Summary
Kutana tumörer kasseras ofta efter Mohs mikrografisk kirurgi. Ett protokoll beskrivs här som gör det möjligt för klinisk supportpersonal att effektivt bearbeta och lagra kutan tumör ( t.ex. pladecells carcinom, basalcellkarcinom och melanom) prover för nedströms laboratorieapplikationer utan att störa kliniska operationer.
Abstract
Förekomsten av hudcancer ( t.ex. plavocellkarcinom, basalcellkarcinom och melanom) har ökat under de senaste åren. Det förväntas att det kommer att finnas en parallell efterfrågan på kutana tumörprover för biomedicinska forskningsstudier. Tissue tillgänglighet är dock begränsad på grund av kostnaden för att etablera ett biorepository och avsaknaden av protokoll som är tillgängliga för att erhålla kliniska prover som inte stör klinisk verksamhet. Ett protokoll upprättades för att samla och bearbeta kutan tumör och associerade blod- och salivprover som har minimal inverkan på rutinmässiga kliniska förfaranden vid datumet för en Mohs-operation. Tumörprover samlas in och behandlas från patienter som genomgår Mohs-histoteknologins första lager av Mohs-kirurgi för biopsi-beprövade kutana maligniteter. Intilliggande normal vävnad uppsamlas vid kirurgisk tillslutning. Ytterligare prov som kan samlas är helblod och buccal swabs. Genom att använda vävnadsprover som normalt kasseras, genererades en biorepository som erbjuder flera viktiga fördelar genom att vara baserad i kliniken jämfört med laboratorieinställningen. Dessa inkluderar ett brett spektrum av samlade prover; Tillgång till identifierade patientjournaler, inklusive patologiska rapporter Och för den typiska givaren tillgång till ytterligare prover under uppföljningsbesök.
Introduction
Cancer- och biomarkörsforskning bygger på en leverans av mänskliga vävnadsprover av hög kvalitet, och begränsat utbud har hindrat forskning 1 , 2 . Många dermatologiska studier är begränsade av otillräcklig tillgång, variabel kvalitet och kostnader i samband med användningen av mänsklig vävnad. Kostnaden för att skapa en stor, dedikerad biobank har uppskattats till cirka två miljoner dollar 3 , och dessa kostnader gör användningen av mänsklig vävnad utom räckhåll för många forskare. Vidare utgör processen för att generera och lagra forskningsprover risken för att påverka klinisk verksamhet och fördröja patientvården om den inte genomförs noggrant. En kostnadseffektiv klinikbaserad biorepository har etablerats som fokuserar på hudcancerprover efter rekommenderad bästa praxis och provvalidering 4 , 5 , 6 .
Målet med Mohs mikrografiska kirurgiska tekniken är att säkerställa att all cancervävnad avlägsnas samtidigt som så mycket hälsosam vävnad bevaras som möjligt. Förfarandet innefattar progressiv avlägsnande av tunna skikt av tumörvävnad. Varje på varandra följande skikt är hansTologiskt undersökt (efter kryosektion av tumörvävnaden och utförande av H & E-färgning) av en hudläkare för att bestämma om all cancervävnad har avlägsnats. Undersökningen och undersökningen av efterföljande skikt av vävnader utförs medan patienten förblir på kontoret. Denna teknik anses vara det bästa behandlingsalternativet för SCC 9 . Vid denna tidpunkt är såret stängt och för att förbättra läkning och kosmetisk utseende skärs ofta intilliggande normal vävnad (ANT) ofta ut. Således är detta kirurgiska förfarande för att avlägsna en tumör lämpligt lämpad för att samla histologiskt karakteriserad vävnad för framtida studier.
Upphandlingsförfarandet för att erhålla tumörvävnad, intill normal vävnad, saliv och blodprover har utformats för att få minimal inverkan på normala personaluppgifter ( Figur 1 ). Medicinska assistenter utför bloddragningarna medan patienten förbereds för proceduren. Efter avslutad Mohs-procedur, M Ohs histoteknologen förbereder ytterligare histologiska bilder av provet och överför vävnaden till biorepository. Kostnaderna i samband med upprättandet av biorepository inkluderar inköp av kryopreserveringsfrysare, skapandet av blygsamt kliniskt laboratoriumutrymme och utvecklingen av ett inventeringsspårningsprogram.
