Summary
A caracterização eletrofisiológica de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC-CMs) é crucial para a modelagem de doenças cardíacas e para a determinação de respostas de fármacos. Este protocolo fornece as informações necessárias para dissociar e plaquear hPSC-CMs em matrizes de múltiplos eléctrodos, medir o seu potencial de campo e um método para analisar os intervalos QT e RR.
Abstract
Os cardiomiócitos podem agora ser derivados com alta eficiência tanto de células embrionárias humanas como de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos (hPSC). Os cardiomiócitos derivados de hPSC (hPSC-CMs) são cada vez mais reconhecidos como tendo grande valor para a modelização de doenças cardiovasculares em seres humanos, especialmente síndromes de arritmia. Eles também demonstraram relevância como sistemas in vitro para prever respostas de fármacos, o que os torna potencialmente úteis para o rastreio e descoberta de fármacos, farmacologia de segurança e talvez, eventualmente, para medicina personalizada. Isto seria facilitado pela obtenção de hPSC-CMs de pacientes ou indivíduos susceptíveis como hiPSCs. No entanto, para todas as aplicações, a medição e a análise precisas das propriedades eléctricas da hPSC-CM são essenciais para identificar as alterações devidas às mutações do canal iónico cardíaco e / ou fármacos que visam os canais iónicos e podem causar morte cardíaca súbita. Em comparação com o patch-clamp manual, os dispositivos de matriz de múltiplos eletrodos (MEA) oferecem a vantagem dePermitindo gravações de média a alta produtividade. Este protocolo descreve como dissociar culturas de células 2D de hPSC-CMs para pequenos agregados e células individuais e plaqueá-los em MEAs para registrar sua atividade elétrica espontânea como potencial de campo. Métodos para analisar os dados gravados para extrair parâmetros específicos, tais como os intervalos QT e RR, também são descritos aqui. Alterações nesses parâmetros seriam esperadas em hPSC-CMs portadores de mutações responsáveis por arritmias cardíacas e após a adição de drogas específicas, permitindo a detecção de portadores de risco cardiotóxico.
Introduction
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) têm a capacidade de auto-renovar e gerar praticamente qualquer tipo de célula do corpo humano através da diferenciação 1 , 2 . Foram descritos protocolos detalhados sobre como direcionar a diferenciação de hPSCs em várias linhagens cardíacas (ventriculares, atriais, cardiomiócitos tipo marcapasso) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Os cardiomiócitos são células eletricamente ativas e o conhecimento detalhado de sua atividade eletrofisiológica pode ser extremamente informativo para a compreensão do desenvolvimento cardíaco e da doença 8 . Os cardiomiócitos derivados do hiPSC específicos do paciente (hiPSC-CMs) foram utilizados com sucesso para modelar e estudar as características celulares, moleculares e eléctricas de várias arritmias cardíacas, incluindo a Síndrome do QT Longo(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , síndrome de Brugada 14 , e taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica 15 , 16 . Além disso, vários fármacos foram adicionados aos hiPSC-CMs doentes para recapitular a intervenção terapêutica e para resgatar os fenotipos patológicos celulares 10 , 15 , 20 , 21 , 22 . Mais recentemente, foram desenvolvidas plataformas de rastreio baseadas em WPSH-CMs, em resposta à necessidade de sistemas humanos para as fases iniciais da descoberta de fármacos 23 , 24 , 25 , uma vez que os cardiomiócitos de roedores diferem profundamente de huEm expressão de canal iônico e biofísica 26 .
Para este fim, estão sendo desenvolvidas e implementadas tecnologias adequadas para aplicações de médio e alto rendimento. Estes incluem gravações ópticas de potencial de membrana, transientes de Ca2 + e medidas de deformação, impedância (como medida indireta da contractilidade celular) e medidas de potencial de campo extracelular (FP) (ver referência 24 ). Dispositivos de matrizes de múltiplos eléctrodos (MEA) permitem a gravação dos sinais de forma de onda eléctrica (ou FPs) gerados e modelados por monocamadas ou pequenos agrupamentos de cardiomiócitos. O contorno FP está correlacionado com o potencial de ação cardíaca e, em certa medida, com os registros de eletrocardiograma (ECG) 27 ; Eles tipicamente mostram um impulso rápido inicial correspondente ao influxo de Na + e despolarização da membrana (pico R / Q), uma fase de onda lenta / platô provavelmente correspondente ao fluxo de Ca2+, e uma fase de repolarização correspondente a um efluxo de K + predominante (pico T). A perturbação da forma de onda FP pode ser correlacionada com mudanças em fases de potencial de ação específicas 28 .
