Summary
Kutanöz tümörler genellikle Mohs mikrografik ameliyattan sonra atılır. Klinik destek personelinin klinik operasyonlara müdahale etmeden, aşağısındaki laboratuvar uygulamaları için kutanöz tümörün ( örn., Skuamöz hücreli karsinoma, bazal hücreli karsinoma ve melanom) örneklerini etkili bir şekilde işleyip saklayabilmesini sağlayan bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Cilt kanseri insidansı (skuamöz hücreli karsinoma, bazal hücreli karsinom ve melanoma gibi) son birkaç yıldır artmaktadır. Biyomedikal araştırma çalışmaları için kutanöz tümör örnekleri için paralel bir talep olması bekleniyor. Bununla birlikte, klinik operasyonları etkilemeyen klinik örneklerin elde edilmesi için mevcut bir biyorepositoryasyonun sağlanması ve protokol eksikliğinden dolayı doku kullanılabilirliği sınırlıdır. Bir protokol, bir Mohs ameliyatı günü rutin klinik prosedürleri üzerinde en az etkili olan kutanöz tümör ve ilişkili kan ve tükürük numunelerini toplamak ve işlemek üzere oluşturulmuştur. Tümör örnekleri toplanır ve biyopside kanıtlanmış kutanöz habisler için ilk Mohs cerrahisi uygulanan hastalardan Mohs histotechnologist tarafından işlenir. Bitişik normal doku, cerrahi kapanma anında toplanır. Toplanan diğer numuneler tam kan ve böcek svaplarıdır. Normalde atılan doku örneklerini kullanarak, klinikte laboratuar ortamına göre ayarlanarak birkaç önemli avantaj sunan bir biyorepositoryum oluşturuldu. Bunlara, çok çeşitli toplanan numuneler dahildir; Patoloji raporları da dahil olmak üzere tanımlanmamış hasta kayıtlarına erişim; Ve tipik bağışta bulunanlar için, takip ziyaretleri sırasında ilave örneklere erişim.
Introduction
Kanser ve biyolojik belirteç araştırması, kaliteli insan dokusu örnekleri tedarikine dayanır ve sınırlı arz araştırmayı engelledi 1 , 2 . Pek çok dermatolojik çalışma, insan dokusunun kullanımı ile ilişkili yetersiz tedarik, değişken kalite ve maliyetlerle sınırlandırılmıştır. Büyük, özel bir biyobank kurma maliyetinin yaklaşık olarak 2 milyon dolar 3 olduğu tahmin edilmektedir ve bu maliyetler insan dokusunun kullanımını bir çok araştırmacıdan uzak tutmaktadır. Ayrıca, araştırma örnekleri üretme ve saklama süreci, klinik işlemleri etkileme ve dikkatli bir şekilde yürütülmemesine rağmen hasta bakımını erteleme riskini beraberinde getirir. Önerilen en iyi uygulamaları ve örnek validasyonunu takiben deri kanseri örneklerine odaklanan maliyet etkin, kliniğe dayalı bir biyorepositoryum oluşturulmuştur. 4 , 5 , 6 .
Mohs mikrografik cerrahi tekniğinin amacı, tüm kanser dokularının mümkün olduğunca sağlıklı dokusu muhafaza ederken çıkartılmasını sağlamaktır. Prosedür, tümör dokusunun ince tabakalarının kademeli olarak çıkarılmasını içerir. Ardışık her katman onunTüm kanser dokusunun ortadan kaldırılıp kaldırılmadığını belirlemek için bir dermatolog tarafından tolojik olarak incelendi (tümör dokusunun kriyoteksiyonundan sonra ve H & E boyaması uygulandıktan sonra). Dokuların müteakip katmanlarının eksizyonu ve muayenesi, hasta ofiste kalırken yapılır. Bu teknik SCC 9 için en iyi tedavi seçeneği olarak kabul edilmektedir. Bu noktada, yara kapanır ve iyileşme ve kozmetik görünümü iyileştirmek için bitişik normal doku (ANT) sıklıkla eksize edilir. Bu nedenle, bir tümörü çıkarmak için bu cerrahi prosedür, gelecekteki çalışmalar için histolojik olarak karakterize edilmiş doku toplamak için ideal bir şekilde uygundur.
Tümör dokusunun, bitişik normal doku, tükürük ve kan numunelerinin elde edilmesi için tedarik prosedürü, normal personel görevleri üzerinde en az etkiye sahip olacak şekilde tasarlanmıştır ( Şekil 1 ). Tıbbi asistanlar, hastayı prosedüre hazırlarken kan çeker. Mohs prosedürünü tamamladıktan sonra, M Ohs histotechnologist, numunenin ek histolojik slaytlarını hazırlar ve dokuyu biorepositoryale aktarır. Biyorepositoryumun kurulmasıyla ilgili maliyetler kriyoprezervasyon dondurucularının satın alınması, mütevazı klinik laboratuar alanının oluşturulması ve bir envanter izleme programının geliştirilmesini içerir.