Figur 1: Sekvens av provinsamling och ansvarig personal. Vid patientinsamling och uppnående av patientens samtycke samlar den medicinska assistenten en buccal swab och utför en bloddragning. Dermatologen och den medicinska assistenten tar sedan bort tumören och stänger såret, under vilken tid SCC och ANT-prov uppsamlas. En särskild laboratorie tekniker behandlar blodet och delar SCC- och ANT-proverna för vävnadsodling, bevarande och inträde i biorepository.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Mångfalden av samlade prov möjliggör en rad olika experimentella tillvägagångssätt ( Figur 2 ). Prov som samlas in från patienten är buccala swabs (saliv kan också samlas vid behov), helblod och skärad vävnad. Buccal swabs och ett prov från hela blodet sparas, utan behandling, för genotypning och vävnadsmatchning. Hela blodet separeras i vita blodkroppar (WBC) och plasmafraktioner för framtida analyser. Efter Mohs-bearbetning placeras den frusna tumören direkt i flytande kväve och överförs till en -80 ° C frys. Friska, livskraftiga tumörvävnader och ANT-prover odlas med användning av modifikationer av tidigare tekniker 10 , 11 och sedan kryokonserverade. Under samlingen registreras numret på varje provtyp i ett kalkylblad före inmatning i Inventeringsspårningsprogrammet för att underlätta korrekt bearbetning ( tabell 1 ).
Figur 2: Översikt av klinisk baserad biorepository samling och behandling av prov. En buccal swab och blodprov samlas från patienten och lagras för nedströms genotyping och vävnadsmatchning. Hela blodet bearbetas vidare för isolering av vita blodkroppar (WBC) och CTC, samt för plasmainsamling och flytande biopsianalys. Vävnad som skäras under Mohs-proceduren behandlas histologiskt för diagnostiska ändamål, varefter de histologiska glidbanorna kan användas experimentellt för ytterligare immunohistokemiska analyser. Under förutsättning att det skurna vävnadsprovet är stort nog, avlägsnas en del av färsk vävnad och sektioneras för protein- och RNA-isolering och för etablering av odlade cellinjer.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Insamlingsdatum: | |||||
| Patient 1 | Patient 2 | Patient 3 | Patient 4 | Patient 5 | |
| Initialer och födelsedatum | |||||
| Ögonfärg | |||||
| Provtyp | |||||
| Provplats | |||||
| Saliv | |||||
| WHålblod | |||||
| Plasma | |||||
| Tumörlivbar | |||||
| Vävnad Normal Livskraftig | |||||
| Tumor Mohs flytande kväve | |||||
| Vävnad Normal flytande kväve | |||||
| slides |
Tabell 1: Checklista för att spela in samplingar. Uppgifter som spåras och spelas in med varje prov som samlats in inkluderar patientinitialer, födelsedatum och ögonfärg (för hudtyp) samt lokaliseringPå avlägsnandet av provet. Antalet salivprover, bloduppsamlingsvolymer och antalet insamlade livsdugliga och konserverade vävnadsprover upptecknas också som referenser för tilldelningar till senare användning. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
För att validera provinsamlingsprocedurer har varje provtyp testats i applikationer nedströms. Med användning av modifikationer av tidigare tekniker 12 har tumör och ANT framgångsrikt använts i protein- och RNA-isolering och kan potentiellt användas för DNA-isolering. Livskraftiga explanter som är etablerade från vävnadssektionerna har utvärderats av mikroskopi, medan lagrade histologiska diabilder har använts för immunhistokemi och immunofluorescens.