Embora as gravações de clamp de potenciais de ação possam ser mais informativas, especialmente para parâmetros como velocidade ascendente e potencial de membrana em repouso, as medições manuais não são viáveis para experimentos em escala de médio e alto rendimento, enquanto o grampeador de patch automatizado só recentemente foi aplicado a hPSC -CMs 29 . No entanto, uma vez que as gravações prolongadas nos MEAs permitem a exposição aguda e crónica aos compostos a serem estudados, é agora possível utilizar plataformas hPSC-CM para o rastreio de fármacos, descoberta 24 , 30 e para a farmacologia de segurança 31 , 32 . Isso mantém a promessa de precisão futura ou persoMedicina naturalizada 33 .
O objectivo deste protocolo é fornecer as informações necessárias para dissociar e plaquear hPSC-CMs em chips MEA e medir o seu FP. Neste procedimento, cada passo foi optimizado, assegurando uma sobrevivência e recuperação óptimas das células após a dissociação, ligação óptima das células à placa MEA e análise e quantificação padronizadas dos parâmetros. Em particular, o procedimento para o registo de FP extracelular, a análise dos intervalos QT e RR e a avaliação dos efeitos de fármacos são explicados e exemplificados.
Protocol
1. Preparação de Soluções e Reagentes
- Preparar o meio de cultura hPSC-CM utilizando meio de baixa insulina, albumina de soro bovino, álcool polivinílico, lípidos essenciais (LI-BPEL) 34 , 35 , 36 combinando os reagentes descritos na Tabela 1 . Filtrar o meio através de um filtro de poros de 0,22 μm e armazenar a 4 ° C por até 2 semanas.
- Preparar solução-mãe de fibronectina recombinante humana reconstituindo 1 mg de fibronectina recombinante humana em 5 mL de água destilada estéril para atingir 200 μg / mL de concentração, alíquota e armazenar a -80 ° C.
- Preparar solução de detergente enzimático a 1% (p / v) (ver Tabela de Materiais ), para ajudar a remoção de células residuais do chip de microarray, dissolvendo 1 g de detergente enzimático em pó em 100 mL de água morna (~ 40-45 ° C) água desionizada. Deixar a solução arrefecer e armazenar a 4 ° C fOu até um ano.
2. Esterilização de chips MEA (Figura 1A)
NOTA: Várias configurações diferentes dos MEAs estão disponíveis, com formatos de um ou vários poços. O protocolo aqui descrito utiliza o MEA de câmara única contendo 60 eléctrodos de registo numa disposição de rede de 8 x 8 (ver Tabela de Materiais ). O diâmetro do eléctrodo é de 30 μm ea distância entre os eléctrodos é de 200 μm. Um eletrodo de referência também está presente.
- Enxágüe bem o chip com água desionizada.
- Coloque os chips MEA dentro de uma placa de Petri de vidro que pode ser autoclavado. Enrole o prato em papel alumínio.
- Esterilizar os chips em uma panela de pressão de laboratório por 6 min. Deixe a louça arrefecer antes de abrir.
NOTA: Alternativamente, os chips podem ser esterilizados por imersão em 1 mL de etanol a 80% (v / v) à TA durante 15-30 min. - Coloque as batatas fritas em um capô de cultura celular e exponhaSuperfície para a luz UV durante aproximadamente 30 min.
3. Revestimento de chips MEA (Figura 1B e 1C)
- Coloque as aparas limpas dentro de uma placa de Petri estéril padrão de 10 cm de diâmetro.
- Adicionar 8 mL de água destilada estéril para a placa de Petri para formar uma câmara umidificada, que irá evitar o pequeno volume de meio de cultura sobre o chip para secar quando colocado na incubadora.
- Use anel de politetrafluoroetileno (PTFE) feito sob encomenda ( Figura 1B ) para assegurar o chapeamento dos cardiomiócitos no centro do chip, onde a matriz de eletrodos está localizada. (Os anéis de PTFE são previamente armazenados em etanol a 80%.) No capuz de cultura, retire os anéis do etanol, coloque-os em uma placa de Petri estéril sem uma tampa e deixe secar os anéis no capô.
- Coloque um anel seco dentro de um chip MEA usando pinça esterilizada com chama ( Figura 1C ).
NOTA: Alternativamente, use etanol a 80% para lavar as pinças e deixar secar iN a capa de cultura de tecidos antes de usá-los. - Descongelar uma alíquota de concentrado de fibronectina recombinante humana (200 μg / mL em água destilada) e diluir em PBS com Ca2 + e Mg2 + para obter uma solução de trabalho de 40 μg / mL. Revestir os eletrodos adicionando 50 μL de fibronectina 40 μg / mL dentro do anel.
NOTA: O revestimento utilizando fibronectina recombinante humana assegura a ligação óptima da hPSC-CM. No entanto, podem ser utilizados outros tipos de proteínas de revestimento tais como fibronectina bovina ou misturas de proteínas de matriz extracelular. - Feche a tampa da placa de Petri de plástico de 10 cm de diâmetro e transfira cuidadosamente o prato que contém o chip MEA para a incubadora. Incubar a 37 ° C durante pelo menos 1 h, ou a 4 ° CO / N.