Şekil 1: Numune toplama ve sorumlu personel sırası. Hasta muayenesi ve hasta onayının alınması üzerine tıbbi yardımcısı bukkal bir sürüntü toplar ve kan çekişi yapar. Dermatolog ve tıbbi asistan daha sonra tümörü çıkarır ve yarayı kapatır, bu sırada sırasıyla SCC ve ANT numuneleri toplanır. Özel bir laboratuar teknisyeni kanı işler ve SCC ve ANT örneklerini doku kültürü, korunması ve biyorepositoryale girmesi için keser.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.
Toplanan numunelerin çeşitliliği, çeşitli deneysel yaklaşımlar sağlar ( Şekil 2 ). Hastadan toplanan numuneler bukkal svablar (gerekirse tükrük de toplanabilir), tam kan ve eksize edilen doku. Genetik ve doku eşleştirmesi için bukal svaplar ve tam kan örnekleri işlenmeksizin kaydedilir. Tam kan, gelecekteki analizler için beyaz kan hücresi (WBC) ve plazma fraksiyonlarına ayrılır. Mohs işlemesinden sonra, dondurulmuş tümör direkt olarak sıvı azota yerleştirilir ve -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarılır. Taze, canlı tümör dokusu ve ANT numuneleri önceki tekniğin 10,11 tadilatları kullanılarak kültürlenir ve daha sonra dondurularak saklanır. Tahsilat sırasında, her numune tipinin numarası, girişe başlamadan önce bir elektronik tablo üzerine kaydedilir. Doğru işlemeyi kolaylaştırmak için envanter izleme programı ( Tablo 1 ).
Şekil 2: Klinik temelli biyorepositoryal örneklerin toplanması ve işlenmesinin ana hatları. Bukkal bir çubuk ve kan örneği hastadan toplanır ve aşağı akım genotiplendirme ve doku uyumu için saklanır. Tam kan, beyaz küre hücresi (WBC) izolasyonu ve CTC analizi için ve ayrıca plazma toplama ve sıvı biyopsi analizi için işlenir. Mohs işlemi sırasında eksize edilen doku, tanı amaçlı olarak histolojik olarak işlenir ve bundan sonra histolojik slaytlar, daha ileri immünohistokimyasal analizler için deneysel olarak kullanılabilir. Kesilen doku örneğinin yeterince büyük olması koşuluyla, taze dokuların bir kısmı çıkarılır ve protein ve RNA izolasyonu için ve kültürlenmiş hücre hatlarının kurulması için kesitlendirilir.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
| Koleksiyon Tarihi: | |||||
| Hasta 1 | Hasta 2 | Hasta 3 | Hasta 4 | Hasta 5 | |
| Baş harfleri ve doğum tarihleri | |||||
| Göz rengi | |||||
| Örnek Türü | |||||
| Örnek Konum | |||||
| Tükürük | |||||
| WDelik kan | |||||
| Plazma | |||||
| Tümör geçerli | |||||
| Doku Normal Normal | |||||
| Tümör Mohs Sıvı Azot | |||||
| Doku Normal Sıvı Azot | |||||
| Slaytlar |
Tablo 1: Örnek koleksiyonları kaydetmek için kontrol listesi. Toplanan her numuneyle birlikte izlenen ve kaydedilen veriler hasta baş harfleri, doğum tarihleri ve göz renginin (cilt tipi için) yanı sıra yereldirOn numune çıkarma. Toplanan tükürük numuneleri, kan alma hacimleri ve canlı ve korunmuş doku numunelerinin sayısı, daha sonraki kullanımlara tahsisler için referans olarak kaydedilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Numune toplama prosedürlerini doğrulamak için, her numune türü, aşağı akışlı uygulamalarda test edilmiştir. Önceki tekniklerin modifikasyonlarını kullanarak, tümör ve ANT, protein ve RNA izolasyonunda başarıyla kullanılmıştır ve potansiyel olarak DNA izolasyonu için kullanılabilir. Doku kesitlerinden kurulan canlı eksplantlar mikroskopi ile değerlendirilirken, depolanmış histolojik slaytlar immünohistokimya ve immünofloresan için kullanılmıştır.