Genom att följa protokollet som beskrivs här är det möjligt att förlänga denna modell till andra dermatologikliniker, andra tumortyper (som melanom), Och andra kirurgiska specialiteter och praxis för att tillhandahålla mänskliga vävnadsprover för mångfacetterad forskning kring humankanker. Små modifikationer av detta protokoll är sannolikt nödvändiga för andra metoder, men i princip är detta protokoll tillämpligt på alla kirurgiska metoder som rutinmässigt kasserar patientprover som samlats under patientbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt experiment på humana vävnadsprover godkändes av Western IRB (WIRB Protocol # 20142461). Det enda kriteriet för insamling av vävnader för dessa förfaranden är en biopsi-beprövad diagnos av SCC. Inga uteslutningskriterier beskrivs i det ursprungliga IRB-protokollet, men prover från patienter med en känd överförbar sjukdom i blodet användes inte. Informerat samtycke erhölls före insamling av kutan vävnad, blod och saliv. Midwestern Institutional Review Board godkände valideringsarbetet med klinikbaserade biorepositoryprover vid Midwestern University (AZ # 807).
1. Kutan tumörvävnadsprocessering
OBS: Detta ska utföras av en Mohs histoteknolog.
- Bearbetning av fräscht skvättcellscarcinom (SCC) vävnad för RNA och Explant Culture
- Efter att vävnaden har skurits av Mohs-kirurgen, skörda en 10 till 50 mg (≥10 mm 3 OBS! Detta är endast möjligt om tumören är tillräckligt stor för att ett prov på 10-50 mg (≥10 mm 2 ) ska avlägsnas före den histologiska bedömningen, som ingår i Mohs-proceduren. Om tumören inte är tillräckligt stor så att minst 2 mm 3 kan avlägsnas, fortsätt inte behandlingen med RNA (hoppa över steg 5).
- Överför den livsdugliga vävnaden till ett märkt 1,5 ml rör innehållande odlingsmedium (1: 1-blandning av DMEM: Ham's F-12, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin) med användning av pincett och se till att Vävnaden är helt nedsänkt i mediet. Förvara detta rör vid 4 ° C före ytterligare behandling.
- Använd vävnaden för RNA-isolering och expressionsanalys (se steg 5) och / eller etableringenAv en explant kultur (se steg 6) inom 24 timmar.
- Placera återstoden av tumörprovet som avlägsnades från patienten (steg 1.1.1) på en kryostatvävnadshållare (eller "chuck"). Bädda in vävnaden i en optimal skärningstemperatur (OCT) -förening, frysa vävnaden inuti hållaren, för att möjliggöra fullbordandet av Mohs-histologi och för framställning av ytterligare histologiska diabilder för experimentell analys.
- Framställning av histologiska diabilder
- Klipp vävnadssektionerna 7 μm tjocka med hjälp av en kryostat och skapa två (eller fler) glidbanor för varje tumörprov. Se till att varje bild innehåller upp till tre delar av hela tumören.
OBS! En av de två bilderna kommer att färgas med H & E av Mohs-histoteknologen, och ytterligare diabilder kan behandlas med IF, IHC eller FISH-analys. - Placera glidorna i aceton i 1-2 s för att fixera vävnaden. Ställ dessa diabilder åt sidan för att torka. Gör inte H & EFläck eller täckglaset som ska användas för framtida immunofluorescens (IF), immunohistokemi (IHC) eller fluorescens in situ- hybridisering (FISH) analys, beroende på försöksprotokollet.
- Klipp vävnadssektionerna 7 μm tjocka med hjälp av en kryostat och skapa två (eller fler) glidbanor för varje tumörprov. Se till att varje bild innehåller upp till tre delar av hela tumören.
- Behandling av Post-Mohs-vävnad
- När Mohs-bearbetningen har slutförts (steg 1.1-1.2), arbeta i kryostatkammaren och snyta provet från det kryo-inbädda mediet och placera vävnaden i ett märkt kryogent rör.
- Placera den märkta flaskan i flytande kväve innan vävnaden har tinas. Om prover ska användas för protein- och / eller DNA-analys kan de överföras till flytande kväve eller en -80 ° C frys inom några minuter för att lagras för framtida proteinuttryck och DNA-mutationsanalys (se steg 4-5) .
ANMÄRKNING: Om intakt RNA önskas från post-Mohs-provet är det väsentligt att hålla provet fryst under avlägsnandet från det kryo-inbädda mediet. Om extremvård inte utövas påDetta steg, post-Mohs-provet bör reserveras för protein- och / eller DNA-analys.
- Bearbetning av Fresh ANT
- Vid tiden för Mohs stängning, skaffa ANT från Mohs kirurgen.
