Summary
Elektrofysiologisk karakterisering av kardiomyocytter avledet fra humane pluripotente stamceller (hPSC-CM) er avgjørende for hjertesykdomsmodellering og for å bestemme legemiddelresponser. Denne protokollen gir den nødvendige informasjonen for å dissociere og plater hPSC-CM på multi-elektrode arrays, måle deres feltpotensial og en metode for å analysere QT og RR intervaller.
Abstract
Kardiomyocytter kan nå utledes med høy effektivitet fra både humane embryonale og humane induserte pluripotente stamceller (hPSC). HPSC-avledede kardiomyocytter (hPSC-CMs) blir stadig mer anerkjent som har stor verdi for modellering av kardiovaskulære sykdommer hos mennesker, spesielt arytmi-syndromer. De har også vist relevans som in vitro- systemer for å forutsi medisinrespons, noe som gjør dem potensielt nyttige for narkotika-screening og funn, sikkerhetsfarmakologi og kanskje til slutt for personlig medisin. Dette ville bli lettere ved å utlede hPSC-CM fra pasienter eller følsomme individer som hiPSCs. For alle anvendelser er imidlertid nøyaktig måling og analyse av hPSC-CM elektriske egenskaper avgjørende for å identifisere endringer på grunn av hjertejonskanalmutasjoner og / eller legemidler som målretter ionkanaler og kan forårsake plutselig hjertedød. Sammenlignet med manuell patch-klemme, gir multi-elektrode array (MEA) enheter fordelene vedTillater opptak av medium til høy ytelse. Denne protokollen beskriver hvordan man dissocierer 2D-cellekulturer av hPSC-CM til små aggregater og enkeltceller og plater dem på MEA for å registrere sin spontane elektriske aktivitet som feltpotensial. Metoder for å analysere de registrerte dataene for å trekke ut spesifikke parametere, så som QT og RR intervaller, er også beskrevet her. Endringer i disse parametrene kan forventes i hPSC-CM som bærer mutasjoner som er ansvarlige for hjertearytmier og etter tilsetning av bestemte stoffer, slik at det kan påvises de som har en kardiotoksisk risiko.
Introduction
Human Pluripotent Stamceller (hPSCs) har kapasitet til selvfornyelse og genererer nesten hvilken som helst celletype av menneskekroppen gjennom differensiering 1 , 2 . Detaljert protokoller om hvordan å dirigere differensiering av hPSCs i flere hjertestammer (ventrikulære, atriale, pacemakerlignende kardiomyocytter) er beskrevet 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Kardiomyocytter er elektriskt aktive celler og detaljert kunnskap om deres elektrofysiologiske aktivitet kan være ekstremt informativ for å forstå hjerteutvikling og sykdom 8 . Pasientspesifikke hiPSC-avledede kardiomyocytter (hiPSC-CMer) har blitt brukt til å modellere og studere de cellulære, molekylære og elektriske egenskapene til flere hjertearytmier, inkludert Long QT Syndrome(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , Brugada syndrom 14 og katekolaminerge polymorfe ventrikulære takykardier 15 , 16 . Videre har flere legemidler blitt tilsatt syke hiPSC-CMer for å rekapitulere terapeutisk inngrep og å redde de cellulære patologiske fenotypene 10 , 15 , 20 , 21 , 22 . Mer nylig har screeningsplattformer basert på WT hiPSC-CM blitt utviklet som respons på behovet for menneskelige systemer til de tidlige faser av legemiddelforskning 23 , 24 , 25 da gnagekardiomyocytter varierer dypt fra huMans i ionkanaluttrykk og biofysikk 26 .
Til dette formål blir teknologier som er egnet for medium til høy gjennomstrømning, utviklet og implementert. Disse inkluderer optiske opptak av membranpotensial, Ca 2+ transienter og belastning, impedansmålinger (som et indirekte mål på cellekontraktilitet) og ekstracellulære feltpotensial (FP) målinger (for gjennomgang se referanse 24 ). Multi-elektrode Arrays (MEA) enheter tillater registrering av de elektriske bølgeformsignalene (eller FPs) generert og formet av monolag eller små klynger av kardiomyocytter. FP-konturen korrelerer med hjertevirkningspotensialet og, til en viss grad, med elektrokardiogramopptakene (EKG) 27 ; De viser vanligvis en innledende rask oppstramming som tilsvarer Na + tilstrømning og membran depolarisering (R / Q peak), en langsom bølge / platåfase som sannsynligvis svarer til Ca2 + tilstrømning, og en repolarisasjonsfase som tilsvarer en overveiende K + effluks (T-topp). Perturbation av FP bølgeformen kan korreleres med endringer i spesifikke handlingspotensiale faser 28 .
Selv om patch clamp-opptak av handlingspotensialer kan være mer informativ, spesielt for parametere som oppstrekningshastighet og hvilemembranpotensial, er manuelle målinger ikke mulige for eksperimenter ved middels og høy gjennomstrømningsskala, mens automatisert patch clamp bare nylig er blitt brukt på hPSC -CM 29 . Siden langvarig opptak på MEA tillater både akutt og kronisk eksponering for forbindelser som skal undersøkes, er det nå mulig å bruke hPSC-CM-plattformer for narkotika-screening, funn 24 , 30 og for sikkerhetsfarmakologi 31 , 32 . Dette holder løftet om fremtidig presisjon eller persoNalisert medisin 33 .
Formålet med denne protokollen er å gi den nødvendige informasjonen for dissociating og plating hPSC-CMs på MEA-sjetonger og måling av deres FP. I denne prosedyren har hvert trinn blitt optimalisert, slik at optimal celleoverlevelse og gjenoppretting etter dissosiasjon, optimal cellefesting til MEA-platen og standardisert analyse og kvantifisering av parametere. Spesielt forklares og eksemplifiseres prosedyren for ekstracellulær FP-registrering, analyse av QT- og RR-intervaller, og evaluering av medikamenteffekter.