Burada açıklanan protokolü izleyerek, bu modeli diğer dermatoloji kliniklerine, diğer tümör tiplerine (melanom gibi) genişletmek mümkündür., Ve diğer cerrahi spesiyaliteleri ve uygulamaları, insan kanserlerine yönelik çok yönlü araştırmalar için insan dokusu örnekleri sağlamak için kullanılmıştır. Bu protokolün ufak değişiklikler muhtemelen diğer uygulamalar için gereklidir, ancak ilke olarak, bu protokol hasta muamelesi sırasında toplanan hasta örneklerini düzenli olarak atan herhangi bir cerrahi uygulama için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan dokusu numuneleri üzerindeki tüm deneyler Western IRB tarafından onaylandı (WIRB Protokol # 20142461). Bu prosedürler için dokuların toplanması için tek kriter, biyopsi ile kanıtlanmış SCC tanısıdır. Orijinal IRB protokolünde hiçbir dışlama kriterleri belirtilmemiştir, ancak bilinen kan yoluyla bulaşıcı bir hastalığa sahip hastalardan numuneler kullanılmamıştır. Bilgilendirilmiş onam, kutanöz doku, kan ve tükrük toplanmadan önce elde edildi. Midwestern Enstitüsü İnceleme Kurulu, Midwestern Üniversitesi'nde (AZ # 807) klinik temelli biyorepositoryal örneklerle doğrulama çalışmalarını onayladı.
1. Kutanöz Tümör Doku İşleme
NOT: Bu, bir Mohs histotechnologist tarafından gerçekleştirilecektir.
- RNA ve Eksplant Kültürü İçin Yeni Skuamöz Hücreli Karsinom (SCC) Doku İşleme
- Doku Mohs cerrahı tarafından eksize edildiğinde, 10 ila 50 mg (≥10 mm 3 NOT: Bu, ancak tümör Mohs prosedürünün bir parçası olan histolojik değerlendirme öncesinde 10-50 mg boyutunda bir numunenin (≥10 mm2) çıkarılmasına izin verecek kadar büyükse mümkündür. Tümör, minimum 2 mm 3'ün çıkarılmasına izin verecek kadar büyük değilse, RNA için işlem yapmaya devam etmeyin (aşama 5'i atlayın).
- Canlı dokuyu, cımberi kullanarak kültür ortamı (1: 1 DMEM karışımı: Ham's F-12, 25 mM HEPES, 100 IU / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin) içeren etiketli bir 1.5 mL tüp içine aktarın ve Doku tamamen ortama batırılır. İlave işlemden önce bu tüpü 4 ° C'de saklayın.
- RNA izolasyonu ve ekspresyon analizi için dokuyu kullanın (bkz. Adım 5) ve / veya kuruluş(Bkz. 6. adım) 24 saat içinde eksplant kültüründen geçirilir.
- Hastadan çıkarılan tümör numunesinin geri kalanını (basamak 1.1.1) bir kriyostat doku tutucusu (veya "sıkıştırma çubuğu") üzerine yerleştirin. Mohs histolojisinin tamamlanmasına ve deneysel analiz için ilave histolojik slaytların hazırlanmasına izin vermek için, dokuyu optimum kesme ısısı (OCT) bileşiğine katıştırın, dokuyu tutucuya dondurarak tutun.
- Histolojik Slaytların Hazırlanması
- Bir kriyostat kullanarak 7 μm kalınlığında doku kesitlerini kesin ve her tümör numunesi için iki (veya daha fazla) slayt oluşturun. Her bir slaydın tümörün en fazla üç bölümünü içerdiğinden emin olun.
NOT: İki slayttan biri Mohs histotechnologist tarafından H & E ile boyanacak ve ilave slaytlar IF, IHC veya FISH analizi ile işlenebilir. - Doku düzeltmek için slaytlar 1-2 saniye boyunca aseton koyun. Bu slaytları kurumaya bırakın. H & E etmeyinDeneysel protokole bağlı olarak gelecekteki immünofloresan (İF), immünohistokimya (IHC) veya floresans in situ hibridizasyon (FISH) analizinde kullanılacak slaytı boyayın veya örtücü lamel kullanın.
- Bir kriyostat kullanarak 7 μm kalınlığında doku kesitlerini kesin ve her tümör numunesi için iki (veya daha fazla) slayt oluşturun. Her bir slaydın tümörün en fazla üç bölümünü içerdiğinden emin olun.
- Post-Mohs Doku İşleme
- Mohs işlemi tamamlandıktan (1.1-1.2 arası adımlar) sonra, kriyostat odasında çalışın ve kriyo yerleştirici ortamdan numuneyi alın ve etiketli kriyojenik bir tüp içine yerleştirin.
- Doku çözülmeden önce etiketlenmiş flakonu sıvı nitrojene yerleştirin. Proteinler ve / veya DNA analizi için örnekler kullanılacak olursa, ileride protein ekspresyonu ve DNA mutasyon analizi için saklanması için birkaç dakika içinde sıvı azot veya -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarılabilirler (aşama 4-5'e bakınız) .
NOT: Mohs sonrası örnekten bozulmamış RNA isteniyorsa, cryo-embedding aracı ortadan kaldırılırken numuneyi dondurulmuş tutmak önemlidir. Eğer aşırı dikkat edilmiyorsaBu adım, post-Mohs örneği, protein ve / veya DNA analizi için ayrılmış olmalıdır.
- Taze ANT İşleme
- Mohs kapanırken, Mohs cerrahından ANT alın.