- Ta bort en lika stor mängd ANT som skördats från SCC-provet (se ovan) från den apikala sidan av den normala vävnaden och överför den till ett märkt 1,5 ml rör innehållande odlingsmedium (1: 1-blandning av DMEM: Ham's F- 12 kompletterat med 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin) med användning av pincett.
- Helt nedsänka vävnaden i samma odlingsmedium och förvara vid 4 ° C till efterföljande behandling (se steg 4-6).
2. Blod-, saliv- och buccal swab-bearbetning
- Skaffa cirka 10 ml blod i EDTA-insamlingsrör via venipunktur.
- Överför blodet från uppsamlingsrören till ett sterilt centrifugrör med 15 eller 50 ml. Ta bort ca 200 μl i ett 1,5 ml kryogent rör, undvik bubblor; Lagra hela blodprovet vid -80 ° C, för att användas för framtida genotypning och vävnadsmatchning, om det behövs.
- Spin det återstående blodet vid 1000 xg i 30 minuter och följ standardprocedurer för att samla plasmafraktionen.
- Aliquot plasman i steg om 1 ml i 1,5 ml kryogenrör och förvara vid -80 ° C för användning vid framtida biopsianalyser.
- Använd en steril vatpinne för att få ett buccalt provprov och förvara vattnet i ett sterilt rör vid rumstemperatur.
- Vid behov fås ett salivprov och förvaras i ett sterilt rör vid rumstemperatur.
OBS: Dessa prover kan användas vid framtida genotypning och vävnadsmatchning, om det behövs.
3. Registrering av prov
- Överför information från checklistan av patientprover till biorepositorydatabasen. Inkludera patientinformation och diagNos från patientdiagrammet.
- Skriv ut etiketter med en streckkod för varje prov och registrera vardera i databasen för att länka varje samlat prov med patientdata.
- Notera fördelningen av de identifierade proverna i biorepositorydatabasen innan de överförs till proven till laboratoriet.
4. Proteinisolering och Western Blot-analys
- Placera varje vävnadsprov (SCC och / eller ANT) i en flaska innehållande 500 | il av celllysbuffert innehållande proteashämmare per 100 mg vävnad för att lysa vävnaden.
OBS: Vi använde en radioimmunutfällningsanalys (RIPA) buffert, sammansatt av 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxikolat, 1,0% NP-40 och 0,1% SDS. Andra celllysbuffertar kan användas. - Homogenisera vävnaderna med hjälp av en vävnadshomogenisator under 5 min i 20 s intervaller vid 4 ° C. Snurra proverna vid 21 000 xg och 4 ° C i 20 minuter och samla in det supernatantinnehållande proteinet i en frisk tuvara. Spola supernatanten igen med samma förhållanden och samla den slutliga supernatanten i ett friskt rör.
- Elektrofores 30-50 μg protein från varje prov med användning av en 4-20% SDS-polyakrylamidgradientgel. Stänk gelén med Coomassie Blue för att visualisera proteinband, om så önskas.
- Om Western blot-analys av uttryckta proteiner behövs, överför proteinerna från gelén till ett polyvinyliden-difluorid-membran (PVDF) enligt standardprotokoll. Efter överföring fläckar Ponceau PVDF-membranet för att visualisera proteinband, om så önskas.
- Blockera PVDF-membranet och sonden för att detektera proteiner av intresse enligt standardprotokoll. Använd primära antikroppar specifika för proteinet / proteinerna av intresse tillsammans med motsvarande sekundära antikroppar specifika för de primära antikropparna vid koncentrationer som rekommenderas av tillverkaren för Western blot-analys.
- Exponera det undersökta membranet med ett kemiluminescerande substrat och bilda membranet med hjälp av en imagiNg-systemet.
5. RNA-isolering och kvantitativ polymerasekedjereaktion (qPCR)
- Placera färskvävnadsprover (SCC och / eller ANT) omedelbart i ett 1,5 ml rör innehållande en RNA-stabiliseringslösning och placera post-Mohs vävnadsprover i ett 1,5 ml rör innehållande en frusen vävnadsövergångslösning enligt tillverkarens rekommendationer. Se till att vävnaden är helt nedsänkt. Förvara dessa prover vid -80 ° C tills användning.