- Transferir o prato que contém o chip MEA para o capô de cultura de células. Antes de utilizar o chip MEA, aspirar os 50 μL de fibronectina utilizando uma pipeta P200 ou um sistema de vácuo no exaustor, sem deslocar o anel PTFE. Use plaDicas para esta etapa. Certifique-se de que nenhum objeto sólido ( por exemplo, pontas de pipeta) toque no interior do prato, pois isso pode danificar os eletrodos.
NOTA: Isto prolongará a vida útil dos chips MEA. - Adicione suavemente 950 μL de meio LI-BPEL (ver Tabela 1 e Tabela de Materiais ), assegurando que esteja uniformemente distribuído e que o anel não flutue. Devolva o prato à incubadora.
4. Dissociação e Revestimento de hPSC-CMs (Figura 2)
NOTA: O protocolo aqui descrito faz uso de hPSC-CMs que foram diferenciados numa cultura monocamada utilizando citoquinas 34 aos ~ 18 dias após o início da diferenciação. No entanto, provou-se ser adequado para qualquer cultura 2D e 3D hPSC-CM. Quando se utilizam culturas diferenciadas em pontos de tempo mais cedo ou mais tarde, o ajuste do tempo de incubação da enzima de dissociação (ver Tabela de Materiais ) pode ser neCessário. Os volumes seguintes referem-se a um único poço de formato de placa de 12 poços (3,8 cm2).
- Aspirar o meio da cultura hPSC-CM bem.
- Enquanto se trabalha sob uma capa de cultura de tecido, adicionar 1-2 mL / poço de PBS sem Ca2 + / Mg2 + para lavar a cultura. Aspirar o PBS.
- Adicionar 500 μL / poço da enzima de dissociação. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
- Adicionar 1 mL de LI-BPEL / poço para diluir a enzima. Deslize suavemente a monocamada de hPSC-CMs arranhando suavemente usando uma pipeta P1000. Recolher a suspensão celular em um tubo de 15 mL.
- Enxágüe o poço com 1 mL de LI-BPEL para coletar todas as células remanescentes e aglomerados celulares.
- Adicionar mais 2-3 mL de LI-BPEL para atingir um volume final de 5-6 mL e pipetar suavemente para cima e para baixo 3-5x com uma pipeta de 5 mL para dissociar aglomerados de células.
NOTA: A dissociação em células isoladas neste momento não é necessária, uma vez que irá afectar a sobrevivência das células. A presença de pequenos clustersGarantir maior viabilidade celular. - Centrifugar as células à RT durante 3 min a 300 x g.
- Remover o sobrenadante, tentando remover a maior parte do líquido excedente, mas sem desalojar o sedimento celular.
- Ressuspender o sedimento celular em 250 μL de LI-BPEL (utilizando um P1000 e pipetagem extremamente suavemente).
- Distribuir ~ 50 μL de suspensão celular por MEA (até 5 MEAs podem ser preparados a partir de um poço de uma placa de 12 poços) pipetando a suspensão de células diretamente no centro do anel de PTFE, em cima da matriz de eléctrodos.
NOTA: Nesta fase as células são difíceis de contar devido à presença de grupos de células e o número total de células por MEA pode variar substancialmente, dependendo da fonte de hPSC-CM utilizada. Durante o chapeamento, certifique-se de que a nuvem de células dissociadas cobre a área dos eletrodos. - Cuidadosamente transferir os MEAs para a incubadora a 37 ° C e permitir que as células para anexar O / N
5. Remoção do anel e Re médio(Figura 3)
- Após 1 dia após a plaqueta, retire cuidadosamente o anel num ambiente estéril utilizando uma pinça estéril ( Figura 3A-3B ).
- Enxaguar o anel em etanol a 80% (v / v) e armazená-lo num tubo de 50 mL contendo 80% (v / v) de etanol fresco.
- Remova suavemente 500 μL de meio do chip MEA e adicione 500 μl de LI-BPEL fresco.
- Transferir os MEA para a incubadora a 37 ° C.
NOTA: As células devem começar a bater 1-7 dias após a remoção do anel e a alteração do meio ( Figura 3C ). - Medir a atividade elétrica de hPSC-CM em MEAs 1-7 dias após a remoção do anel.
6. Verifique a qualidade do sinal (Figura 4)
- Ligue o computador e inicie o conjunto de software ligado ao MEA configurado: TCX-Control, MC_MEA Select e MC_Rack. Ajuste a temperatura para 37 ° C no TCX-Control para registrar as medições à temperatura fisiológica.
- Remova o prato contendo o chip MEA fDa incubadora. Abra a tampa, retire o chip MEA, e coloque-o em um tecido para absorver a água residual.
- Limpe cuidadosamente os contatos externos da placa com um lenço de papel e limpe-os usando um cotonete umedecido com etanol a 100% (v / v) para remover qualquer resíduo de água ou detritos, o que pode causar ruído de sinal.