Protocol
1. Fremstilling av løsninger og reagenser
- Forbered hPSC-CM kulturmedium ved å bruke lavinsulin, bovint serumalbumin, polyvinylalkohol, essensielt lipid (LI-BPEL) medium 34 , 35 , 36 ved å kombinere reagensene beskrevet i tabell 1 . Filtrer mediet gjennom et 0,22 μm porefilter og lagre ved 4 ° C i opptil 2 uker.
- Klargjør human rekombinant fibronektin stamløsning ved å rekonstituere 1 mg human rekombinant fibronektin i 5 ml sterilt destillert vann for å nå 200 μg / ml konsentrasjon, alikvot og lagre ved -80 ° C.
- Forbered 1% (w / v) enzymvaskemiddeloppløsning (se tabell over materialer ) for å bidra til fjerning av resterende celler fra microarray-brikken ved å oppløse 1 g enzymvaskemiddelpulver i 100 ml varm (~ 40-45 ° C) avionisert vann. La løsningen avkjøles og oppbevares ved 4 ° C fEller opptil ett år.
2. Sterilisering av MEA Chips (Figur 1A)
MERK: Flere forskjellige konfigurasjoner av MEA er tilgjengelige, med enkelt- eller multi-brønnformater. Protokollen beskrevet her bruker enkeltkammeret MEA som inneholder 60 innspillingselektroder i et 8 x 8-gridarrangement (se tabell over materialer ). Elektrodediameteren er 30 μm og avstanden mellom elektroder er 200 μm. En referanseelektrode er også tilstede.
- Skyll chippen grundig med avionisert vann.
- Sett MEA-sjetongene inne i et glass-petriskål som kan autoklaveres. Fest fatet i aluminiumsfolie.
- Steriliser sjetongene i en laboratoriekjøleskap i 6 minutter. La oppvasken avkjøle før åpningen.
MERK: Alternativt kan sjetongene steriliseres ved å senke dem i 1 ml 80% (v / v) etanol ved romtemperatur i 15-30 minutter. - Plasser sjetongene i en cellekulturdeksel og avslørOverflate til UV-lys i ca. 30 min.
3. Belegg av MEA Chips (Figur 1B og 1C)
- Plasser de rene sjetongene i en standard 10 cm Ø plast steril petriskål.
- Tilsett 8 ml sterilt destillert vann til petriskålen for å danne et fuktet kammer som forhindrer at det lille volumet av dyrkningsmedium på brikken tørker når det plasseres i inkubatoren.
- Bruk skreddersydde polytetrafluoretylen (PTFE) ringer ( Figur 1B ) for å sikre plettering av kardiomyocyttene i midten av brikken, der elektrodearrangementet er plassert. (PTFE-ringene lagres tidligere i 80% etanol.) I kultedekselet, fjern ringene fra etanolen, plasser dem i en steril petriskål uten lokket og la ringene tørke i hetten.
- Plasser en tørrring inne i en MEA-brikke ved hjelp av flamme-steriliserte pincett ( figur 1C ).
MERK: Alternativt bruk 80% etanol for å vaske pincetene og la det tørke iN vevskultur hetten før du bruker dem. - Tin en alikvot av humant rekombinant fibronektinlager (200 μg / ml i destillert vann) og fortynn i PBS med Ca 2+ og Mg 2+ for å oppnå en arbeidsoppløsning på 40 μg / ml. Beleg elektrodene ved å tilsette 50 μl 40 μg / ml fibronektin inne i ringen.
MERK: Coating ved hjelp av humant rekombinant fibronektin sikrer optimal hPSC-CM-vedlegg. Imidlertid kan andre typer beleggingsproteiner, slik som blandinger av bovin fibronektin eller ekstracellulær matriksprotein, anvendes. - Lukk lokket på 10 cm Ø plast-petriskålen og overfør forsiktig overfatet med MEA-brikken inn i inkubatoren. Inkuber ved 37 ° C i minst 1 time, eller ved 4 ° C / N.
- Overfør parabolen som inneholder MEA-brikken til cellekulturhetten. Før du bruker MEA-brikken, aspirere 50 μL fibronektin ved hjelp av en P200 pipette eller et vakuumsystem i hetten, uten å forskyve PTFE-ringen. Bruk plaTips for dette trinnet. Pass på at det ikke er faste gjenstander (f.eks. Pipettespisser) på innsiden av fatet, da dette kan skade elektrodene.
MERK: Dette vil forlenge levetiden til MEA-chips. - Tilsett forsiktig 950 μL LI-BPEL medium (se tabell 1 og tabell over materialer ), slik at det blir jevnt fordelt og at ringen ikke flyter. Returner parabolen til inkubatoren.
4. HPSC-CMs Dissociation and Plating (Figur 2)
MERK: Protokollen beskrevet her bruker hPSC-CM som ble differensiert i en monolagskultur ved bruk av cytokiner 34 ved ~ 18 dager etter at differensieringen startet. Det har imidlertid vist seg å være egnet for enhver 2D og 3D hPSC-CM-kultur. Ved bruk av differensierte kulturer ved tidligere eller senere tidspunkter, kan justering av inkubasjonstiden for dissosiasjonssymbolet (se tabell over materialer ) være necessary. Følgende volumer er ment for en enkelt brønn i et 12-brønn plateformat (3,8 cm 2 ).
- Aspirere mediet fra hPSC-CMs kulturbrønn.