- Ta bort RNA-proverna från -80 ° C och tina på is. Överför vävnaden till ett nytt 1,5 ml rör innehållande 1 ml RNA-extraktionsbuffert (fenol / guanidintiocyanat) per 50-100 mg vävnad.
- Lyse vävnaderna med hjälp av en vävnadshomogenisator. Utför sex cykler av homogenisering följt av en period av provkylning; Varje cykel består av 20 s homogenisering vid 4 ° C och en 40 s kylningstid. Efter homogenisering inkubera provet i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Lägg till 0,2Ml kloroform per 1 ml RNA-extraktionsbuffert och skaka röret kraftigt i hand i 15 s. Inkubera i 2-3 minuter vid rumstemperatur.
- Spinn provet vid 12 000 xg och 4 ° C under 15 min. Ta bort vattenfasen i provet och placera den i ett nytt 1,5 ml rör.
- Tillsätt 0,5 ml 100% isopropanol per 1 ml av RNA-extraktionsbufferten som användes i steg 5.2 till vattenfasen och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Om RNA-utbytena förväntas vara låga ( dvs startvävnadsvolymen är mindre än 10 mg) kan prover utfällas över natten vid -80 ° C. Dessutom kan 5 | ig RNas-fri glykogen per 500 | il RNA-extraktionsbuffert tillsättas under isopropanol-utfällningssteget för att förbättra RNA-utbyten. - Spinn provet vid 12 000 xg vid 4 ° C i 10 min. Ta bort supernatanten och tvätta pelleten med 1 ml 75% etanol.
- Vortexa provet kort och rotera sedan det vid 7.500 xg och 4 °C i 5 min. Kassera tvätten och lufttorka pelleten i 5-10 minuter.
- Resuspendera RNA-pelleten i 20 pl RNas-fri vatten.
- Om så önskas, rena varje RNA-prov med ett RNA-rengöringssats enligt tillverkarens rekommendationer.
OBS! Små RNA kommer att gå förlorade från provet om detta steg utförs.
- Om så önskas, rena varje RNA-prov med ett RNA-rengöringssats enligt tillverkarens rekommendationer.
- Elektrofores ett 1 μg prov med en 1,2% formaldehyd-MOPS agarosgel för att analysera kvaliteten på RNA.
OBS! Som ett alternativ, analysera prov med hjälp av en bioanalysator för att få ett RIN nummer 13 . - Omvänd transkribera RNA till cDNA med användning av ett omvänt transkriptionsprotokoll för qPCR-analys av målmRNA (eller miRNA) av intresse.
6. Vävnadsexplosiva kulturer
- Sterilisera den skurna vävnaden före odling genom att doppa vävnaden i 70% etanol.
- Placera vävnaden på en glid eller skål och tillsätt tillräckligt med odlingsmedium (1: 1-blandning av DMEM: Skinka och #39; s F-12 kompletterad med 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin) för att täcka vävnaden (för att förhindra att vävnaden torkar). Skär vävnaden försiktigt i fragment (<1 mm 3 ) med ett skalpellblad.
- Överför vävnadsfragmenten till en 35 mm vävnadskulturskål och tillsätt ca 20 μl fetalt bovinserum (FBS) ovanpå varje fragment.
- Låt disken vara öppen i en kåpa i 20-30 minuter, eller tills den är nästan torr.
- Tillsätt 1 ml odlingsmedium (1: 1-blandning av DMEM: Ham's F-12 kompletterat med 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin) till varje maträtt och inkubera vid 37 ° C C i 5% CO2. Subkultur eller subklon kulturer om det behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumör och ANT har använts framgångsrikt i proteinisolering och testats med Western blotting. Såsom visas i figur 3 kan kutana skivformiga cellkarcinommarkörer (Mucl 14 , FHL-1 15 och p40 16 , 17 ) detekteras i patientprover uppsamlade och lagrade i vår klinikbaserade biorepository.
Figur 3: Analys av proteiner extraherade från ANT och SCC. Totalt protein isolerades från ANT- och SCC-prover, och uttrycket av kända markörer för SCC undersöktes med Western blot. Representativa västerländska blottar av mucin 1 (MUC1), Factor H Like-1 (FHL-1) och p40 (panel B) visas. GrundenSe klicka här för att se en större version av denna figur.