- Transfira a placa MEA para a fase de gravação aquecida (37 ° C) para detectar a atividade espontânea ( por exemplo, hardware: consulte a Tabela de Materiais , software: MC_Rack).
- Abra MC_Rack: Clique em 'Editar' → 'Adicionar MC_Card' para criar um novo protocolo. Use o menu suspenso 'Editar' para adicionar diferentes janelas de Gravador e Exibição ao protocolo.
NOTA: Recomenda-se uma frequência de amostragem de pelo menos 10 kHz. O protocolo que usamos contém uma ferramenta de exibição de longo prazo, com um layout completo de todo o chip MEA, e um Classificador de Spike, essencial para capturar o efeito de drogas iN tempo real. O Spike Cutout é sintonizado com um 'Pre Trigger' de 20 ms, um 'Post Trigger' de 800 ms e um 'Dead Time' de 2 ms. O protocolo pode ser salvo como arquivo '.rck' e recarregado antes de iniciar as experiências.
- Abra MC_Rack: Clique em 'Editar' → 'Adicionar MC_Card' para criar um novo protocolo. Use o menu suspenso 'Editar' para adicionar diferentes janelas de Gravador e Exibição ao protocolo.
- Inicie o protocolo no modo de reprodução clicando no botão 'reproduzir'.
NOTA: Neste ponto, é possível recarregar o protocolo guardado no passo 6.5. Em MC_Rack, carregue o protocolo (extensão .rck) clicando em 'Arquivo' → 'Abrir'. - Se os sinais exibirem picos R claramente visíveis e picos T, aguarde 10-15 min para concluir a fase de adaptação. Exemplos de traços de qualidade boa e ruim são mostrados na Figura 4 .
NOTA: Se nenhum pico T puder ser detectado em qualquer dos eletrodos, não prosseguir com a experiência. Normalmente, este é o resultado de uma fraca actividade eléctrica dos hPSC-CMs ou de uma ligação fraca das células aos eléctrodos.
7. Iniciar ExE Gravação
- Clique em 'gravar' e depois em 'reproduzir', e adquira dados durante 10 min sob condições de linha de base para determinar o estado estacionário. Anotar os eletrodos que têm o melhor sinal para que possam ser facilmente identificados e exportados posteriormente para a análise.
- Para a avaliação da resposta ao fármaco, adicionar concentrações crescentes de fármaco a cada 10 min. Como exemplo, adicione o bloqueador hERG E4031 a uma concentração final de 1 μM. Para isso, remover 100 μL de meio e adicionar o mesmo volume de 10 μM de E4031 dissolvido no meio.
NOTA: Tal como demonstrado anteriormente por Cavero e colaboradores [ 31] , uma escolha acertada do volume no qual os fármacos são dissolvidos é importante, uma vez que pode alterar profundamente a curva de resposta ao fármaco. - Repita o passo 7.2 para todas as outras concentrações de droga de interesse.
- Clique em 'parar' para concluir as gravações no final do protocolo.
8.MEA Limpeza para Reutilização
- Uma vez terminada a gravação da experiência, remova suavemente o meio com uma pipeta P1000. Não toque no interior do prato, pois isso pode danificar os eletrodos. Descarte de acordo com as regras locais de segurança.
- Enxaguar os chips de MEA com água desionizada usando um frasco de lavagem e repetir o passo de lavagem 3-4x.
NOTA: Neste ponto não é necessário que as células são completamente separadas do chip. - Adicionar 1 mL de solução de detergente enzimático 1% (v / v) em cada poço e incubar O / N a 4 ° C para permitir o desprendimento celular e remoção de células.
- Um dia mais tarde, enxágüe os chips MEA cuidadosamente com água desionizada para remover a solução de detergente enzimático e as células residuais e adicione 1 mL de água desionizada. Os chips MEA limpos podem ser armazenados imersos em água desionizada a 4 ° C.
9. Exportação de dados
- Abra o software MC_Data Tool vinculado ao MEA configurado.
- Clique em 'Arquivo' → 'Abrir MCD '.
- Clique em 'Ferramentas' → 'Converter MCD para ABF' .
- Selecione os eletrodos com os melhores sinais de gravação a serem exportados para a análise. Escolha o diretório no qual deseja salvar os arquivos exportados e clique em "Salvar". O procedimento de exportação pode levar vários minutos dependendo do número de eletrodos exportados e do tamanho total dos arquivos de gravação.
10. Análise de Dados
- Faça o download e instale um programa de aquisição e análise de dados eletrofisiológicos ( por exemplo, pClamp). Uma vez concluído, inicie o software de análise ( por exemplo, Clampfit).
- RR (Figura 5).
- Coloque dois cursores verticais para definir a região de interesse no rastreamento. Selecione 'Detecção de eventos' → 'Pesquisa de limiar'. O cursor horizontal deve atravessar todos os eventos que devem ser quantificados, como mostrado na Figura 5A .