- Mens du arbeider under en vevskulturkledning, tilsetter du 1-2 ml / brønn med PBS uten Ca 2+ / Mg 2+ for å vaske kulturen. Aspirere PBS.
- Tilsett 500 μl / brønn i dissociationsenzymet. Inkuber i 5 minutter ved 37 ° C.
- Tilsett 1 ml LI-BPEL / brønn for å fortynne enzymet. Fjern forsiktig monolaget av hPSC-CM ved forsiktig å rive ved hjelp av en P1000 pipette. Samle cellesuspensjonen i et 15 ml rør.
- Skyll brønnen med 1 ml LI-BPEL for å samle alle resterende celler og celleklemmer.
- Legg til en annen 2-3 ml LI-BPEL for å nå et sluttvolum på 5-6 ml og forsiktig pipette opp og ned 3-5 ganger med en 5 ml pipette for å dissociere celleklumper.
MERK: Dissociation i enkeltceller på dette punktet er ikke nødvendig, siden det vil påvirke celleoverlevelse. Tilstedeværelsen av små klynger vilSikre høyere celle levedyktighet. - Sentrifuger cellene ved RT i 3 minutter ved 300 x g.
- Fjern supernatanten, og prøv å fjerne det meste av overskuddsvæsken, men uten å løsne cellepellet.
- Resuspender cellepelletet i 250 μL LI-BPEL (bruk en P1000 og pipettering ekstremt forsiktig).
- Fordel ~ 50 μL cellesuspensjon per MEA (opptil 5 MEA kan fremstilles fra en brønn på en brønn med 12 brønner) ved å pipettere cellesuspensjonen direkte inn i midten av PTFE-ringen, på toppen av elektrodarrayet.
MERK: På dette stadiet er celler vanskelig å telle på grunn av tilstedeværelsen av celleklynger, og det totale antall celler per MEA kan vesentlig variere, avhengig av den anvendte hPSC-CM-kilde. Ved plating sørg for at skyen av dissocierte celler dekker elektrodens område. - Forsiktig overfør MEA til inkubatoren ved 37 ° C og la cellene feste O / N
5. Ring fjerning og middels reFersking (figur 3)
- Ved 1 dag etter plating, fjern ringen forsiktig i et sterilt miljø ved hjelp av sterile pincet ( figur 3A-3B ).
- Skyll ringen i 80% (volum / volum) etanol og oppbevar den i et 50 ml rør som inneholder fersk 80% (volum / volum) etanol.
- Fjern forsiktig 500 μL medium fra MEA-brikken og tilsett 500 μL frisk LI-BPEL.
- Overfør MEA til inkubatoren ved 37 ° C.
MERK: Cellene skal begynne å slå 1-7 dager etter ringfjerning og medium endring ( Figur 3C ). - Mål elektrisk aktivitet av hPSC-CM på MEA 1-7 dager etter ringfjerning.
6. Kontroller signalkvaliteten (figur 4)
- Slå på datamaskinen og start programvaren som er koblet til MEA-konfigurasjonen: TCX-Control, MC_MEA Select og MC_Rack. Still temperaturen til 37 ° C i TCX-Control for å registrere målinger ved fysiologisk temperatur.
- Fjern fatet som inneholder MEA-brikken fRom inkubatoren. Åpne lokket, ta ut MEA-brikken, og legg det på et vev for å absorbere gjenværende vann.
- Tørk forsiktig platenes utvendige kontakter med et vev og rengjør dem med en bomullspinne fuktet med 100% (volum / volum) etanol for å fjerne eventuelt vann eller rester som kan forårsake signalstøy.
- Overfør MEA-platen til oppvarmet (37 ° C) opptakshodetrinn for å oppdage spontan aktivitet ( f.eks . Maskinvare : se Materiell , programvare: MC_Rack).
- Åpne MC_Rack: Klikk 'Rediger' → 'Legg til MC_Card' for å opprette en ny protokoll. Bruk rullegardinmenyen 'Rediger' for å legge til forskjellige opptaker- og skjermvinduer i protokollen.
MERK: En prøvetakingsfrekvens på minst 10 kHz anbefales. Protokollen vi bruker inneholder et langsiktig skjermverktøy, med en full layout av hele MEA-brikken, og en Spike Sorter, som er viktig for å fange narkotikaeffekten jegN sanntid. Spike Cutout er innstilt med en 'Pre Trigger' på 20 ms, en 'Post Trigger' på 800 ms og en 'Dead Time' på 2 ms. Protokollen kan lagres som '.rck' -fil og lastes opp før du starter forsøkene.
- Åpne MC_Rack: Klikk 'Rediger' → 'Legg til MC_Card' for å opprette en ny protokoll. Bruk rullegardinmenyen 'Rediger' for å legge til forskjellige opptaker- og skjermvinduer i protokollen.
- Start protokollen i spillmodus ved å klikke på "spill" -knappen.
MERK: På dette punktet er det mulig å laste inn protokollen som er lagret under trinn 6.5. I MC_Rack legger du inn protokollen (.rck filtype) ved å klikke på "File" → "Open". - Hvis signalene viser klart synlige R-topp og T-tverr, vent 10-15 minutter for å avslutte tilpasningsfasen. Eksempler på gode og dårlige kvalitetsspor er vist i figur 4 .
MERK: Hvis ingen T-topp kan detekteres i noen av elektrodene, fortsett ikke med forsøket. Vanligvis er dette resultatet av dårlig elektrisk aktivitet av hPSC-CMene eller dårlig vedlegg av cellene til elektrodene.
7. Start EksPeriment og opptak
- Klikk på "Record" og deretter "play", og kjøp data i 10 minutter under baseline betingelser for å bestemme stabil tilstand. Merk elektrodene som har det beste signalet, slik at de lett kan identifiseres og eksporteres senere for analysen.