RNA isolerat med användning av ovanstående tekniker har testats genom gelelektrofores, qPCR och RNA-integritetsanalys. Figur 4 visar två patientprover från vilka högkvalitativ, intakt RNA isolerades. RNA är lämplig för alla applikationer nedströms.
Figur 4: RNA-integritetsanalys med användning av bioanalys. Bedömning av RNA-storlek och integritet genom gelelektrofores (panel A). Ett RNA-integritetsnummer (RIN) genererades för varje prov baserat på det elektroforetiska spåret av RNA-provet, innefattande förhållandet mellan ribosomalt RNA och närvaron eller frånvaron av nedbrytningsprodukter (panel B). En RIN av "10" representerar ett perfekt RNA-prov utan några nedbrytningsprodukter, medan "1" markerar ett helt nedbrutet sample. Densitometriprofiler av banden är avsedda som fluorescensenheter (FU) mot nukleotider (nt) (panel C) för representativa RNA-prover från SCC- och ANT-patientvävnad. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Levande explanter som är etablerade från vävnadssektionerna har utvärderats genom mikroskopi ( Figur 5A ). Dessa explantkulturer, som alstras från tumör- och ANT-prover, är blandade keratinocyt- och fibroblastkulturer. Dessa kulturer kan subkultureras eller användas för framtida celllinjeutveckling. Lagrade histologiska bilder har använts för immunhistokemi och immunofluorescens. Visat i Figur 5B visar ett SCC-prov positiv färgning för en epitel-till-mesenkymal övergångsmarkör i SCC 18 .
Figur 5: Explantationskultur och IF-färgning av SCC-sektioner. Faskontrastbild av en pladecellscarcinomvävnadsexplanterande (panel A, Scale bar = 50 μm) och vävnadssektioner samlade som en del av Mohs mikrografisk kirurgi, färgad med en anti-pSnail / Slug primära antikropp (panel B, Skala bar = 25 μm ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Vi har experimentellt bestämt att vävnad kan lagras vid 4 ° C i 24-48 timmar före RNA-isolering (steg 5) eller explantkultur (steg 6) utan att påverka resultaten. RNA-utbyte eller integritet, som bedöms av gelelektrofores eller bioanalysator och RIN-nummer, äventyras inte. Dessutom erhålls explanta kulturer enkelt med användning av vävnad som lagras vid 4 ° C för denS tid. Detta ger ökad flexibilitet vid överföring av prov mellan kliniken och forskningslaboratoriet. Eftersom RNA-isolering och explantkultur utförs i forskningslaboratoriet och inte i kliniken gör den här funktionen det klinikbaserade biorepositoryet en mer robust modell än vad vi tidigare förväntade oss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Författarens vetskap är detta protokoll det första i sitt slag som fokuserar på klinisk upphandling av kutana vävnadsprover både i ett kostnadseffektivt och snabbt angreppssätt. Patienter som genomgår Mohs-mikrokirurgi planeras typiskt under specifika tidsintervaller, och insamlingen är begränsad till dessa perioder. Provuppsamling innebär ansträngning från den medicinska assistenten som är inblandad i patientvård, Mohs-histoteknologen som behandlar tumörproverna och en utsedd laboratoriepersonal som hanterar provinmatning och blodbehandling.
Med noggrann samordning mellan de tre medlemmarna i samlingslaget ( dvs. den medicinska assistenten, Mohs histoteknolog och laboratorie tekniker) har vi funnit att den befintliga medicinsk assistenten kan komplettera de ytterligare uppgifter som är kopplade till insamlingen av 3-5 vävnadsprover Per dag utan någon uppenbar försening i klinisk verksamhet. Skaffa patientens samtycke Och insamling av buccal swabs och blod fullbordas under normala väntetider involverade i Mohs-mikrokirurgi-förfarandet. Annan än beslutsfattandet om hur ett prov ska behandlas är de uppgifter som Mohs histoteknologen ansvarar för avslutad vid slutet av Mohs-behandlingen av patientprover och kommer normalt att lägga cirka 30 min till det dagliga schemat. Typiskt är en medlem av klinikpersonalen ansvarig för märkning och behandling av blodproverna och för utförande av överföring och inträde av prover i databasen. Beroende på antalet bearbetade prov kan dessa uppgifter kräva betydande tid bort från befintliga tullar. Således bör provuppsamling endast utföras när tillräcklig laboratoriepersonal är tillgänglig. Specifikt, om mer än 5 prov samlas in på en enda dag, eller om flera blodprover samlas in från patienter, behövs flera timmar extra insats från laboratorie tekniker.