- Clique em &# 39; OK 'e, em seguida,' Aceitar a categoria inteira '. O software irá então pesquisar através do rastreio para todos os eventos adequados. Marcas azuis serão colocadas acima dos eventos.
- Ajuste a sensibilidade da seleção automática ajustando os parâmetros na janela de detecção de eventos principais.
- Uma vez que todos os eventos foram automaticamente identificados, vá para a janela de resultados (Janela → Resultados) e copie a coluna intitulada "Intervalo de Intervalo", que contém os dados de freqüência ( Figura 5B ).
- QT Interval calcul (Figuras 6-9):
- Coloque um cursor à direita antes e um depois de um único FP na condição de estado estacionário. Selecione 'Detecção de Eventos' → 'Criar Modelo' ( Figura 6 ) .
- Verifique se o FP está corretamente identificado e clique em 'Adicionar'. O modelo será movido para o painel inferior.
- Salve o modelo como um '.atf'Arquivo. Desta forma, foi criado um rastreio de modelo que será pesquisado pelo software durante toda a gravação ( Figura 7 ). Criar um modelo para cada condição, uma vez que um efeito de drogas pode alterar a forma do FP. Se necessário, filtre o traço ligeiramente para incluir um máximo de 10.000 pontos dentro dos dois cursores.
- Uma vez que o modelo tenha sido salvo com a extensão '.atf', selecione 'Detecção de Eventos' → 'Pesquisa de Modelos' e carregue o modelo.
- Ajuste o "Limite de correspondência de modelo" para identificar corretamente todos os FP no intervalo selecionado.
- Uma vez que todos os eventos foram identificados corretamente, salvá-los em um novo arquivo '.abf'.
- Abra o arquivo com o software de análise e calcule automaticamente o 'Time of Peak' para os picos Q / R e T ( Figuras 8, 9 ). Se os traços forem muito ruidosos, aplique um filtro. Calcule o intervalo QT subtraindo oValor Q / R do valor T em um editor de planilha eletrônica de escolha.
Representative Results
Um dia após a dissociação e revestimento, a camada de hPSC-CMs será visível como um filme denso e branco cobrindo o centro da câmara MEA ( Figura 3A ). Após remoção do anel ( Figura 3B ), A camada deve permanecer no lugar e a inspeção em um microscópio de luz mostrará os eletrodos de MEA cobertos pela camada (de contração) hPSC-CM ( Figura 3C ). Devido ao acoplamento físico e elétrico das células, apenas um eletrodo (eletrodo de ouro) será usado para análise.
Alternativamente, quando se trabalha com estruturas 3D, tais como corpos embrioides ou microtissues, estes podem ser plaqueados de modo a serem fisicamente e eletricamente desacoplados. A inspeção visual ao microscópio poderia confirmar que nenhuma conexão física entre os aglomerados e as ondas R não sincronizadas em MEAs não confirma nenhum acoplamento elétrico. Neste cPodem ser analisados múltiplos eletrodos independentes.
As gravações típicas de traços FP são mostradas na Figura 4 . Em particular, um traço de boa qualidade pode ser definido pela presença de um pico claro correspondente ao influxo de Na + e despolarização da membrana (pico R / Q), uma fase de repolarização clara correspondente ao efluxo de K + (pico T) Relação sinal / ruído ( Figura 4A , à esquerda: nota a escala do eixo y e Figura 4B ). Traços de má qualidade ( Figura 4A , meio) podem ser o resultado da falha de hPSC-CMs para se ligar à placa MEA ou de fraca actividade eléctrica de hPSC-CM. Esperar 1-3 dias para melhor acessório pode melhorar o sinal; No entanto, se nenhuma melhoria de sinal é visível, é recomendável excluir este MEA das experiências. Rastreios ruidosos ( Figura 4A , direita) podem ser analisados após filtragem.
Figura 5A, 5B ). Dentro do intervalo de tempo definido pelos cursores verticais, devem estar presentes marcas azuis correspondentes a cada pico. Caso o programa não identifique um ou mais picos, tente mover o cursor horizontal e executar a análise novamente ou ajustar as configurações de detecção. De forma semelhante, a análise bem sucedida do intervalo QT pode ser identificada por inspecção visual do ecrã que mostra a detecção FP ( Figura 7 ). Dentro do intervalo de tempo definido pelos cursores verticais, as marcas azuis correspondentes a cada detecção FP devem estar presentes. Caso o programa não identifique um ou mais FPs, tente redefinir o modelo FP ( Figura 6 ) ou ajuste as configurações de detecção e execute a análise novamente.