- For vurdering av narkotika-respons, legg til økende konsentrasjoner av stoffet hver 10. minutt. For eksempel, legg til hERG-blokkeren E4031 ved en endelig konsentrasjon på 1 μM. For dette fjerner 100 μl medium og tilsett det samme volumet av 10 μM E4031 oppløst i mediet.
MERK: Som tidligere påvist av Cavero og kollegaer 31 , er et klokt valg av volumet der legemidlene er oppløst, viktig, da det kan endre dwelmresponsskurven dypt. - Gjenta trinn 7.2 for alle andre legemiddelkonsentrasjoner av interesse.
- Klikk "Stopp" for å avslutte opptakene på slutten av protokollen.
8.MEA Rengjøring for gjenbruk
- Når forsøket på opptaket er ferdig, fjern forsiktig mediet med en P1000 pipette. Ikke rør på innsiden av fatet da dette kan skade elektrodene. Kast ut i henhold til lokale sikkerhetsregler.
- Skyll MEA-sjetongene med deionisert vann ved hjelp av en vaskeflaske, og gjenta vaskesteget 3-4x.
MERK: På dette punktet er det ikke nødvendig at cellene er helt løsne fra brikken. - Tilsett 1 ml enzymvaskemiddeloppløsning 1% (volum / volum) i hver brønn og inkuber O / N ved 4 ° C for å tillate cellefjerning og cellefjerning.
- En dag senere, skyll MEA-sjetongene grundig med deionisert vann for å fjerne enzymoppvaskmiddeloppløsning og gjenværende celler og tilsett 1 ml avionisert vann. Rene MEA-sjetonger kan lagres nedsenket i avionisert vann ved 4 ° C.
9. Dataeksport
- Åpne MC_Data Tool-programvaren som er koblet til MEA-oppsettet.
- Klikk 'Fil' → 'Åpne MCD'.
- Klikk 'Verktøy' → 'Konverter MCD til ABF' .
- Velg elektrodene med de beste opptakssignalene som skal eksporteres til analysen. Velg katalogen der du skal lagre de eksporterte filene og klikk på "Lagre". Eksporteringsprosedyren kan ta flere minutter, avhengig av nummeret på elektrodene som er eksportert, og den totale størrelsen på opptaksfilene.
10. Dataanalyse
- Last ned og installer et elektrofysiologisk datainnsamlings- og analyseprogram ( f.eks. PClamp). Når du er ferdig, start analyseprogrammet ( f.eks. Clampfit).
- RR Intervallberegning (Figur 5).
- Plasser to vertikale markører for å definere regionen av interesse på sporet. Velg 'Hendelsesvarsling' → 'Terskelsøk'. Den horisontale markøren skal krysse alle hendelsene som må kvantifiseres, som vist i figur 5A .
- Klikk &# 39; OK 'og deretter' Godta hele kategorien '. Programvaren vil da søke gjennom sporet for alle passende hendelser. Blå merker vil bli plassert over hendelsene.
- Juster følsomheten til det automatiske valget ved å justere parametrene i hovedhendelsesdeteksjonsvinduet.
- Når alle hendelsene er identifisert automatisk, gå til resultatvinduet (Vindu → Resultater) og kopier kolonnen "Intervent Interval", som inneholder frekvensdataene ( Figur 5B ).
- QT Interval beregning (Figur 6-9):
- Plasser en markør rett før og en etter en enkelt FP i steady state-tilstand. Velg 'Event Detection' → 'Create Template' ( Figur 6 ) .
- Kontroller at FP er riktig identifisert og klikk "Legg til". Malen blir flyttet til bunnpanelet.
- Lagre mal som en '.atf'fil. På denne måten er det opprettet et malespor som vil bli søkt av programvaren gjennom hele opptaket ( Figur 7 ). Opprett en mal for hver tilstand, siden en narkotikapåvirkning kan endre formen på FP. Hvis nødvendig, filtrer sporet litt for å inkludere maksimalt 10.000 poeng i de to markørene.
- Når malen er blitt lagret med '.atf' forlengelse, velg 'Event Detection' → 'Template Search' og last malen.
- Juster "Terskelen for malekampen" for å identifisere hele FP-en i det valgte intervallet.
- Når alle hendelsene er korrekt identifisert, lagre dem i en ny ".abf" -fil.
- Åpne filen med analysesoftware og beregner automatisk 'Tidsfrekvensen' for både Q / R og T-tappene ( figurene 8, 9 ). Hvis spor er veldig støyende, bruk et filter. Beregn QT-intervallet ved å subtrahereQ / R-verdi fra T-verdien i et valgfritt regneark.
Representative Results
En dag etter dissosiasjon og plating, vil laget av hPSC-CMs være synlig som en tett og hvit film som dekker midten av MEA-kammeret ( Figur 3A ). Etter fjerning av ringen ( figur 3B ) Laget skal forbli på plass og inspeksjon på et lysmikroskop vil vise MEA-elektrodene dekket av (kontrakterende) hPSC-CM-laget ( figur 3C ). På grunn av fysisk og elektrisk kopling av cellene vil kun en elektrode (gylden elektrode) bli brukt til analyse.
Alternativt kan de, når de arbeider med 3D-strukturer, slik som embryoidlegemer eller mikrotisser, plateres slik at de er fysisk og elektrisk koblet fra. Visuell inspeksjon ved mikroskopet kunne ikke bekrefte ingen fysisk forbindelse mellom klyngene og ikke-synkroniserte R-bølger ved MEA, bekrefter ingen elektrisk kopling. I denne cAse, flere uavhengige elektroder kan analyseres.
