인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.
심근 세포는 이제 인간 배아 및 인간 유래 다 능성 줄기 세포 (hPSC) 모두로부터 높은 효율로 유도 될 수 있습니다. hPSC- 유도 된 심근 세포 (hPSC-CMs)는 인간의 심혈관 질환, 특히 부정맥 증후군을 모델링하는데 큰 가치를 갖는 것으로 점차 인식되고있다. 그들은 약물 반응을 예측하기위한 시험 관내 시스템과의 관련성을 보여 주었고, 이는 약물 스크리닝 및 발견, 안전 약리학 및 아마도 개인화 된 약에 유용 할 수있다. 이것은 hiPSCs로서 환자 또는 감수성이있는 개체로부터 hPSC-CM을 유도함으로써 촉진 될 것이다. 그러나 모든 응용 분야에서 hPSC-CM 전기적 특성에 대한 정확한 측정 및 분석은 심장 이온 채널 돌연변이 및 / 또는 이온 채널을 목표로하는 약물로 인한 변화를 확인하고 갑작스런 심장사를 유발할 수있는 필수 요소입니다. 수동 패치 클램프에 비해 다중 전극 배열 (MEA) 장치는중 ~ 고 처리량 레코딩이 가능합니다. 이 프로토콜은 hPSC-CM의 2D 세포 배양을 작은 응집체 및 단일 세포로 분리하고 자발적 전기 활동을 현장 잠재력으로 기록하기 위해 MEA에 플레이트하는 방법을 설명합니다. QT 및 RR 간격과 같은 특정 매개 변수를 추출하기 위해 기록 된 데이터를 분석하는 방법도 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 매개 변수의 변화는 심 부정맥을 담당하는 돌연변이를 가지고있는 hPSC-CM 및 특정 약물의 첨가에 따라 심장 독성 위험을 가진 사람의 검출을 허용 할 것으로 예상됩니다.
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)는 분화를 통해 인체의 모든 세포 유형을 자체 갱신하고 생성 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. hPSC를 여러 개의 심혈 관계 (심실, 심방, 심박동기 같은 심근 세포)로 분화시키는 방법에 대한 자세한 프로토콜은 3 , 4 , 5 , 6 , 7에 설명되어 있습니다. Cardiomyocytes는 전기적으로 활성 세포이며 그들의 electrophysiological 활동에 대한 자세한 지식은 심장 발달과 질병 8 이해에 매우 유익한 수 있습니다. 환자 특정 hiPSC 유래 cardiomyocytes (hiPSC-CMs)는 긴 QT 증후군을 포함하여 몇몇 심장 부정맥의 세포질, 분자 및 전기 특징을 만들고 공부하기 위하여 성공적으로 이용되었습니다(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , Brugada 증후군 14 및 카테콜아민 성 다형성 심실 빈맥 15,16 . 또한 치료 적 개입을 되풀이하고 세포 병리학 적 표현형 10 , 15 , 20 , 21 , 22 를 구제하기 위해 병에 걸린 hiPSC-CM에 여러 약물이 추가되었습니다. 보다 최근에 WT hiPSC-CM을 기반으로 한 스크리닝 플랫폼이 인간의 시스템이 약물 발견의 초기 단계 인 23 , 24 , 25 의 필요성에 대응하여 개발되었다. 설치류의 심근 세포는 hu이온 채널 표현과 생물 물리학에 능숙 26 .
이를 위해 중 ~ 고 처리량 응용에 적합한 기술을 개발하고 구현하고 있습니다. 여기에는 막 전위, Ca 2+ 과도 현상 및 변형의 광학 기록, 임피던스 측정 (세포 수축성의 간접 측정) 및 세포 외 필드 전위 (FP) 측정이 포함됩니다 (참고 자료 24 참조). Multi-electrode Arrays (MEA) 장치는 단층 또는 심근 세포의 작은 클러스터에 의해 생성되고 형성되는 전기적 파형 신호 (또는 FP)를 기록 할 수 있습니다. FP 윤곽은 심장 활동 잠재력 및 심전도 (ECG) 기록 27 과 어느 정도 일치합니다. 그들은 전형적으로 Na + 유입 및 막 탈분극 (R / Q 피크)에 대응하는 초기 급속 상향 행정을 나타내며, 느린 파 / 고원 위상은 Ca2+ 유입 및 우세한 K + 유출 (T 피크)에 상응하는 재분극 단계를 포함한다. FP 파형의 섭동은 특정 활동 전위 단계의 변화와 상관 관계가 있습니다 28 .
upstroke 속도와 resting 막 잠재력과 같은 매개 변수에 대한 action potential의 patch clamp 기록은보다 유익 할 수 있지만, 중간 및 높은 처리량 규모의 실험에서는 수작업 측정이 불가능하며 자동화 된 패치 클램프는 최근 hPSC에만 적용되었습니다 -CM 29 . 그러나 MEA에 대한 장기간의 기록으로 인해 화합물에 대한 급성 및 만성 노출을 연구 할 수 있으므로 hPSC-CM 플랫폼을 약물 스크리닝, 발견 24 , 30 및 안전 약리학 31 , 32에 사용할 수 있습니다. 이것은 미래의 정밀도 또는 perso의 약속을 유지합니다.처방 된 약 33 .