Traços de FP individuais extraídos ou sua média ( FigurE 8) pode ser usado para obter valores de intervalos QT com configurações específicas como na Figura 9 . A análise da relação QT-RR é aconselhável e é significativa nas linhas de hPSC doente e WT ( Figura 10A ) e para avaliar a necessidade e / ou o efeito das correções do intervalo QT ( Figura 10B-10D ). Os hPSC-CMs portadores de mutações causadoras de LQTS têm intervalos QT prolongados em comparação com os controlos WT ( Figura 11A ). O tratamento de hPSC-CMs com um bloqueador de hERG resulta num prolongamento do intervalo QT ( Figura 11B ); Inversamente, o tratamento com um activador de hERG resulta no encurtamento do intervalo QT ( Figura 11C ). Finalmente, o tratamento com fármacos que afectam a frequência de batimento dos hPSC-CMs deve ser visível como uma alteração no intervalo RR ( Figura 11D , encurtamento do intervalo RR).
-benzóico.
Figura 1: Esterilização e revestimento de chips MEA. ( A ) Esquema que representa o processo de esterilização incluindo a colocação do chip MEA numa placa de Petri de vidro autoclavável, envolvendo em folha de alumínio, vaporizando durante 6 min e expondo a UV durante 30 min. ( B ) Vista superior (painel esquerdo) e lateral (painel médio) do anel de PTFE personalizado; O anel tem um diâmetro exterior de 1,2 cm, incluindo 4 abas que permitem o seu posicionamento no centro do chip MEA eo diâmetro interno é de 0,4 cm (painel direito). ( C ) Esquema que representa a preparação do chip MEA incluindo colocar o chip numa placa de Petri de plástico padrão, adicionar 8 mL de água desionizada fora da câmara de MEA, colocar o anel de PTFE no meio da câmara e revestir o conjunto de eléctrodos com fibronectina . Após o tempo de incubação, a fibronectina é removida e substituída por meio de cultura.T = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dissociação e Plating de hPSC-CMs. Esquema que representa os processos de dissociação enzimática hPSC-CMs, centrifugação, ressuspensão e plaqueamento no centro da câmara MEA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Microplaquetas MEA com camada hPSC-CM. ( A ) Vista de cima do chip MEA contendo o anel e a camada de hPSC-CMs. ( B ) vista lateral do chip MEA após a remoção do anel. ( C ) Imagem de campo brilhante da camada de hPSC-CMs chapeada no micro-Matriz de eléctrodos; Ampliação 4X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Gravação MEA de hPSC-CMs. ( A ) Traços representativos registados com o MEA mostrando um traço de boa qualidade com os picos R / Q e T claramente visíveis com elevada relação sinal / ruído (à esquerda), um traço de má qualidade sem picos claramente visíveis de R / Q e T (meio) E um rastro ruidoso com picos R / Q e T claramente visíveis mas com baixa relação sinal / ruído (direita). ( B ) Exemplos representativos de rastros de FP de boa qualidade com diferentes morfologias que podem ser registadas durante experiências de MEA utilizando hPSC-CMs. A área sombreada representa o intervalo QT medido durante a análise. Uma vez que o FP no MEA se assemelha aoE do potencial de ação 28 , calculamos a integral do traçado FP, mostrado como linha tracejada a vermelho, como demonstração teórica de uma escolha de onda T próxima a uma repolarização de potencial de ação completa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cálculo do Intervalo RR. ( A ) Exemplo de análise de intervalo RR com detecção automática de pico (topo) e extração de dados (parte inferior) usando o software de análise (ver Tabela de Materiais). Os cursores verticais identificam o intervalo de tempo de interesse eo cursor horizontal está atravessando todos os eventos que são detectados e identificados por marcas azuis. ( B ) A coluna ampliada mostra os dados extraídos usados para calcular o intervalo RR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Criação de Modelo FP. Exemplo de seleção de modelo usando cursores verticais colocados antes e depois de um único FP. Este modelo é utilizado para identificação automática FP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Identificação automática do modelo FP. Exemplo de pesquisa de modelo ao longo de um intervalo definido por dois cursores verticais. Todos os eventos detectados são identificados por marcas azuis e sãoY sobreposta na inserção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Quantificação de Parâmetros FP. Análise dos eventos salvos, com o pico R identificado manualmente nos dois primeiros cursores eo pico T identificado manualmente nos dois últimos cursores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Janela de Análise. Parâmetros utilizados na janela Estatísticas para detectar R pico. Para a detecção do pico T, altere os cursores e (se necessário) poLaridade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Relação QT-RR. ( A ) Exemplo de diferentes relações entre