Typiske opptak av FP-spor er vist i figur 4 . Spesielt kan en god kvalitetsspor defineres ved tilstedeværelsen av en klar topp som svarer til Na + tilstrømning og membran depolarisering (R / Q-topp), en klar repolarisasjonsfase som tilsvarer K + efflux (T-topp) og en høy Signal til støyforhold ( figur 4A , venstre: notat y-akse skala og figur 4B ). Spor av dårlig kvalitet ( Figur 4A , midten) kan være et resultat av at hPSC-CMer ikke er koblet til MEA-platen eller av svak hPSC-CM elektrisk aktivitet. Venter 1-3 dager for bedre vedlegg kan forbedre signalet; Men hvis ingen signalforbedring er synlig, anbefales det ikke å bruke dette MEA fra eksperimenter. Støyende spor ( Figur 4A , høyre) kan analyseres etter filtrering.
Figur 5A, 5B ). Innenfor tidsintervallet som er definert av de vertikale markørene, skal blå merker som tilsvarer hver topp være tilstede. Hvis programmet ikke identifiserer en eller flere topper, kan du forsøke å flytte den horisontale markøren og kjøre analysen igjen eller justere gjenkjenningsinnstillingene. På samme måte kan vellykket analyse av QT-intervall identifiseres ved visuell inspeksjon av skjermen som viser FP-deteksjon ( Figur 7 ). Innenfor tidsintervallet som er definert av de vertikale markørene, skal blåmerke som tilsvarer hver FP-deteksjon være tilstede. Hvis programmet ikke identifiserer en eller flere FP, kan du forsøke å omdefinere FP-malingen ( Figur 6 ) eller justere gjenkjenningsinnstillingene og kjøre analysen igjen.
Utvunnet individuelle FP-spor eller deres gjennomsnitt ( FigurE 8) kan brukes til å oppnå QT-intervallverdier med spesifikke innstillinger som i figur 9 . Analyse av QT-RR-forhold er tilrådelig og er meningsfull i syke og WT hPSC-linjer ( Figur 10A ) og for å vurdere behovet og / eller effekten av QT-intervallkorrigeringer ( Figur 10B-10D ). HPSC-CM'er som bærer LQTS-forårsaker mutasjoner, har lengre QT-intervaller sammenlignet med WT-kontroller ( figur 11A ). Behandling av hPSC-CM med en hERG-blokkering resulterer i forlengelse av QT-intervallet ( figur 11B ); Omvendt resulterer behandling med en hERG-aktivator i å redusere QT-intervallet ( Figur 11C ). Endelig bør behandling med legemidler som påvirker brekningsfrekvensen av hPSC-CM være synlig som en endring i RR-intervallet ( Figur 11D , RR-intervallforkorting).
/>
Figur 1: Sterilisering og belegging av MEA Chips. ( A ) Ordningen som representerer steriliseringsprosessen, inkludert å plassere MEA-brikken i en autoklaverbar glass-petriskål, innpakning i aluminiumsfolie, damping i 6 minutter og utsetting til UV i 30 minutter. ( B ) Topp (venstre panel) og side (mellompanel) visninger av tilpasset PTFE ring; Ringen har en ytre diameter på 1,2 cm, inkludert 4 klaff som tillater sin posisjonering i midten av MEA-brikken og den indre diameteren er 0,4 cm (høyre panel). ( C ) Skjematisk som representerer fremstilling av MEA-brikken, inkludert å plassere brikken i en vanlig plastisk petriskål, tilsette 8 ml avionisert vann utenfor MEA-kammeret, plassere PTFE-ringen i midten av kammeret og belegge elektrodarmen med fibronektin . Etter inkubasjonstid fjernes fibronektin og erstattes med dyrkningsmedium.T = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Dissociation og Plating av hPSC-CMs. Skjematisk som representerer prosessene for hPSC-CMs enzymatisk dissosiasjon, sentrifugering, resuspensjon og plating på midten av MEA kammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: MEA Chips med hPSC-CM Layer. ( A ) Øverste utsikt over MEA-brikken som inneholder ringen og laget av hPSC-CM. ( B ) sidevisning av MEA-brikken etter ringfjerning. ( C ) Bright feltbilde av hPSC-CMs lag plated på mikro-Elektrode array; 4X forstørrelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: MEA-opptak av hPSC-CMer. ( A ) Representative spor registrert med MEA som viser et bra kvalitetsspor med R / Q og T-tverrtyper tydelig synlig med høyt signal / støyforhold (til venstre), et dårlig kvalitetsspor uten klart synlige R / Q og T topper (midt), Og et støyende spor med R / Q og T topper tydelig synlig, men med lavt signal / støyforhold (høyre). ( B ) Representative eksempler på FP-spor av god kvalitet med forskjellige morfologier som kan registreres under MEA-eksperimenter ved bruk av hPSC-CM. Det skyggede området representerer QT-intervallet målt under analysen. Siden FP på MEA ligner den første derivatenE av handlingspotensialet 28 , har vi beregnet integralet av FP-sporet, vist som rød prikket linje, som teoretisk demonstrasjon av et T-bølgevalg nær en fullstendig handlingspotensial repolarisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: RR Interval Beregning. ( A ) Eksempel på RR-intervallanalyse med automatisk toppdeteksjon (topp) og datautvinning (bunn) ved hjelp av analyseprogrammet (se tabell over materialer). Vertikale markører identifiserer tidsintervallet av interesse og den horisontale markøren krysser alle hendelsene som blir oppdaget og identifisert med blå karakterer. ( B ) Den forstørrede kolonnen viser de ekstraherte dataene som brukes til å beregne RR-intervallet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Opprettelse av FP-mal. Eksempel på malvalg ved å bruke vertikale markører plassert før og etter en enkelt FP. Denne malen brukes til automatisk identifikasjon av FP. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Automatisk identifikasjon av FP-mal. Eksempel på malingssøk gjennom et intervall definert av to vertikale markører. Alle de oppdagede hendelsene er identifisert med blå karakterer og er automaticallY legges over i innsatsen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Kvantifisering av FP-parametere. Analyse av de lagrede hendelsene, med R-toppen manuelt identifisert innenfor de to første markørene og T-toppen manuelt identifisert i de to siste markørene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Analysevindue. Parametre som brukes i statistikkvinduet for å oppdage R peak. For deteksjon av T-toppen, bytt markører og (om nødvendig) polarity. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: QT-RR-forhold. ( A ) Eksempel på forskjellig forhold mellom QT og RR intervaller mellom WT (LQT1 corr ) og Long QT syndrom type 1 (LQT1 R190Q ) hPSC-CMs. Skyggelagte områder viser at det samme forskyvningen i RR-intervallet genererer et større skifte i QT-intervallet i den syke linjen LQT1, noe som sannsynligvis øker arytmiens følsomhet. ( B ) Forholdet mellom ukorrigerte QT og RR intervaller målt ved MEA i CM fra 7 forskjellige hPSC linjer. Virkningen av QT-korreksjon for Bazetts ( C ) eller Fridericias ( D ) formler er vist og synlig som endring i skråningen av QT-RR i Terval forhold. Figurer tilpasset fra referanse 30 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Disease- eller Drug-induced QT og RR Interval Variations. ( A ) Eksempel på forlengelse av QT-intervall i hPSC-CM avledet fra en pasient som bærer en Long QT Syndrome (LQTS) mutasjon i forhold til sin isogene WT-kontroll. ( B ) Eksempel på forlengelse av QT-intervall i hPSC-CM ved farmakologisk hERG-blokk. ( C ) QT-intervallet forkortes ved behandling med økende doser av hERG-aktivator. Pil indikerer retningen av forkortingen. ( D ) Eksempel på medikamentinducert RR-intervallforkorting. Panel (C) ble tilpasset fra referanse> 30. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Lavt insulin, BSA, polyvinylalkohol, essensielle lipider (LI-BPEL) Medium | |||
| Komponent | Mengde for 100 ml | ||
| IMDM | 43 ml | ||
| F12 | 43 ml | ||
| Ascorbinsyre 2-fosfat (5 mg / ml i destillert vann) | 1 ml | ||
| Cellekulturtilskudd (direkte erstatning for L-glutamin) | 1 ml | ||
| Penicillin / streptomycin | 0.5ml | ||
| Phenol Red | 1 mg | ||
| Proteinfritt Hybridom Medium-II (PFHMII) | 5 ml | ||
| BSA (10% vekt / volum i IMDM) | 2,5 ml | ||
| PVA (5% vekt / vol i destillert vann) | 2,5 ml | ||
| Kjemisk definert lipidkoncentrat (CDLC) | 1 ml | ||
| Insulin-Transferrin-Selen-Etanolamin (ITS-X) 100X | 0,1 ml | ||
| A-monothioglycerol (13 μl i 1 ml IMDM) | 0,3 ml | ||
| Kombiner reagensene, filtrer med et 0,22 μm porefilter og oppbevar mediet ved 4 ° C i opptil 2 uker. | |||
Tabell 1: Li-BPEL-middelsammensetning.
Discussion
Denne protokollen viser hvordan å dissociere og forberede hPSC-CMer for å måle deres FP ved hjelp av MEA. HPSC-CM viser vanligvis spontan elektrisk aktivitet, som kan måles som FP og kan gi meningsfylt data med hensyn til slagfrekvens, QT-intervallvarighet og arytmiske hendelser.
Dissociation av 2D-hjerte-differensierte kulturer er nødvendig for å gjenskape et slaglag på MEA og det representerer et kritisk trinn. Mekanisk stress ved gjentatte pipetterings- og / eller aggressive dissosiasjonsenzymbehandlinger kan føre til høy celle dødelighet, manglende tilknytning til MEA-platen og mangel på spontan elektrisk aktivitet. Denne protokollen er optimalisert for monolagskulturer. Imidlertid kan en lignende tilnærming brukes til tredimensjonale (3D) kulturer ( f.eks. Embryoidlegemer eller EBs) med mindre modifikasjoner, som for eksempel innsamling av EB-er etterfulgt av PBS-vask og lengre inkubasjonstid med dissocierende enzym. ImportAntly, i både 2D- og 3D-differensierte kulturer, jo eldre de differensierte celler, kan den lengre inkubasjonstid som er nødvendig, være å løsne cellene på grunn av økt ekstracellulær matriksdeposisjon.
Protokollen beskrevet her for å kvantifisere FP parametere kan brukes til å generere dose-respons kurver for kardioaktive stoffer. Som nylig beskrevet av Cavero et al. 31 , kan startkonsentrasjonen av et medikament dypt påvirke utfallet av en MEA-måling. For å forbedre nøyaktigheten og påliteligheten av resultatene foreslår vi derfor følgende: 1) Ved irreversible aktivatorer / blokkere, bruk relativt store mengder medium som inneholder stoffet som skal testes. Fjern nærmere 10-50% av mediumvolumet fra MEA-brikken og tilsett et like stort mengde medium der stoffet tidligere ble oppløst ved riktig konsentrasjon. I dette tilfellet, for å beregne den endelige legemiddelkonsentrasjonen, er det kritisk å vurdereEr endringen i konsentrasjon etter medium fjerning. 2) Ved reversible aktivatorer / blokkere, tilsett 10 μL av hver dose fra en 100X stamløsning.
