular. El espécimen se secciona adicionalmente en un fragmento de ~ 0,5 mm ^ { 3 }, para ser utilizado para el establecimiento de líneas de cultivo celular. La sección de tejido restante se transfiere al depósito biológico para ser almacenado para el análisis de la proteína y el análisis de la expresión aguas abajo.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este protocolo está diseñado para minimizar la variación entre las muestras dentro del biorepository. La coordinación y comunicación efectiva entre el personal de la clínica y entre la clínica y todo el personal de laboratorio es esencial para minimizar la variabilidad y maximizar el logro de ADN, ARN y proteína de alta calidad de los tejidos. Mientras que el ADN y la proteína dentro de los tejidos son robustos, si se desea ARN, es crítico mantener los tejidos fríos y en el medio apropiado durante la recolección, transporte y procesamiento para mantener la integridad del ARN. El registro exacto de registros es también vital para vincular las muestras de los pacientes con su historia y diagnóstico, ya que esta información se necesita a menudo cuando se analizan los resultados de las aplicaciones aguas abajo.

Con el creciente interés en la medicina personalizada y la bioSe han establecido recientemente varios biorepositores. Éstos se asocian típicamente con las clínicas hospital-basadas en centros académicos grandes y tienen costos substanciales implicados con la disposición y la operación 2 , 8 , 19 . El desarrollo de un biorepository clínico para muestras de cáncer cutáneo generado como parte de la práctica diaria tiene varias ventajas clave sobre otros biorepositories. En primer lugar, con un único sitio de recopilación y procesamiento de muestras, se minimizan las variaciones en el manejo de la muestra, que pueden comprometer las aplicaciones posteriores. En segundo lugar, ya que estas muestras donadas se extraen de una población de pacientes estable, el acceso a los registros médicos de-identificados y los datos de resultado del paciente son sin precedentes. Estos datos se pueden anonimizar y transferir de la tabla de pacientes a la base de datos de biorepository en el momento de la recolección de la muestra o en una visita de seguimiento. En tercer lugar, con una base de pacientes leales, el clBicomponente basado en inic es capaz de reunir múltiples muestras del mismo paciente, un conjunto de muestras no se obtiene a menudo en otros entornos. Una de las limitaciones de este protocolo es que ha sido optimizado para muestras cutáneas obtenidas mediante cirugía micrográfica de Mohs y puede que tenga que ser modificado para otros tipos de tejidos o procedimientos clínicos.

En general, uno de los objetivos clave del biorepository es proporcionar un amplio espectro de muestras del mismo donante para permitir a los investigadores hacer una amplia gama de preguntas, en particular para el desarrollo de biopsias líquidas y marcadores de cáncer. Específicamente, la capacidad de correlacionar la histología tumoral y la expresión de biomarcadores en los niveles de ARNm y proteína a muestras de plasma, así como la capacidad de hacer referencia a datos de resultado de pacientes, crea un conjunto de datos único y potente. Esperamos que el modelo de depósito biológico basado en la clínica se pueda utilizar para ayudar a aliviar la escasez de muestras de pacientes en la investigación biomédica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado con fondos de la Midwestern University Colegio de Ciencias de la Salud Investigación Facilitación Grant, otorgado a EEH, y Midwestern University Oficina de Investigación y Programas Patrocinados Intramural Grant, otorgado a KJL. El apoyo adicional fue proporcionado por Affiliated Laboratories y Affiliated Dermatology. Agradecemos a Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel y Ali Zaidi por su asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA ThermoFisher Scientific 02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades ThermoFisher Scientific 50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps ThermoFisher Scientific 16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium ThermoFisher Scientific NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound ThermoFisher Scientific 50-363-579
Leica CM1950 Cryostat Leica Biosystems 14047743909
Frosted Microscope Slides ThermoFisher Scientific 12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit ThermoFisher Scientific 99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes ThermoFisher Scientific 03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab  ThermoFisher Scientific NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer ThermoFisher Scientific 50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer ThermoFisher Scientific 12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle ThermoFisher Scientific 121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific 13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140148
Gibco 1 M Hepes ThermoFisher Scientific 15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent ThermoFisher Scientific 1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 Abnova MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody Abnova ABX-144A
Anti MUC-1 antibody Santa Cruz Biotech sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246) Abcam Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin Molecular Probes  A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Molecular Probes  P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera Zeiss 4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera Olympus IX511F3

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References

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Medicina Número 123 Biorepositorio clínico cáncer de piel cirugía de Mohs carcinoma de células escamosas procesamiento de tejidos banco de tejidos
Establecimiento de un Biorepository basado en la Clínica
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Belden, S. E., Uppalapati, C. K., Pascual, A. S., Montgomery, M. R., Leyva, K. J., Hull, E. E., Averitte, R. L. Establishment of a Clinic-based Biorepository. J. Vis. Exp. (123), e55583, doi:10.3791/55583 (2017).

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