- SCC örneğinden (yukarıya bakınız) normal dokunun apikal tarafından hasat edildiği gibi eşit veya daha fazla ANT'yi çıkarın ve etiketlenmiş bir 1.5 mL tüp içeren kültür ortamı (1: 1 DMEM karışımı: Ham's F- 12, 25 mM HEPES, 100 IU / mL penisilin ve 100 ug / mL streptomisin ile takviye edilmiştir) cımbız kullanılmıştır.
- Dokuyu aynı kültür ortamına tamamen batırın ve sonraki işleme kadar 4 ° C'de saklayın (4-6. Adımlara bakın).
2. Kan, tükürük ve bukkal bez işleme
- Venetikap ile EDTA toplama tüplerinde yaklaşık 10 mL kan elde edin.
- Kanı toplama tüplerinden steril 15 veya 50 mL santrifüj tüpüne aktarın. Kabarcıkları önleyerek yaklaşık 1.5 ml kriyojenik tüp içine yaklaşık 200 mcL çıkarın; Gerekirse, gelecekteki genotiplendirme ve doku uyumu için kullanılmak üzere bu tam kan örneğini -80 ° C'de saklayın.
- Kalan kanları 30 dakika 1,000 xg'de döndürün ve plazma fraksiyonunu toplamak için standart prosedürleri takip edin.
- Plazmayı 1.5 mL kriyojenik tüplerde 1 mL'lik artışlarla bölün ve ilerideki sıvı biyopsi analizlerinde kullanmak için -80 ° C'de saklayın.
- Bukkal bir sürüntü örneği almak için steril bir süpürge kullanın ve svabı, oda sıcaklığında steril bir tüp içinde saklayın.
- Gerektiğinde, bir tükürük örneği alın ve oda sıcaklığında steril bir tüp içinde saklayın.
NOT: Gerektiğinde, bu numuneler gelecekteki genotiplendirme ve doku eşleştirmesi için kullanılabilir.
3. Örneklerin Kayıt Dengesi
- Hasta numunelerinin kontrol listesinden bilgileri biyorepository veri tabanına aktarın. Hasta bilgilerini ve mesajı ekleHasta çizelgesindeki nosis.
- Her bir örnek için bir barkod ile etiket basın ve toplanan her numuneyi hasta verileri ile ilişkilendirmek için her birini veritabanına kaydedin.
- Numuneleri araştırma laboratuarı'na aktarmadan önce, tanımlanmamış numunelerin dağılımını biyo-yatıştırma veritabanında kaydedin.
4. Protein İzolasyonu ve Western Blot Analizi
- Her doku örneğini (SCC ve / veya ANT), dokuyu kirletmek için 100 mg doku için proteaz inhibitörleri ihtiva eden 500 μL hücre liziz tamponu ihtiva eden bir şişeye yerleştirin.
NOT: 50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 1.0 NP-40 ve% 0.1 SDS'den oluşan bir radyoimünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu kullandık. Diğer hücre liziz tamponları kullanılabilir. - Doku homojenize edici kullanarak 5 ° C'de 20'lik aralıklarla homojenize edin. Numuneleri 21,000 xg'de ve 4 ° C'de 20 dakika döndürün ve protein içeren süpernatanı yeni bir tüpe toplayınolmak. Aynı koşulları kullanarak süpernatantı tekrar döndürün ve nihai süpernatanı yeni bir tüp içine alın.
- Elektroforez% 4-20 SDS-poliakrilamid gradyan jel kullanarak her bir örnekten 30-50 μg protein. İsterseniz, protein bantlarını görselleştirmek için jel Coomassie Blue ile lekelenir.
- Eksprese edilen proteinlerin Western blot analizine ihtiyaç duyulursa, standart protokolleri izleyerek proteinleri jelden bir poliviniliden difluoride (PVDF) zarına aktarın. Aktarıldıktan sonra, Ponceau, arzu edilirse, protein bantlarını görselleştirmek için PVDF zarını lekeledi.
- Standart protokolleri izleyerek ilgilenilen proteinleri tespit etmek için PVDF membranını ve probu bloke edin. Üreticinin Western blot analizi için önerilen konsantrasyonlarda birincil antikorlara özgü ilgili sekonder antikorlarla birlikte, ilgili protein (ler) e özgün birincil antikorları kullanın.
- Problanmış membranı bir kemilüminesan substrat kullanarak maruz bırakın ve membranı bir imgeNg sistemi.
5. RNA İzolasyonu ve Nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR)
- Yeni doku örneklerini (SCC ve / veya ANT) bir RNA stabilizasyon çözeltisi içeren 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve post-Mohs doku örneklerini üretici önerileri izlenerek dondurulmuş bir doku geçiş çözeltisi içeren 1.5 mL tüp içine yerleştirin. Dokunun tamamen batırılmış olduğundan emin olun. Bu örnekleri kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.
- RNA örneklerini -80 ° C'den kaldırın ve buz üzerinde çözündürün. Doku, 50-100 mg doku başına 1 mL RNA ekstraksiyon tamponu (fenol / guanidin tiosiyanat) içeren yeni bir 1.5 mL tüp içine aktarın.
- Bir doku homojenleştirici kullanarak dokuları Lyse. Altı döngü homojenizasyon işlemini takiben bir örnek soğutma periyodu uygulayın; Her çevrim 4 ° C'de 20 s homojenleştirme ve 40 s'lik bir soğutma periyodundan oluşur. Homojenizasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 0.2 ekleML kloroform, 1 mL RNA ekstraksiyon tamponu başına karıştırın ve tüp 15 saniye boyunca elle çalkalayın. Oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin.
- Numuneleri 12,000 xg'de ve 4 ° C'de 15 dakika döndürün. Numunenin sulu fazını çıkarın ve yeni bir 1.5 mL tüp içine yerleştirin.
- Adım 5.2'de kullanılan RNA ekstraksiyon tamponunun her bir mL'si için 0.5 mL% 100 izopropanol sulu faza ilave edin ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
NOT: RNA verimi düşük olursa ( örn. Başlangıç dokusu hacmi 10 mg'dan az ise), numuneler gece boyunca -80 ° C'de çökeltilebilir. Ek olarak, RNA verimini arttırmak için izopropanol çökeltme aşamasında 500 uL RNA ekstraksiyon tamponu başına 5 μg RNaz içermeyen glikojen eklenebilir. - Numuneyi 12,000 xg'de 4 ° C'de 10 dakika döndürün. Süpernatantı çıkarın ve 1 mL% 75 etanol ile topağı yıkayın.
- Örneği kısaca vorteksleyin ve daha sonra 7,500 xg ve 4 ° 'de döndürünC, 5 dakika boyunca. Yıkamayı atın ve pelleti 5-10 dakika boyunca havayla kurutun.
- RNaz içermeyen suyun 20 μL'sinde RNA peletini tekrar süspanse edin.
- İstenirse, üreticinin tavsiyelerine göre bir RNA temizleme kiti kullanarak her RNA örneğini arıtın.
NOT: Bu adım atılırsa, küçük RNA'lar örnekten kaybolacaktır.
- İstenirse, üreticinin tavsiyelerine göre bir RNA temizleme kiti kullanarak her RNA örneğini arıtın.
- RNA kalitesini analiz etmek için% 1.2 formaldehit-MOPS agaroz jel kullanarak 1 μg elektroforez numunesi.
NOT: Alternatif olarak, numuneleri bir biyolojik analizci kullanarak analiz ederek bir RIN numarası 13 elde edin. - İlgilenen hedef mRNA'ların (veya miRNA'ların) qPCR analizi için bir ters transkripsiyon protokolünü kullanarak RNA'yı cDNA'ya tersine transkribe edin.
6. Doku İfade Kültürleri
- Kültürden önce eksize edilmiş dokuyu% 70 etanol içine daldırarak sterilize edin.
- Doku bir slayt ya da tabağa koyun ve yeterli kültür ortamı ilave edin (1: 1 DMEM karışımı: Ham & #(Dokunun kurumasını önlemek için)% 100 FBS, 25 mM HEPES, 100 IU / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş F-12 F-12). Doku bir bistüriyle parçalara (<1 mm 3 ) dikkatle kesin.
- Doku parçalarını 35 mm'lik bir doku kültürü çanağına aktarın ve her parçanın üzerine yaklaşık 20 mcL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
- Çanağı, 20-30 dakika boyunca ya da neredeyse kurumuşa kadar bir kültür davlumbazında bırakın.
- Her çanağa 1 mL kültür ortamı (1: 1 DMEM karışımı: Ham F-12,% 10 FBS, 25 mM HEPES, 100 IU / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomis ile takviye edilmiş) ilave edin ve 37 ° 'de inkübe edin C,% 5 C02 içinde. Kültürleri alt kültür veya alt klonlama gerekirse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tümör ve ANT, protein izolasyonunda başarıyla kullanılmış ve Western blotlama ile test edilmiştir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, klinik tabanlı biyo-yatıskınımızda toplanan ve saklanan hasta numunelerinde kutanöz skuamoz hücre karsinom belirteçleri (Muc1 14 , FHL-115 ve p40 16 , 17 ) tespit edilebilir.
Şekil 3: ANT ve SCC'den ekstrakte edilen proteinlerin analizi. Toplam protein, ANT ve SCC örneklerinden izole edildi ve SCC için bilinen işaretlerin ekspresyonu Western leke ile incelendi. Müsin 1'in (MUC1), Faktör H Beğenil (FHL-1) ve p40'ın (panel B) temsili Batı lekeleri gösterilmiştir. SavunmaBu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.
Yukarıdaki teknikler kullanılarak izole edilen RNA, jel elektroforezi, qPCR ve RNA bütünlüğü analizi ile test edilmiştir. Şekil 4, yüksek kaliteli, bozulmamış RNA'nın izole edildiği iki hasta örneğini göstermektedir. RNA, tüm aşağı akım uygulamaları için uygundur.
Şekil 4: Biyoanaliz kullanılarak yapılan RNA bütünlüğü analizi. Jel elektroforeziyle RNA boyutunun ve bütünlüğünün değerlendirilmesi (panel A). Ribozomal RNA oranı ve parçalanma ürünlerinin varlığı veya yokluğu da dahil olmak üzere RNA örneğinin elektroforetik izine dayanan her numune için bir RNA bütünlük numarası (RIN) oluşturuldu (panel B). "10" RIN değeri, herhangi bir bozunum ürünü olmaksızın mükemmel bir RNA örneğini temsil eder; buna karşılık "1" tamamen degrade olmuş bir sa'yı işaret ederyapıldığı Örnek. Bantların dansitometri profilleri, SCC ve ANT hasta dokusundan temsili RNA örnekleri için nükleotidlere (nt) karşı fluoresan birimler (FU) olarak (panel C) çizilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Doku bölümlerinden oluşturulmuş canlı eksplantlar mikroskopi ile değerlendirildi ( Şekil 5A ). Tümör ve ANT örneklerinden üretilen bu eksplant kültürleri, karışık keratinosit ve fibroblast kültürleridir. Bu kültürler alt kültürlenebilir veya gelecekteki hücre hattı gelişiminde kullanılabilir. Saklanan histolojik slaytlar immünohistokimya ve immünofloresan için kullanılmıştır. Şekil 5B'de gösterilen bir SCC örneği, SCC 18'de bir epitelial-mezenkimal geçiş markörü için pozitif boyanmayı göstermektedir.
Şekil 5: SCC bölümlerinin eksplant kültürü ve IF lekelenmesi. Bir anti-pSnail / Slug birincil antikor (panel B, Skala çubuğu = 25 μm) ile lekelenmiş skuamöz hücreli karsinom doku eksplantının (panel A, Ölçek çubuğu = 50 μm) faz kontrast görüntüsü ve Mohs mikrografik cerrahinin bir parçası olarak toplanan doku kesitleri ). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Deneysel olarak, dokuları sonuçları etkilemeksizin RNA izolasyonundan (adım 5) veya eksplant kültürüne (adım 6) 24-48 saat önce 4 ° C'de depolayabileceğini deneysel olarak tespit ettik. Jel elektroforezi veya biyolojik analizci ve RIN numarası ile değerlendirilen RNA verimi veya bütünlüğü tehlikeye atılmamaktadır. Ayrıca eksplant kültürleri, 4 ° C'de saklanan doku kullanılarak kolayca elde edilir.Zamanın uzunluğu. Bu, klinik ve araştırma laboratuarı arasında numuneler aktarılırken daha fazla esneklik sağlar. RNA izolasyonu ve eksplant kültürü, klinikte değil de araştırma laboratuarı'nda yapıldığından, bu özellik, klinik tabanlı biyo-yatıştırmayı daha önce beklediğimizden daha sağlam bir model haline getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yazarın bilgisine göre, bu protokol, kutanöz doku örneklerinin hem maliyet açısından hem de hızlı bir yaklaşımla klinik olarak tedarik edilmesine odaklanan türünün ilk örneğidir. Mohs mikrocerrahisi geçiren hastalar, genellikle belirli zaman dilimlerinde planlanır ve toplama işlemi bu sürelerle sınırlıdır. Numune toplama işlemi, hasta bakımında görev alan tıbbi asistandan, tümör numunelerini işleyen Mohs histotechnologist'ten ve numune girişini ve kan işlemeyi yürüten belirlenmiş bir laboratuar çalışanı çaba gerektirir.
Toplama ekibinin üç üyesi (tıbbi asistan, Mohs histotechnologist ve laboratuvar teknisyeni) arasında dikkatli bir koordinasyon ile, mevcut tıbbi yardım görevlilerinin 3-5 doku numunesinin toplanmasıyla ilgili ek görevleri tamamlayabildiğini bulduk Klinik operasyonlar> nda herhangi bir gecikme olmaksızın günlük olarak. Hastanın rızasını almak Ve bukkal sürüntülerin toplanması ve kan, Mohs mikrocerrahi prosedürüyle ilgili normal bekleme süreleri boyunca tamamlanır. Bir numunenin işlenmesiyle ilgili karar vermenin yanı sıra, hasta numunelerinin Mohs işlemesinin sonunda Mohs histotechnologistin sorumlu olduğu görevler tamamlanır ve günlük programa genellikle yaklaşık 30 dakika eklenir. Tipik olarak klinik personelinden bir üye, kan numunelerinin etiketlenmesinden ve işlenmesinden ve herhangi bir veri tabanına aktarılmasına ve numuneye girilmesinden sorumludur. İşlenen numune sayısına bağlı olarak, bu görevler mevcut görevlerden uzaklaşmak için önemli zaman gerektirebilir; Dolayısıyla, numune toplama işlemi yalnızca yeterli laboratuar personeli olduğunda yapılmalıdır. Spesifik olarak, tek bir günde 5ten fazla numune toplanıyorsa veya hastalardan birkaç kan numunesi alınırsa, laboratuvar teknisyeninden birkaç saat ek çaba gereklidir.