이 프로토콜의 목적은 MEA 칩에 hPSC-CM을 분리 및 도금하고 FP를 측정하는 데 필요한 정보를 제공하는 것입니다. 이 절차에서는 각 단계가 최적화되어 해리 후 최적의 세포 생존 및 회복, MEA 플레이트에 대한 최적의 세포 부착 및 매개 변수의 표준 분석 및 정량화를 보장합니다. 특히, 세포 외 FP 기록, QT 및 RR 간격 분석, 약물 효과 평가에 대한 절차가 설명되고 예시됩니다.
이 프로토콜은 MEA를 사용하여 FP를 측정하기 위해 hPSC-CM을 해리하고 준비하는 방법을 보여줍니다. hPSC-CM은 일반적으로 FP로 측정 할 수있는 자발적인 전기적 활동을 나타내며 박동 빈도, QT 간격 지속 시간 및 부정맥과 관련하여 의미있는 데이터를 제공 할 수 있습니다.
2D 심장 분화 된 문화의 해리는 MEA에 박동 층을 재생성하기 위해 필요하며 중요한 단계입니다. 반복적 인 피펫 팅 및 / 또는 공격적인 해리 효소 처리에 의한 기계적 스트레스는 높은 세포 사망률, MEA 플레이트에 부착 실패, 자발적인 전기 활동의 결핍을 초래할 수 있습니다. 이 프로토콜은 단층 배양에 최적화되었습니다. 그러나 EB 접종 후 PBS 세척 및 해리 효소와의 더 긴 배양 시간과 같은 3 차원 (3D) 배양 물 ( 예, 배아 체 또는 EB)에 대해서도 유사한 접근법을 사용할 수있다. 수입2D 및 3D 차별화 된 배양 모두에서 차별화 된 세포가 오래 될수록 배양 시간이 길어질수록 세포 외 기질 침착이 증가하기 때문에 세포를 분리 할 수 있습니다.
FP 매개 변수를 정량화하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 심장 활성 약물의 용량 – 반응 곡선을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에 Cavero et al. 도 31 에서, 약물의 출발 농도는 MEA 측정의 결과에 중대한 영향을 미칠 수있다. 따라서 결과의 정확성과 신뢰성을 높이기 위해 다음과 같이 제안합니다 : 1) 비가역 활성제 / 차단제의 경우, 테스트 할 약물이 들어있는 비교적 많은 양의 배지를 사용하십시오. 보다 자세하게는, MEA 칩으로부터 중간 부피의 10-50 %를 제거하고, 약물이 이전에 적절한 농도로 용해 된 동일한 부피의 매질을 첨가한다. 이 경우, 최종 약물 농도를 계산할 때,배지 제거 후 농도의 변화. 2) 가역적 활성제 / 차단제의 경우 100X 스톡 용액에서 각 약물 용량을 10 μL 씩 추가합니다.
심장 분화 프로토콜의 대부분은 심실 형태가 가장 많이 드러나는 노드 형, 심방형 및 심실 형 심근 세포의 다양한 혼합 인구를 초래합니다. 이는 특정 심근 세포 아형에 영향을 미치는 심장 질환 또는 심장 아형 특이 적 이온 채널에 작용하는 약물을 모델링 할 때 한계가 될 수 있습니다. 여러 연구가 심장 분화 3 , 5 , 37 , 38 동안 더 많은 통제 된 규격을 지시하기위한 조건을 최적화했지만, 그것들의 더 넓은 적용 가능성은 여전히 조사 중에있다.
