Elektrofysiologisk karakterisering av kardiomyocyter härledda från humana Pluripotenta stamceller (hPSC-CM) är avgörande för hjärt-sjukdomsmodellering och för bestämning av läkemedelsreaktioner. Detta protokoll tillhandahåller den nödvändiga informationen för att dissociera och plåta hPSC-CM på multi-elektrod-arrays, mäta deras fältpotential och en metod för att analysera QT- och RR-intervaller.
Kardiomyocyter kan nu härledas med hög effektivitet från både humana embryonala och humana inducerade Pluripotenta stamceller (hPSC). HPSC-härledda kardiomyocyter (hPSC-CM) erkänns alltmer som stort värde för modellering av kardiovaskulära sjukdomar hos människor, särskilt arytmi-syndromer. De har också visat relevans som in vitro- system för att förutsäga läkemedelssvar, vilket gör dem potentiellt användbara för läkemedelssökning och upptäckt, säkerhetsfarmakologi och eventuellt slutligen för personlig medicin. Detta skulle underlättas genom att härleda hPSC-CM från patienter eller mottagliga individer som hiPSCs. För alla tillämpningar är emellertid precision mätning och analys av hPSC-CM elektriska egenskaper avgörande för att identifiera förändringar på grund av hjärt-jonkanalmutationer och / eller läkemedel som riktar sig mot jonkanaler och kan orsaka plötslig hjärtdöd. Jämfört med manuell patch-clamp, multi-electrode array (MEA) enheter erbjuda fördelen avVilket möjliggör inspelningar av medium till hög genomströmning. Detta protokoll beskriver hur man dissocierar 2D-cellkulturer av hPSC-CM till små aggregat och enskilda celler och plåter dem på MEA för att registrera sin spontana elektriska aktivitet som fältpotential. Metoder för att analysera den registrerade data för att extrahera specifika parametrar, såsom QT och RR-intervallen, beskrivs också här. Förändringar i dessa parametrar skulle förväntas i hPSC-CM som bär mutationer som är ansvariga för hjärtarytmi och efter tillsats av specifika läkemedel, vilket möjliggör detektion av de som bär en kardiotoxisk risk.
Human Pluripotent Stamceller (hPSCs) har kapacitet att självförnya och generera praktiskt taget vilken cell som helst av människokroppen genom differentiering 1 , 2 . Detaljerade protokoll om hur man riktar differentieringen av hPSC till flera hjärtklinor (ventrikulära, atriella, pacemakerliknande kardiomyocyter) har beskrivits 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Kardiomyocyter är elektriskt aktiva celler och detaljerad kunskap om deras elektrofysiologiska aktivitet kan vara mycket informativ för att förstå hjärtutveckling och sjukdom 8 . Patientspecifika hiPSC-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) har framgångsrikt använts för att modellera och studera cellulära, molekylära och elektriska egenskaper hos flera hjärtarytmier, inklusive långt QT-syndrom(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , Brugadas syndrom 14 och katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi 15 , 16 . Vidare har flera läkemedel tillsatts till sjuka hiPSC-CM för att rekapitulera terapeutisk ingrepp och för att rädda de cellulära patologiska fenotyperna 10 , 15 , 20 , 21 , 22 . Mer nyligen har screeningsplattformar baserade på WT hiPSC-CMs utvecklats som svar på behovet av humana system till de tidiga faserna av läkemedelsupptäckt 23 , 24 , 25 eftersom gnagarekardiomyocyter skiljer sig djupt från huMans i jonkanaluttryck och biofysik 26 .