os intervalos QT e RR entre WT (LQT1 corr ) e Long QT síndrome tipo 1 (LQT1 R190Q ) hPSC-CMs. As áreas sombreadas mostram que a mesma mudança no intervalo RR gera uma mudança maior no intervalo QT da linha doente LQT1, o que provavelmente aumenta a susceptibilidade à arritmia. ( B ) Relação entre intervalos QT e RR não corrigidos medidos em MEA em CMs de 7 linhas hPSC diferentes. O efeito da correção QT para fórmulas de Bazett ( C ) ou Fridericia ( D ) é mostrado e visível como mudança na inclinação do QT-RR em Terval. Figuras adaptadas da referência 30 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Variações do Intervalo QT e RR do Medicamento. ( A ) Exemplo de prolongamento do intervalo QT em hPSC-CM derivado de um doente portador de uma mutação de Síndrome de QT Longo (LQTS) em comparação com o seu controlo de WT isogénico. ( B ) Exemplo de prolongamento do intervalo QT em hPSC-CM após bloqueio farmacológico de hERG. ( C ) Acréscimo do intervalo QT após tratamento com doses crescentes de activador de hERG. Seta indica a direção do encurtamento. ( D ) Exemplo de encurtamento do intervalo RR induzido por fármacos. O Painel (C) foi adaptado da referência> 30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Baixa insulina, BSA, álcool polivinílico, lípidos essenciais (LI-BPEL) Meio | |||
| Componente | Quantidade para 100 mL | ||
| IMDM | 43 mL | ||
| F12 | 43 mL | ||
| Ácido Ascórbico 2-fosfato (5 mg / mL em água destilada) | 1 mL | ||
| Suplemento de cultura celular (substituto direto da L-glutamina) | 1 mL | ||
| Penicilina / Estreptomicina | 0,5ML | ||
| Vermelho de fenol | 1 mg | ||
| Hibridoma de Prote�a Livre Meio II (PFHMII) | 5 mL | ||
| BSA (10% p / v em IMDM) | 2,5 mL | ||
| PVA (5% p / v em água destilada) | 2,5 mL | ||
| Concentrado lipídico quimicamente definido (CDLC) | 1 mL | ||
| Insulina-Transferrina-Selenio-Etanolamina (ITS-X) 100X | 0,1 mL | ||
| Α-Monotioglicerol (13 μL em 1 mL de IMDM) | 0,3 mL | ||
| Combinar os reagentes, filtrar com um filtro de poros de 0,22 μm e armazenar o meio a 4 ° C por até 2 semanas. | |||
Tabela 1: Composição média de Li-BPEL.
Discussion
Este protocolo mostra como dissociar e preparar hPSC-CMs para medir o seu FP usando MEAs. Os hPSC-CM normalmente exibem atividade elétrica espontânea, que pode ser medida como FP e pode fornecer dados significativos com respeito à freqüência de batimento, duração do intervalo QT e eventos arrítmicos.
A dissociação de culturas diferenciadas cardíacas 2D é necessária para recriar uma camada de batimento no MEA e representa um passo crítico. O stress mecânico por pipetagem repetida e / ou tratamentos agressivos de enzima de dissociação pode resultar em elevada mortalidade celular, falha na ligação à placa MEA e falta de actividade eléctrica espontânea. Este protocolo foi optimizado para culturas em monocamada. No entanto, uma abordagem semelhante pode ser usada para culturas tridimensionais ( por exemplo, corpos embrionários ou EBs) com pequenas modificações, tais como a coleta dos EBs seguida de lavagem com PBS e maior tempo de incubação com a enzima dissociativa. ImportarEm ambas as culturas diferenciadas 2D e 3D, quanto mais velhas forem as células diferenciadas, maior será o tempo de incubação necessário para separar as células devido ao aumento da deposição da matriz extracelular.
O protocolo aqui descrito para a quantificação de parâmetros de FP pode ser utilizado para gerar curvas dose-resposta para fármacos cardioactivos. Tal como descrito recentemente por Cavero et al. 31 , a concentração inicial de uma droga pode afetar profundamente o resultado de uma medição de MEA. Portanto, para melhorar a precisão ea confiabilidade dos resultados, sugerimos o seguinte: 1) no caso de ativadores / bloqueadores irreversíveis, use volumes relativamente grandes de meio contendo o fármaco a ser testado. Mais em pormenor, remova 10-50% do volume médio do chip MEA e adicione um volume igual de meio em que o fármaco foi previamente dissolvido na concentração apropriada. Neste caso, para o cálculo da concentração final de fármaco, éA alteração na concentração após remoção do meio. 2) No caso de activadores / bloqueadores reversíveis, adicionar 10 μL de cada dose de fármaco a partir de uma solução stock 100X.
A maioria dos protocolos de diferenciação cardíaca resulta em uma população variável mista de cardiomiócitos de tipo nodal, tipo auricular e ventricular, sendo o tipo ventricular o mais representado. Isto pode constituir uma limitação ao modelar doenças cardíacas que afectam um subtipo específico de cardiomiócitos ou fármacos que actuam sobre canais iónicos específicos de subtipos cardíacos. Embora vários estudos tenham condições otimizadas para direcionar uma especificação mais controlada durante a diferenciação cardíaca 3 , 5 , 37 , 38 , sua aplicabilidade mais ampla ainda está sendo investigada.