Flertallet av hjerteforskjellprotokollene resulterer i en variabel blandet populasjon av nodallignende, atrielignende og ventrikulære kardiomyocytter, med ventrikulær typen som den mest representert. Dette kan utgjøre en begrensning ved modellering av hjertesykdommer som påvirker en spesifikk kardiomyocyt-subtype eller medikamenter som virker på hjerte-subtypespesifikke ionkanaler. Selv om flere studier har optimalisert forhold for å styre mer kontrollert spesifikasjon under hjerteforskjellingen 3 , 5 , 37 , 38 , er deres bredere anvendelighet fortsatt under undersøkelse.
Videre varierer effektiviteten av differensiering (i forskjellige eksperimenter og i diFferent hPSC linjer) kan observeres 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Kardiomyocyt-berikende strategier basert på overflateproteinuttrykk 35 , 45 (ved hjelp av florescensassistert cellesortering eller ved valg av magnetisk perle 46 , 47 ) og metabolsk utvelgelse 44 , 48 kan utgjøre gyldige strategier som kan anvendes på noen (genetisk modifiserte eller Umodifisert) hPSC-linjens forhåndsplating av hPSC-CM, for å forbedre det elektriske signalet.
Selv om hPSC-CM er notorisk umodne sammenlignet med humane voksne kardiomyocytter 4 , 49 , har de vist seg å være verdifulle i rEcapitulering og identifisering av spesifikke sykdomsrelaterte endringer ( f.eks . I kanalopatier) 19 , 20 , 50 og medikamentinducerte responser ( f.eks. Kardiale ionkanalblokkere) 4 , 51 . Videre er umodne celler lettere å dissociere og utvinne bedre enn voksne kardiomyocytter etter dissosiasjon og plating 44 Derfor kan hPSC-CM umodenhet belønnes som en fordel i denne henseende. Men for å kunne rekapitulere f.eks . Sentielle hjertesykdommer og sentral reproduksjon av legemiddelresponser av voksne kardiomyocytter, en mer moden mekanisk, metabolisk og elektrisk hPSC-CM-tilstand bør oppnås. Metoder for å modne disse cellene inkluderer forlenget tid i kulturen 52 , mekanisk stamme 53 , elektrisk pacing 54 , tilsetning av småMolekyler 55 , 3D-kultur 56 , samkultur med andre celletyper 57 , og til og med en kombinasjon av disse tilnærmingene 58 ; Hittil har ingen av disse tilnærmingene ført til en voksenlignende fenotype.
Som en del av umodenhetsegenskapene viser hPSC-CMs elektrisk automatikk. Her er det gitt detaljer om hvordan du nøyaktig kan kvantifisere QT og RR intervaller. En begrensning for å måle spontan elektrisk aktivitet er at sammenligning av QT-intervaller kan være vanskelig når hPSC-CM viser forskjellige slagfrekvenser. I dette tilfellet kan Bazett eller Fridericia formler brukes til å korrigere QT-intervallet for frekvensen. Som tidligere rapportert, anbefaler vi sterkt at du utfører Major-Axis regresjonsanalyse ved å plotte QT-intervallet mot RR-intervall for både rå og korrigert data, for å utelukke eventuelle muligheter som skyldes selve korreksjonsmetoden.
Protokollen som presenteres her sammen med tidligere beskrevne metoder 59 , 60, hjelper standardiseringen av prosedyrene og analysen av hPSC-CM FPs, forbedrer data-reproduserbarhet og tillater en bedre sammenligning av inter-laboratorieresultater.
Disclosures
CLM er medstifter og rådgiver av Pluriomics bv. En del av publikasjonskostnadene var dekket av Multi Channel Systems.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: CVON (HUSTCARE): Det nederlandske kardiovaskulære forskningsinitiativet (den nederlandske hjertefonden, den nederlandske føderasjonen av universitetsmedisinske sentre, den nederlandske organisasjonen for helseforskning og utvikling og det kongelige nederlandske vitenskapsakademiet) Det europeiske forskningsrådet (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). Vi takker E. Giacomelli (LUMC) for hjelp med hPSC-hjerteforskjellingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| MEA2100 in vitro recording system | Multi Channel Systems | ||
| CO2 cell-culture incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Leica stereomicroscope | Leica Microsystems | MS5 | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 μL), P-200 (200 μL), P-1000 (1,000 μL)) | Gilson International | ||
| Filter tips (10 μL, 200μL, 1,000μL) | Corning | 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL) | |
| Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) | Millipore | SCGVU02RE | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL) | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Autoclavable Petri dishes | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| MEA chip | Multi Channel Systems | MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040-091 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-169 | |
| Human recombinant fibronectin | Tebu-Bio | J64560 | |
| Custom-made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings | LUMC: department of Instrument Development | ||
| Dissociation enzyme - TrypLE Select 1x | Thermo Fisher Scientific | 12563-029 | |
| Tergazyme enzyme detergent | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230-089 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for LI-BPEL medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 21056-023 | |
| F12 nutrient mixture (Ham) | Thermo Fisher Scientific | 31765-027 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Protein-free Hybridoma Medium-II (PFHMII) | Thermo Fisher Scientific | 12040-077 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bovogen Biologicals Australia | BSAS05 | |
| Poly(Vinyl Alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Chemically-defined Lipid Concentrate (CDLC) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100x | Thermo Fisher Scientific | 51599-056 | |
| α-Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| MC_Rack | Multi Channel Systems | 4.6.2 | Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems) |
| TCX Control | Multi Channel Systems | 1.3.4 | |
| MEA Select | Multi Channel Systems | 1.3.0 | |
| MC_Data Tool | Multi Channel Systems | 2.6.15 | Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.) |
| Clampfit | Molecular Devices | 7.0.0 | Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code. |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Birket, M. J., et al. Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 970-979 (2015).
- Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1728-1748 (2016).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7 (4), 394-410 (2015).
- Lewandowski, J., Kolanowski, T. J., Kurpisz, M. Techniques for the induction of human pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. J Tissue Eng Regen Med. , (2016).
- Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Davies, M. P., An, R. H., Doevendans, P., Kubalak, S., Chien, K. R., Kass, R. S. Developmental changes in ionic channel activity in the embryonic murine heart. Circ Res. 78 (1), 15-25 (1996).
- Bellin, M., et al. Isogenic human pluripotent stem cell pairs reveal the role of a KCNH2 mutation in long-QT syndrome. EMBO J. 32 (24), 3161-3175 (2013).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Ma, D., et al. Modeling type 3 long QT syndrome with cardiomyocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells. Int J Cardiol. 168 (6), 5277-5286 (2013).
- Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471 (7337), 230-U120 (2011).
- Limpitikul, W. B., et al. A Precision Medicine Approach to the Rescue of Function on Malignant Calmodulinopathic Long QT Syndrome. Circ Res. , (2016).
- Liang, P., et al. Patient-Specific and Genome-Edited Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Elucidate Single-Cell Phenotype of Brugada Syndrome. J Am Coll Cardiol. 68 (19), 2086-2096 (2016).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Mol Med. 4 (3), 180-191 (2012).
- Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. J Cell Mol Med. 16 (3), 468-482 (2012).
- Bellin, M., Mummery, C. L. Inherited heart disease - what can we expect from the second decade of human iPS cell research. FEBS Lett. 590 (15), 2482-2493 (2016).
- Sallam, K., Li, Y., Sager, P. T., Houser, S. R., Wu, J. C. Finding the rhythm of sudden cardiac death: new opportunities using induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 116 (12), 1989-2004 (2015).
- Sinnecker, D., Goedel, A., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: a versatile tool for arrhythmia research. Circ Res. 112 (6), 961-968 (2013).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacol Ther. 143 (2), 246-252 (2014).
- Terrenoire, C., et al. Induced pluripotent stem cells used to reveal drug actions in a long QT syndrome family with complex genetics. J Gen Physiol. 141 (1), 61-72 (2013).
- Abi-Gerges, N., et al. Assessment of extracellular field potential and Ca2+ transient signals for early QT/pro-arrhythmia detection using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Pharmacol Toxicol Methods. 83, 1-15 (2016).
- Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
- Blinova, K., et al. Comprehensive Translational Assessment of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes for Evaluating Drug-Induced Arrhythmias. Toxicol Sci. , (2016).
- Nerbonne, J. M. Studying cardiac arrhythmias in the mouse--a reasonable model for probing mechanisms? Trends Cardiovasc Med. 14 (3), 83-93 (2004).
- Halbach, M., Egert, U., Hescheler, J., Banach, K. Estimation of action potential changes from field potential recordings in multicellular mouse cardiac myocyte cultures. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 271-284 (2003).
- Tertoolen, L. G., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. , (2017).
- Rajamohan, D., et al. Automated Electrophysiological and Pharmacological Evaluation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25 (6), 439-452 (2016).
- Sala, L., et al. A new hERG allosteric modulator rescues genetic and drug-induced long-QT syndrome phenotypes in cardiomyocytes from isogenic pairs of patient induced pluripotent stem cells. EMBO Mol Med. 8 (9), 1065-1081 (2016).
- Cavero, I., Guillon, J. M., Ballet, V., Clements, M., Gerbeau, J. F., Holzgrefe, H. Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA): Pending issues for successful validation and implementation. J Pharmacol Toxicol Methods. , (2016).
- Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come? Br J Pharmacol. , (2016).
- Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: at the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
- Dambrot, C., et al. Strategies for rapidly mapping proviral integration sites and assessing cardiogenic potential of nascent human induced pluripotent stem cell clones. Exp Cell Res. 327 (2), 297-306 (2014).
- Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8 (12), 1037-1040 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nat Protoc. 3 (5), 768-776 (2008).
- Karakikes, I., et al. Small molecule-mediated directed differentiation of human embryonic stem cells toward ventricular cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (1), 18-31 (2014).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21 (4), 579-587 (2011).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107 (21), 2733-2740 (2003).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Fuerstenau-Sharp, M., et al. Generation of highly purified human cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cell-derived induced pluripotent stem cells. PLoS One. 10 (5), e0126596 (2015).
- Schwach, V., Passier, R. Generation and purification of human stem cell-derived cardiomyocytes. Differentiation. 91 (4-5), 126-138 (2016).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Veerman, C. C., Kosmidis, G., Mummery, C. L., Casini, S., Verkerk, A. O., Bellin, M. Immaturity of human stem-cell-derived cardiomyocytes in culture: fatal flaw or soluble problem? Stem Cells Dev. 24 (9), 1035-1052 (2015).
- Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117 (1), 80-88 (2015).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
- Otsuji, T. G., Minami, I., Kurose, Y., Yamauchi, K., Tada, M., Nakatsuji, N. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Res. 4 (3), 201-213 (2010).
- Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35 (9), 2798-2808 (2014).
- Lieu, D. K., et al. Mechanism-based facilitated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Arrhythm Electrophysiol. 6 (1), 191-201 (2013).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Mannhardt, I., et al. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. , (2016).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Curr Protoc Toxicol. 68 (22), 1-22 (2016).
- Harris, K. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte (hiPSC-CM) Multielectrode Array Assay for Preclinical Cardiac Electrophysiology Safety Screening. Curr Protoc Pharmacol. 71, 1-15 (2015).