Jove_content "> På samlingsdagar erhåller läkemedelsassistenterna (MA) samtycke från patienterna för donation av vävnad. MA erhåller därefter en buccal swab (och saliv om det behövs) och samlar blod för behandling av laboratoriepersonal. Det finns inte mer Patientens engagemang efter samlingen av dessa prover, så ur patientens perspektiv är återstoden av klinikbesöket oförändrat (även om de ombeds att skänka blod under ett uppföljningsbesök). För närvarande kan vi uppskatta att 70% av patienterna samtycker Att donera vävnad, med ~ 30% av dessa patienter donerar också blod, 30% minskar att delta. För närvarande ingår endast patienter med en biopsi-beprövad diagnos av cancer i biorepositören. Patienter med känd överförbar smittsam sjukdom är uteslutna .Laboratoriemedlemmen ansvarar för att samordna med de övriga två medlemmarna i uppsamlingslaget och registrerar de samlingar som samlas in (tabell 1). Efter enN första provsamling, färdigställd samtycke, blod och buccal swabs överförs till laboratoriemedlemmen, och givarens initialer, födelsedatum och annan relevant information, såsom provtypen, registreras. Detta möjliggör inspelning av de antal och typerna av prov som samlats in med varje patient under insamlingsproceduren. Flödesdiagrammen som sammanfattar behandlingen av både SCC-vävnad ( Figur 6 ) och ANT (Figur 7) är användbara verktyg för utbildning av ny personal i insamlingsförfaranden.
Figur 6: Flödesschema som avgränsar bearbetningen av SCC-prover. Vid tumörexcision utvärderas provets storlek. Om provet är ≤2 mm 3 används hela provet för Mohs-bearbetning, som bedömningen av rena marginaler (indikeringenÅtgärd av fullständigt tumöravlägsnande) är topprioriteten. Efter Mohs-bearbetning fryses eventuell återstående vävnad i flytande kväve och överförs till biorepository. Om provet är tillräckligt stort så att en> 2 mm 3 del av vävnaden kan avlägsnas uppsamlas denna del och placeras i ett rör innehållande cellodlingsmedium medan den återstående delen utnyttjas för Mohs-bearbetning och lagras som ovan. Den del av provet som avlägsnats till cellodlingsmedium segmenteras ytterligare, varvid ett ~ 0,5 mm 3 fragment avlägsnas och användes för att etablera en cellodlingslinje; Det återstående vävnadsfragmentet överförs till biorepository för nedströms protein och genuttrycksanalys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
er.within-sida = "1"> 
Figur 7: Flödesschema som avgränsar behandlingen av ANT-prover. Vid tiden för Mohs-stängning avlägsnas en del av intilliggande normal vävnad (ANT) och uppsamlas av Mohs-kirurgen. Om provstorleken är ≤2 mm 3 placeras hela provet i ett kryogent rör och frystes i flytande kväve före överföring till biorepository. Om provet är> 2 mm 3 placeras hela provet först i ett rör innehållande cellodlingsmedium. Provet snittas sedan vidare i ett ~ 0,5 mm 3- fragment, vilket skall användas för att etablera cellodlingslinjer. Den återstående vävnadssektionen överförs till biorepositoryen för att lagras för nedströms protein och genuttrycksanalys.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Detta protokoll är utformat för att minimera variationen bland prover inom biorepository. Koordinering och effektiv kommunikation mellan klinikpersonalen och mellan kliniken och all laboratoriepersonal är avgörande för att minimera variationer och maximera uppnåendet av högkvalitativt DNA, RNA och protein från vävnaderna. Medan DNA och protein i vävnaderna är robusta, om RNA är önskvärt är det kritiskt att hålla vävnaderna kalla och i lämpligt medium under uppsamling, transport och bearbetning för att upprätthålla RNA-integritet. Noggrann registrering är också avgörande för att länka patientproverna med deras historia och diagnos, eftersom denna information ofta behövs vid analys av resultat från nedströmsapplikationer.