Além disso, a eficiência variável de diferenciação (em diferentes experiências eFferent hPSC linhas) pode ser observado 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . As estratégias de enriquecimento de cardiomiócitos baseadas na expressão da proteína de superfície 35 , 45 (por triagem de células assistidas por florescência ou por seleção de grânulos magnéticos 46,47) e seleção metabólica 44,48 podem representar estratégias válidas que podem ser aplicadas a qualquer Não modificado) hPSC-linha pré-chapeamento dos hPSC-CMs, para melhorar o sinal elétrico.
Embora os hPSC-CMs sejam notoriamente imaturos quando comparados com os cardiomiócitos adultos humanos 4 , 49 , eles provaram ser valiosos em rEcapitulando e identificando alterações específicas relacionadas à doença ( por exemplo , em canalopatias) 19 , 20 , 50 e respostas induzidas por fármacos ( por exemplo, bloqueadores dos canais iónicos cardíacos) 4 , 51 . Além disso, as células imaturas são mais fáceis de dissociar e recuperar melhor do que os cardiomiócitos adultos após a dissociação e revestimento 44 , portanto, imaturidade hPSC-CM pode ser recompensado como uma vantagem a este respeito. No entanto, para ser capaz de recapitular, por exemplo . Tardia e reproduzir fielmente respostas de fármacos de cardiomiócitos adultos, deve-se obter um estado hPSC-CM mecânico, metabólico e elétrico mais maduro. Os métodos para maturar estas células incluem tempo prolongado na cultura 52 , estirpe mecânica 53 , estimulação eléctrica 54 , adição de pequenasMoléculas 55 , cultura 3D 56 , co-cultura com outros tipos de células 57 , e mesmo uma combinação destas abordagens 58 ; Até à data, nenhuma destas abordagens levou a um adulto-como fenótipo.
Como parte das características de imaturidade, os hPSC-CMs mostram automatismo elétrico. Aqui, são fornecidos detalhes sobre como quantificar com precisão intervalos QT e RR. Uma limitação da medição da actividade eléctrica espontânea é que a comparação dos intervalos QT pode ser difícil quando os hPSC-CM exibem frequências de batimento diferentes. Neste caso, as fórmulas de Bazett ou Fridericia podem ser usadas para corrigir o intervalo QT para a freqüência. No entanto, conforme relatado anteriormente 30 , recomendamos fortemente a realização de análise de regressão do Eixo Principal, traçando intervalo QT versus intervalo RR para dados brutos e corrigidos, para excluir qualquer possível viés devido ao próprio método de correção.
O protocolo aqui apresentado, juntamente com os métodos 59 , 60 descritos anteriormente , auxilia na padronização dos procedimentos e na análise dos FPs hPSC-CM, melhorando a reprodutibilidade dos dados e permitindo uma melhor comparação dos resultados entre laboratórios.
Disclosures
A CLM é co-fundadora e conselheira da Pluriomics bv. Parte dos custos de publicação foi coberta por Sistemas de Múltiplos Canais.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções: CVON (HUSTCARE): a Holanda CardioVascular Research Initiative (Fundação Holandesa do Coração, Federação Holandesa de Centros Médicos Universitários, a Organização Holandesa de Pesquisa em Saúde e Desenvolvimento e da Real Academia Holandesa de Ciências); Conselho Europeu de Investigação (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). Agradecemos a E. Giacomelli (LUMC) pela ajuda na diferenciação cardíaca hPSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| MEA2100 in vitro recording system | Multi Channel Systems | ||
| CO2 cell-culture incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Leica stereomicroscope | Leica Microsystems | MS5 | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 μL), P-200 (200 μL), P-1000 (1,000 μL)) | Gilson International | ||
| Filter tips (10 μL, 200μL, 1,000μL) | Corning | 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL) | |
| Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) | Millipore | SCGVU02RE | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL) | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Autoclavable Petri dishes | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| MEA chip | Multi Channel Systems | MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040-091 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-169 | |
| Human recombinant fibronectin | Tebu-Bio | J64560 | |
| Custom-made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings | LUMC: department of Instrument Development | ||
| Dissociation enzyme - TrypLE Select 1x | Thermo Fisher Scientific | 12563-029 | |
| Tergazyme enzyme detergent | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230-089 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for LI-BPEL medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 21056-023 | |
| F12 nutrient mixture (Ham) | Thermo Fisher Scientific | 31765-027 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Protein-free Hybridoma Medium-II (PFHMII) | Thermo Fisher Scientific | 12040-077 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bovogen Biologicals Australia | BSAS05 | |
| Poly(Vinyl Alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Chemically-defined Lipid Concentrate (CDLC) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100x | Thermo Fisher Scientific | 51599-056 | |
| α-Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| MC_Rack | Multi Channel Systems | 4.6.2 | Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems) |
| TCX Control | Multi Channel Systems | 1.3.4 | |
| MEA Select | Multi Channel Systems | 1.3.0 | |
| MC_Data Tool | Multi Channel Systems | 2.6.15 | Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.) |
| Clampfit | Molecular Devices | 7.0.0 | Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code. |
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