또한, 분화의 가변 효율 (상이한 실험 및 di다른 hPSC 라인) 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 관찰 될 수 있습니다. 표면 단백질 발현 35 , 45 (형광 보조 세포 정렬 또는 자기 비드 선택 46 , 47 ) 및 대사 선택 44 , 48 을 기반으로하는 심근 세포 강화 전략은 유전자 변형 또는 전기 신호를 개선하기 위해 hPSC-CM의 hPSC 선 도금 이전 수정.
hPSC-CMs가 인간 성인 cardiomyocytes 4 , 49 에 비해 악명 높게 미성숙하더라도, 그들은 r에서 귀중하다는 것을 입증했다특정 질병 관련 변화 ( 예 : 채널 병증) 19 , 20 , 50 및 약물 유발 반응 ( 예 : 심장 이온 채널 차단제) 4 , 51을 찾아 내고 식별. 또한, 미성숙 세포는 해리가 더 쉽고 해리 및 도금 후 성숙한 심근 세포보다 회복되기 때문에 hPSC-CM 미성숙이 이점으로 간주 될 수 있습니다. 그러나 예를 들어 요약 할 수 있습니다. 늦은 발병 심장병을 예방하고 성숙한 심근 세포의 약물 반응을 충실하게 재현하기 위해서는보다 성숙한 기계적, 대사 적 및 전기적 hPSC-CM 상태를 얻어야한다. 이러한 세포를 성숙시키는 방법은 배양 시간 연장, 기계적 변형 ( mechanical strain ) 53 , 전기적 페이싱 ( 54) , 작은분자 55 , 3D 배양 56 , 다른 세포 유형 57 과의 공동 배양, 심지어 이들 접근법의 조합 58 ; 지금까지이 접근법들 중 어느 것도 성인과 같은 표현형을 갖지 못했다.
미성숙 기능의 일부로 hPSC-CM은 전기적 자동성을 나타냅니다. 여기에서 QT 및 RR 간격을 정확하게 정량화하는 방법에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 자연스러운 전기적 활동 측정의 한 가지 한계는 hPSC-CM이 다른 비트 주파수를 표시 할 때 QT 간격을 비교하는 것이 어려울 수 있다는 것입니다. 이 경우 Bazett 또는 Fridericia의 공식을 사용하여 빈도에 대한 QT 간격을 수정할 수 있습니다. 그러나 이전에보고 된 바와 같이, 교정 방법 자체로 인한 가능한 편향을 배제하기 위해 원시 및 교정 데이터 모두에 대해 QT 간격 대 RR 간격을 플로팅하여 장축 회귀 분석을 수행하는 것이 좋습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 이전에 설명한 방법 59 , 60 과 함께 hPSC-CM FP의 절차 및 분석을 표준화하고 데이터 재현성을 개선하며 실험실 간 결과를 더 잘 비교할 수 있도록 도와줍니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 CVON (HUSTCARE) : 네덜란드 심장 혈관 연구 구상 (네덜란드 심장 재단, 네덜란드 의료 센터 연합회, 네덜란드 건강 연구 개발기구 및 네덜란드 왕립 과학원)의 지원을 받았다. 유럽 연구위원회 (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). hPSC 심장 분화에 도움을 주신 E. Giacomelli (LUMC)에게 감사드립니다.
Biological safety cabinet/laminar flow hood | Cleanair | ||
MEA2100 in vitro recording system | Multi Channel Systems | ||
CO2 cell culture incubator | Sanyo | MCO-15A | |
Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
Leica stereomicroscope | Leica Microsystems | MS5 | |
Handheld pipetman (P-10 (10μL), P-200 (200μL), P-1000 (1000μL)) | Gilson International | ||
Filter tips (10 μL, 200μL, 1000μL) | Corning | 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL) | |
Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) | Millipore | SCGVU02RE | |
Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL) | |
Tweezers | Dumont | ||
Autoclavable Petri dishes | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
MEA chip | Multi Channel Systems | MEA200/30iR-Ti-gr | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040-091 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-169 | |
Human recombinant fibronectin | Tebu-Bio | J64560 | |
Custom made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings | LUMC: department of Instrument Development | ||
Dissociation enzyme – TrypLE Select 1X | Thermo Fisher Scientific | 12563-029 | |
Tergazyme enzyme detergent | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | |
Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230-089 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for LI-BPEL medium | |||
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21056-023 | |
F12 | Thermo Fisher Scientific | 31765-027 | |
Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
Protein Free Hybridoma Medium-II (PFHMII) | Thermo Fisher Scientific | 12040-077 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Bovogen Biologicals Australia | BSAS05 | |
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Chemically Defined Lipid Concentrate (CDLC) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100X | Thermo Fisher Scientific | 51599-056 | |
α-Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Name | Company | Software version | Comments |
MC_Rack | Multi Channel Systems | 4.6.2 | Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems) |
TCX Control | Multi Channel Systems | 1.3.4 | |
MEA Select | Multi Channel Systems | 1.3.0 | |
MC_Data Tool | Multi Channel Systems | 2.6.15 | Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.) |
Clampfit | Molecular Devices | 7.0.0 | Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code. |