Med det ökade intresset för personlig medicin och bioMarkörforskning har ett antal biorepositorier nyligen etablerats. Dessa är vanligtvis associerade med sjukhusbaserade kliniker i stora akademiska centra och har stora kostnader för installation och drift 2 , 8 , 19 . Utvecklingen av ett klinikbaserat biorepository för kutan cancerprov som genereras som en del av den dagliga praxisen har flera viktiga fördelar jämfört med andra biorepositier. För det första minimeras olika variationer i provhantering, som kan kompromissa nedströmsapplikationer, med en enda samlings- och provbehandlingsplats. För det andra, eftersom dessa donerade prover är ritade från en stabil patientpopulation, är tillgången till de-identifierade journaler och patientresultatdata oöverträffade. Dessa data kan anonymiseras och överföras från patientdiagrammet till biorepositorydatabasen vid provtagningstillfället eller vid ett uppföljningsbesök. För det tredje, med en lojal patientbas, klInikbaserad biorepository kan samla flera prover från samma patient, en provuppsättning som inte ofta erhålls i andra inställningar. En av begränsningarna i detta protokoll är att den har optimerats för kutana prov erhållna genom Mohs mikrografisk kirurgi och kan behöva modifieras för andra typer av vävnader eller kliniska förfaranden.
Sammantaget är ett av de viktigaste målen för biorepository att tillhandahålla ett brett spektrum av prover från samma givare för att göra det möjligt för forskare att fråga ett stort antal frågor, särskilt för utveckling av flytande biopsier och cancermarkörer. Specifikt skapar förmågan att korrelera tumörhistologi och uttryck av biomarkörer vid mRNA- och proteinhalterna till plasmaprover samt förmågan att referera till patientutfallsdata, skapa en unik kraftfull dataset. Vi hoppas att den klinikbaserade biorepositorymodellen kan användas för att lindra bristen på patientprover inom biomedicinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant, tilldelat EEH, och Midwestern University Office of Research och sponsrade program Intramural Grant, tilldelat KJL. Ytterligare stöd tillhandahölls av Affiliated Laboratories and Affiliate Dermatology. Vi tackar Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel och Ali Zaidi för deras tekniska hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA | ThermoFisher Scientific | 02-685-2B | |
| Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades | ThermoFisher Scientific | 50-949-411 | |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | ThermoFisher Scientific | 16-100-110 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-138 | |
| Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium | ThermoFisher Scientific | NC9791321 | |
| Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound | ThermoFisher Scientific | 50-363-579 | |
| Leica CM1950 Cryostat | Leica Biosystems | 14047743909 | |
| Frosted Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-343 | |
| Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 99-900-01 | |
| Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes | ThermoFisher Scientific | 03-337-7X | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| Boca Scientific BuccalT-Swab | ThermoFisher Scientific | NC9679349 | |
| Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer | ThermoFisher Scientific | 50-195-822 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | PI78443 | |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 05-401-203 | |
| Pellet Morter Cordless Homogenizer | ThermoFisher Scientific | 12-141-3 | |
| RNAse Free Pellet Pestle | ThermoFisher Scientific | 121-141-364 | |
| Forma SteriCycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 13-998-089 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | SH30071.02 | |
| Gibco Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12-634-028 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140148 | |
| Gibco 1 M Hepes | ThermoFisher Scientific | 15-630-130 | |
| Nunc Cell Culture 35 mm with Vent | ThermoFisher Scientific | 1256591 | |
| Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 | Abnova | MAB12583 | |
| Anti-p40 (p63 delta) antibody | Abnova | ABX-144A | |
| Anti MUC-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-7313 | |
| Anti-Snail + Slug (phospho S246) | Abcam | Ab63568 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 568 Phallodin | Molecular Probes | A12380 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P36941 | |
| Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera | Zeiss | 4300009901 | |
| Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera | Olympus | IX511F3 |
References
- Baker, M.
- Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
- Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
- National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
- Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
- Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
- Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
- Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
- Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
- Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
- Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
- Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
- Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
- Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
- Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
- Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
- Vaught, J.