För detta ändamål utvecklas och implementeras tekniker som är lämpliga för medium till hög genomströmning. Dessa inkluderar optiska inspelningar av membranpotential, Ca 2+ transienter och belastning, impedansmätningar (som en indirekt mätning av cellkontraktilitet) och mätningar av extracellulär fältpotential (FP) (för granskning se referens 24 ). Multi-electrode Arrays (MEA) -anordningar möjliggör inspelning av de elektriska vågformsignalerna (eller FP) genererade och formade av monolager eller små klyftor av kardiomyocyter. FP-konturen korrelerar med hjärtaktivitetspotentialen och i viss utsträckning med elektrokardiograminspelningarna (ECG) 27 ; De visar typiskt en initial snabb uppsteg motsvarande Na + -inflödet och membrandepolarisationen (R / Q-topp), en långsam våg / platåfas som sannolikt motsvarar Ca2 + tillströmning och en repolarisationsfas som motsvarar en dominerande K + -utflöde (T-topp). Perturbation av FP-vågformen kan korreleras med förändringar i specifika handlingspotentialfaser 28 .
Även om patch-clamp-inspelningar av åtgärdspotentialer kan vara mer informativa, speciellt för parametrar som uppstegshastighet och vilande membranpotential, är manuella mätningar inte genomförbara för experiment i medelstor och hög genomströmningsskala, medan automatiserad patchklämma först nyligen har applicerats på hPSC -CMs 29 . Eftersom långvariga inspelningar på MEA tillåter både akut och kronisk exponering för föreningar som ska studeras är det emellertid nu möjligt att använda hPSC-CM-plattformar för läkemedelsscreening, upptäckt 24 , 30 och för säkerhetsfarmakologi 31 , 32 . Detta håller löftet om framtida precision eller persoNaliserad medicin 33 .
Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla nödvändig information för att dissociera och plätera hPSC-CM på MEA-chips och mäta deras FP. I detta förfarande har varje steg optimerats, vilket garanterar optimal cellöverlevnad och återhämtning efter dissociation, optimal cellfästning till MEA-plattan och standardiserad analys och kvantifiering av parametrar. I synnerhet förklaras och exemplifieras förfarandet för extracellulär FP-registrering, analys av QT- och RR-intervaller och utvärdering av läkemedelseffekter.
Detta protokoll visar hur man dissocierar och förbereder hPSC-CM för att mäta deras FP med hjälp av MEA. HPSC-CM visar vanligtvis spontan elektrisk aktivitet, som kan mätas som FP och kan ge meningsfull data med avseende på slagfrekvens, QT-intervallvaraktighet och arytmiska händelser.
Dissociering av 2D-hjärtdifferentierade kulturer behövs för att återskapa ett slaglager på MEA och det representerar ett kritiskt steg. Mekanisk stress genom upprepade pipetterings- och / eller aggressiva dissociationenzymbehandlingar kan leda till hög celldödlighet, misslyckande att fästa på MEA-plattan och brist på spontan elektrisk aktivitet. Detta protokoll har optimerats för monolagskulturer. Emellertid kan ett liknande tillvägagångssätt användas för tredimensionella (3D) kulturer ( t.ex. embryoidkroppar eller EBs) med mindre modifieringar, såsom insamling av EB: erna följt av PBS-tvätt och längre inkubationstid med dissocierande enzymet. ImporteraAntly, i både 2D- och 3D-differentierade kulturer kan de äldre de differentierade cellerna, den längre inkubationstiden som krävs, vara att avlägsna cellerna på grund av ökad extracellulär matrisavsättning.
Protokollet som beskrivs här för att kvantifiera FP-parametrar kan användas för att generera dosresponsskurvor för kardioaktiva läkemedel. Såsom nyligen beskrivits av Cavero et al. 31 , kan startkoncentrationen av ett läkemedel på ett djupt sätt påverka resultatet av en MEA-mätning. För att förbättra noggrannheten och tillförlitligheten av resultaten, föreslår vi följande: 1) Om det gäller irreversibla aktivatorer / blockerare, använd relativt stora volymer av medium innehållande det läkemedel som ska testas. Mer detaljerat, ta bort 10-50% av medelvolymen från MEA-chipet och tillsätt en lika stor mängd medium där läkemedlet tidigare löstes vid lämplig koncentration. I detta fall är det avgörande för beräkningen av den slutliga läkemedelskoncentrationenÄr förändringen i koncentration efter mediumavlägsnande. 2) