Elektrofysiologisk karakterisering av kardiomyocytter avledet fra humane pluripotente stamceller (hPSC-CM) er avgjørende for hjertesykdomsmodellering og for å bestemme legemiddelresponser. Denne protokollen gir den nødvendige informasjonen for å dissociere og plater hPSC-CM på multi-elektrode arrays, måle deres feltpotensial og en metode for å analysere QT og RR intervaller.
Kardiomyocytter kan nå utledes med høy effektivitet fra både humane embryonale og humane induserte pluripotente stamceller (hPSC). HPSC-avledede kardiomyocytter (hPSC-CMs) blir stadig mer anerkjent som har stor verdi for modellering av kardiovaskulære sykdommer hos mennesker, spesielt arytmi-syndromer. De har også vist relevans som in vitro- systemer for å forutsi medisinrespons, noe som gjør dem potensielt nyttige for narkotika-screening og funn, sikkerhetsfarmakologi og kanskje til slutt for personlig medisin. Dette ville bli lettere ved å utlede hPSC-CM fra pasienter eller følsomme individer som hiPSCs. For alle anvendelser er imidlertid nøyaktig måling og analyse av hPSC-CM elektriske egenskaper avgjørende for å identifisere endringer på grunn av hjertejonskanalmutasjoner og / eller legemidler som målretter ionkanaler og kan forårsake plutselig hjertedød. Sammenlignet med manuell patch-klemme, gir multi-elektrode array (MEA) enheter fordelene vedTillater opptak av medium til høy ytelse. Denne protokollen beskriver hvordan man dissocierer 2D-cellekulturer av hPSC-CM til små aggregater og enkeltceller og plater dem på MEA for å registrere sin spontane elektriske aktivitet som feltpotensial. Metoder for å analysere de registrerte dataene for å trekke ut spesifikke parametere, så som QT og RR intervaller, er også beskrevet her. Endringer i disse parametrene kan forventes i hPSC-CM som bærer mutasjoner som er ansvarlige for hjertearytmier og etter tilsetning av bestemte stoffer, slik at det kan påvises de som har en kardiotoksisk risiko.
Human Pluripotent Stamceller (hPSCs) har kapasitet til selvfornyelse og genererer nesten hvilken som helst celletype av menneskekroppen gjennom differensiering 1 , 2 . Detaljert protokoller om hvordan å dirigere differensiering av hPSCs i flere hjertestammer (ventrikulære, atriale, pacemakerlignende kardiomyocytter) er beskrevet 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Kardiomyocytter er elektriskt aktive celler og detaljert kunnskap om deres elektrofysiologiske aktivitet kan være ekstremt informativ for å forstå hjerteutvikling og sykdom 8 . Pasientspesifikke hiPSC-avledede kardiomyocytter (hiPSC-CMer) har blitt brukt til å modellere og studere de cellulære, molekylære og elektriske egenskapene til flere hjertearytmier, inkludert Long QT Syndrome(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , Brugada syndrom 14 og katekolaminerge polymorfe ventrikulære takykardier 15 , 16 . Videre har flere legemidler blitt tilsatt syke hiPSC-CMer for å rekapitulere terapeutisk inngrep og å redde de cellulære patologiske fenotypene 10 , 15 , 20 , 21 , 22 . Mer nylig har screeningsplattformer basert på WT hiPSC-CM blitt utviklet som respons på behovet for menneskelige systemer til de tidlige faser av legemiddelforskning 23 , 24 , 25 da gnagekardiomyocytter varierer dypt fra huMans i ionkanaluttrykk og biofysikk 26 .
Til dette formål blir teknologier som er egnet for medium til høy gjennomstrømning, utviklet og implementert. Disse inkluderer optiske opptak av membranpotensial, Ca 2+ transienter og belastning, impedansmålinger (som et indirekte mål på cellekontraktilitet) og ekstracellulære feltpotensial (FP) målinger (for gjennomgang se referanse 24 ). Multi-elektrode Arrays (MEA) enheter tillater registrering av de elektriske bølgeformsignalene (eller FPs) generert og formet av monolag eller små klynger av kardiomyocytter. FP-konturen korrelerer med hjertevirkningspotensialet og, til en viss grad, med elektrokardiogramopptakene (EKG) 27 ; De viser vanligvis en innledende rask oppstramming som tilsvarer Na + tilstrømning og membran depolarisering (R / Q peak), en langsom bølge / platåfase som sannsynligvis svarer til Ca2 + tilstrømning, og en repolarisasjonsfase som tilsvarer en overveiende K + effluks (T-topp). Perturbation av FP bølgeformen kan korreleres med endringer i spesifikke handlingspotensiale faser 28 .
Selv om patch clamp-opptak av handlingspotensialer kan være mer informativ, spesielt for parametere som oppstrekningshastighet og hvilemembranpotensial, er manuelle målinger ikke mulige for eksperimenter ved middels og høy gjennomstrømningsskala, mens automatisert patch clamp bare nylig er blitt brukt på hPSC -CM 29 . Siden langvarig opptak på MEA tillater både akutt og kronisk eksponering for forbindelser som skal undersøkes, er det nå mulig å bruke hPSC-CM-plattformer for narkotika-screening, funn 24 , 30 og for sikkerhetsfarmakologi 31 , 32 . Dette holder løftet om fremtidig presisjon eller persoNalisert medisin 33 .
Formålet med denne protokollen er å gi den nødvendige informasjonen for dissociating og plating hPSC-CMs på MEA-sjetonger og måling av deres FP. I denne prosedyren har hvert trinn blitt optimalisert, slik at optimal celleoverlevelse og gjenoppretting etter dissosiasjon, optimal cellefesting til MEA-platen og standardisert analyse og kvantifisering av parametere. Spesielt forklares og eksemplifiseres prosedyren for ekstracellulær FP-registrering, analyse av QT- og RR-intervaller, og evaluering av medikamenteffekter.
Denne protokollen viser hvordan å dissociere og forberede hPSC-CMer for å måle deres FP ved hjelp av MEA. HPSC-CM viser vanligvis spontan elektrisk aktivitet, som kan måles som FP og kan gi meningsfylt data med hensyn til slagfrekvens, QT-intervallvarighet og arytmiske hendelser.
Dissociation av 2D-hjerte-differensierte kulturer er nødvendig for å gjenskape et slaglag på MEA og det representerer et kritisk trinn. Mekanisk stress ved gjentatte pipetterings- og / eller aggressive dissosiasjonsenzymbehandlinger kan føre til høy celle dødelighet, manglende tilknytning til MEA-platen og mangel på spontan elektrisk aktivitet. Denne protokollen er optimalisert for monolagskulturer. Imidlertid kan en lignende tilnærming brukes til tredimensjonale (3D) kulturer ( f.eks. Embryoidlegemer eller EBs) med mindre modifikasjoner, som for eksempel innsamling av EB-er etterfulgt av PBS-vask og lengre inkubasjonstid med dissocierende enzym. ImportAntly, i både 2D- og 3D-differensierte kulturer, jo eldre de differensierte celler, kan den lengre inkubasjonstid som er nødvendig, være å løsne cellene på grunn av økt ekstracellulær matriksdeposisjon.
Protokollen beskrevet her for å kvantifisere FP parametere kan brukes til å generere dose-respons kurver for kardioaktive stoffer. Som nylig beskrevet av Cavero et al. 31 , kan startkonsentrasjonen av et medikament dypt påvirke utfallet av en MEA-måling. For å forbedre nøyaktigheten og påliteligheten av resultatene foreslår vi derfor følgende: 1) Ved irreversible aktivatorer / blokkere, bruk relativt store mengder medium som inneholder stoffet som skal testes. Fjern nærmere 10-50% av mediumvolumet fra MEA-brikken og tilsett et like stort mengde medium der stoffet tidligere ble oppløst ved riktig konsentrasjon. I dette tilfellet, for å beregne den endelige legemiddelkonsentrasjonen, er det kritisk å vurdereEr endringen i konsentrasjon etter medium fjerning. 2) Ved reversible aktivatorer / blokkere, tilsett 10 μL av hver dose fra en 100X stamløsning.
Flertallet av hjerteforskjellprotokollene resulterer i en variabel blandet populasjon av nodallignende, atrielignende og ventrikulære kardiomyocytter, med ventrikulær typen som den mest representert. Dette kan utgjøre en begrensning ved modellering av hjertesykdommer som påvirker en spesifikk kardiomyocyt-subtype eller medikamenter som virker på hjerte-subtypespesifikke ionkanaler. Selv om flere studier har optimalisert forhold for å styre mer kontrollert spesifikasjon under hjerteforskjellingen 3 , 5 , 37 , 38 , er deres bredere anvendelighet fortsatt under undersøkelse.
Videre varierer effektiviteten av differensiering (i forskjellige eksperimenter og i diFferent hPSC linjer) kan observeres 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Kardiomyocyt-berikende strategier basert på overflateproteinuttrykk 35 , 45 (ved hjelp av florescensassistert cellesortering eller ved valg av magnetisk perle 46 , 47 ) og metabolsk utvelgelse 44 , 48 kan utgjøre gyldige strategier som kan anvendes på noen (genetisk modifiserte eller Umodifisert) hPSC-linjens forhåndsplating av hPSC-CM, for å forbedre det elektriske signalet.
Selv om hPSC-CM er notorisk umodne sammenlignet med humane voksne kardiomyocytter 4 , 49 , har de vist seg å være verdifulle i rEcapitulering og identifisering av spesifikke sykdomsrelaterte endringer ( f.eks . I kanalopatier) 19 , 20 , 50 og medikamentinducerte responser ( f.eks. Kardiale ionkanalblokkere) 4 , 51 . Videre er umodne celler lettere å dissociere og utvinne bedre enn voksne kardiomyocytter etter dissosiasjon og plating 44 Derfor kan hPSC-CM umodenhet belønnes som en fordel i denne henseende. Men for å kunne rekapitulere f.eks . Sentielle hjertesykdommer og sentral reproduksjon av legemiddelresponser av voksne kardiomyocytter, en mer moden mekanisk, metabolisk og elektrisk hPSC-CM-tilstand bør oppnås. Metoder for å modne disse cellene inkluderer forlenget tid i kulturen 52 , mekanisk stamme 53 , elektrisk pacing 54 , tilsetning av småMolekyler 55 , 3D-kultur 56 , samkultur med andre celletyper 57 , og til og med en kombinasjon av disse tilnærmingene 58 ; Hittil har ingen av disse tilnærmingene ført til en voksenlignende fenotype.
Som en del av umodenhetsegenskapene viser hPSC-CMs elektrisk automatikk. Her er det gitt detaljer om hvordan du nøyaktig kan kvantifisere QT og RR intervaller. En begrensning for å måle spontan elektrisk aktivitet er at sammenligning av QT-intervaller kan være vanskelig når hPSC-CM viser forskjellige slagfrekvenser. I dette tilfellet kan Bazett eller Fridericia formler brukes til å korrigere QT-intervallet for frekvensen. Som tidligere rapportert, anbefaler vi sterkt at du utfører Major-Axis regresjonsanalyse ved å plotte QT-intervallet mot RR-intervall for både rå og korrigert data, for å utelukke eventuelle muligheter som skyldes selve korreksjonsmetoden.
Protokollen som presenteres her sammen med tidligere beskrevne metoder 59 , 60, hjelper standardiseringen av prosedyrene og analysen av hPSC-CM FPs, forbedrer data-reproduserbarhet og tillater en bedre sammenligning av inter-laboratorieresultater.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: CVON (HUSTCARE): Det nederlandske kardiovaskulære forskningsinitiativet (den nederlandske hjertefonden, den nederlandske føderasjonen av universitetsmedisinske sentre, den nederlandske organisasjonen for helseforskning og utvikling og det kongelige nederlandske vitenskapsakademiet) Det europeiske forskningsrådet (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). Vi takker E. Giacomelli (LUMC) for hjelp med hPSC-hjerteforskjellingen.
Biological safety cabinet/laminar flow hood | Cleanair | ||
MEA2100 in vitro recording system | Multi Channel Systems | ||
CO2 cell culture incubator | Sanyo | MCO-15A | |
Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
Leica stereomicroscope | Leica Microsystems | MS5 | |
Handheld pipetman (P-10 (10μL), P-200 (200μL), P-1000 (1000μL)) | Gilson International | ||
Filter tips (10 μL, 200μL, 1000μL) | Corning | 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL) | |
Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) | Millipore | SCGVU02RE | |
Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL) | |
Tweezers | Dumont | ||
Autoclavable Petri dishes | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
MEA chip | Multi Channel Systems | MEA200/30iR-Ti-gr | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040-091 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-169 | |
Human recombinant fibronectin | Tebu-Bio | J64560 | |
Custom made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings | LUMC: department of Instrument Development | ||
Dissociation enzyme – TrypLE Select 1X | Thermo Fisher Scientific | 12563-029 | |
Tergazyme enzyme detergent | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | |
Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230-089 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for LI-BPEL medium | |||
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21056-023 | |
F12 | Thermo Fisher Scientific | 31765-027 | |
Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
Protein Free Hybridoma Medium-II (PFHMII) | Thermo Fisher Scientific | 12040-077 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Bovogen Biologicals Australia | BSAS05 | |
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Chemically Defined Lipid Concentrate (CDLC) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100X | Thermo Fisher Scientific | 51599-056 | |
α-Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Name | Company | Software version | Comments |
MC_Rack | Multi Channel Systems | 4.6.2 | Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems) |
TCX Control | Multi Channel Systems | 1.3.4 | |
MEA Select | Multi Channel Systems | 1.3.0 | |
MC_Data Tool | Multi Channel Systems | 2.6.15 | Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.) |
Clampfit | Molecular Devices | 7.0.0 | Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code. |