Toplama günlerinde, tıbbi yardım görevlileri (MA), hastalardan dokuların bağışı için onay alırlar MA, daha sonra bukkal bir süpürge alır (gerekirse tükürük) ve laboratuar personeli tarafından işlenmesi için kan toplar. Bu örneklerin toplanmasından sonra hasta katılımı, böylece hastanın bakış açısından, klinik ziyaretinin geri kalanı değişmeden (herhangi bir takip ziyareti sırasında kan bağışı istenirse de) şu anda hastaların% 70'inin onayladığını tahmin edebiliriz Doku bağışında% 30 oranında kan bağışı,% 30 oranında katılma oranı düştüğü halde biyopsi ile kanıtlanmış kanser tanısı konmuş hastalar biyorepositoryale dahil edilmektedir Kan yoluyla bulaşıcı olan ve kan yoluyla bulaşabilen bir hastalığı olan hastalar hariç tutulmuştur .Laboratuar personeli, toplama ekibinin diğer iki üyesiyle koordinasyon yapmaktan sorumludur ve toplanan örnekleri kaydetmektedir (Tablo 1). Birİlk numune toplanması, tamamlanmış onay formu, kan ve bukkal sürüntüler laboratuvar personeline aktarılır ve donörün baş harfleri, doğum tarihleri ve numune türü gibi diğer ilgili bilgiler kaydedilir. Bu, toplama prosedürü sırasında her hasta ile toplanan numunelerin sayı ve türünün kaydedilmesini sağlar. Hem SCC dokusunun ( Şekil 6 ) hem de ANT'nin (Şekil 7) işlenmesini özetleyen akış şemaları, toplama prosedürlerinde yeni personelin eğitimi için yararlı araçlardır.
Şekil 6: SCC örneklerinin işlenmesini tanımlayan akış şeması. Tümör eksizyonu üzerine numunenin büyüklüğü değerlendirilir. Numune ≤2 mm3 ise, tüm numune, temiz kenar boşluklarının değerlendirmesi olarak Moh işleme için kullanılır (göstergelerTam tümör çıkarma işlemi) en öncelikli konudur. Mohs işleminden sonra, kalan tüm dokular sıvı azot içerisinde dondurulur ve biyorepositoryale aktarılır. Eğer numune, dokunun> 2 mm3'lük bir kısmı çıkarılabilecek kadar büyükse, bu kısım toplanır ve hücre kültürü ortamı içeren bir tüp içine konur, geriye kalan kısım ise Mohs işlemi için kullanılır ve yukarıdaki gibi saklanır. Hücre kültürü ortamı için çıkarılan numune kısmı, ~ 0.5 mm3 parçası çıkarılarak hücre kültürü çizgisi kurulması için daha da parçalara ayrılır; Geriye kalan protein ve gen ekspresyon analizi için kalan doku parçası biorepositoryale aktarılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
er.within-page = "1"> 
Şekil 7: ANT örneklerinin işlenmesini tanımlayan akış şeması. Mohs kapatıldığı sırada bitişik normal dokunun (ANT) bir kısmı çıkarılır ve Mohs cerrahı tarafından toplanır. Örnek büyüklüğü ≤2 mm3 ise, tüm örnek kriyojenik bir tüp içine yerleştirilir ve biyorepositoryale aktarmadan önce sıvı azot içerisinde dondurulur. Numune> 2 mm 3 ise, tüm numune önce hücre kültürü ortamı içeren bir tüp içine yerleştirilir. Sonra, numune, hücre kültürü çizgilerinin oluşturulması için kullanılmak üzere ~ 0.5 mm3 parçaya bölünmüştür. Kalan doku kesiti, protein ve gen ekspresyon analizi için depolanmak üzere biyorepositoryale aktarılır.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız .
Bu protokol, biyorepositoryumdaki örnekler arasındaki varyasyonu en aza indirgemek üzere tasarlanmıştır. Değişkenliği en aza indirgemek ve dokulardan yüksek kaliteli DNA, RNA ve protein elde etmeyi en üst düzeye çıkarmak için klinik personeli ile klinisyen ve laboratuvar personeli arasındaki koordinasyon ve etkin iletişim gereklidir. Doku içindeki DNA ve protein sağlam olmasına rağmen, RNA isteniyorsa, RNA bütünlüğünü korumak için dokuları, toplama, nakliye ve işleme sırasında soğuk ve uygun ortamda tutmak önemlidir. Hasta numunelerini geçmişi ve tanılarıyla ilişkilendirmek için doğru kayıt tutma da hayati önem taşımaktadır; çünkü bu bilgiler genelde aşağı akışlı uygulamalardan gelen sonuçları analiz ederken gereklidir.
Kişiselleştirilmiş tıp ve biyoya olan ilginin artmasıyla birlikteIşaretçi araştırması, son zamanlarda bir dizi biyoortalama oluştu. Bunlar genellikle büyük akademik merkezlerde hastane tabanlı kliniklerle ilişkilidir ve kurulum ve çalıştırma ile ilgili önemli maliyetleri vardır 2 , 8 , 19 . Günlük uygulamanın bir parçası olarak üretilen kutanöz kanser numuneleri için bir klinik tabanlı biyorepositoryumun geliştirilmesi, diğer biyo-yatıştırıcılara kıyasla birkaç önemli avantaja sahiptir. İlk olarak, tek bir toplama ve numune işleme sitesi ile, numune alma işlemlerinde, aşağı akışlı uygulamalardan ödün verebilecek varyasyonlar en aza indirgenir. İkincisi, bu bağışlanan numuneler istikrarlı bir hasta popülasyonundan alındığından, tanımlanmamış tıbbi kayıtlara ve hasta sonuç verilerine erişim benzersizdir. Bu veriler, anonim hale getirilebilir ve numune toplama sırasında veya takip ziyaretinde hasta grafikten biyo-yatıştırma veri tabanına aktarılabilir. Üçüncü olarak, sadık bir hasta tabanıyla, clInik temelli biyorepositoryasyon, aynı hastadan çok sayıda numune toplayabilir, diğer ayarlarda sıklıkla elde edilmemiş bir numune seti. Bu protokolün sınırlamalardan biri, Mohs mikrografik cerrahiyle elde edilen kutanöz örnekler için optimize edilmiş olması ve diğer doku türleri veya klinik prosedürler için modifiye edilmesi gerekebilmesidir.
Genel olarak, biyorepositoryonun ana hedeflerinden biri, aynı donörden, geniş bir yelpazede, özellikle de sıvı biyopsi ve kanser belirteçlerinin geliştirilmesi için geniş bir yelpazede spesifik örnekler sunmaktır. Spesifik olarak, tümör histolojisini ve mRNA ve protein seviyelerindeki biyolojik belirteçlerin plazma örneklerine ekspresyonunu ve hastanın sonuç verilerini referans alma becerisini birbiriyle ilişkilendirme özelliği, benzersiz bir güçlü veri kümesi oluşturur. Klinik bazlı biyorepository modelin, biyomedikal araştırmalarda hasta örneklerinin yetersizliğinin hafifletilmesine yardımcı olabileceğini umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, EEH'ye verilen Midwestern Üniversitesi Sağlık Bilimleri Araştırma Kolaylığı Hibe Grubundan ve Midwestern Üniversitesi Araştırma ve Destekleme Programları Ofisi'nden (Intranüal Grant) KJL'ye verilen fonlardan desteklenmiştir. Bağımlı Laboratuarlar ve Bağlı Dermatoloji tarafından ek destek sağlanmıştır. Teknik yardımları için Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel ve Ali Zaidi'ye teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA | ThermoFisher Scientific | 02-685-2B | |
| Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades | ThermoFisher Scientific | 50-949-411 | |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | ThermoFisher Scientific | 16-100-110 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-138 | |
| Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium | ThermoFisher Scientific | NC9791321 | |
| Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound | ThermoFisher Scientific | 50-363-579 | |
| Leica CM1950 Cryostat | Leica Biosystems | 14047743909 | |
| Frosted Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-343 | |
| Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 99-900-01 | |
| Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes | ThermoFisher Scientific | 03-337-7X | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| Boca Scientific BuccalT-Swab | ThermoFisher Scientific | NC9679349 | |
| Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer | ThermoFisher Scientific | 50-195-822 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | PI78443 | |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 05-401-203 | |
| Pellet Morter Cordless Homogenizer | ThermoFisher Scientific | 12-141-3 | |
| RNAse Free Pellet Pestle | ThermoFisher Scientific | 121-141-364 | |
| Forma SteriCycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 13-998-089 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | SH30071.02 | |
| Gibco Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12-634-028 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140148 | |
| Gibco 1 M Hepes | ThermoFisher Scientific | 15-630-130 | |
| Nunc Cell Culture 35 mm with Vent | ThermoFisher Scientific | 1256591 | |
| Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 | Abnova | MAB12583 | |
| Anti-p40 (p63 delta) antibody | Abnova | ABX-144A | |
| Anti MUC-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-7313 | |
| Anti-Snail + Slug (phospho S246) | Abcam | Ab63568 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 568 Phallodin | Molecular Probes | A12380 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P36941 | |
| Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera | Zeiss | 4300009901 | |
| Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera | Olympus | IX511F3 |
References
- Baker, M.
- Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
- Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
- National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
- Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
- Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
- Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
- Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
- Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
- Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
- Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
- Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
- Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
- Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
- Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
- Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
- Vaught, J.
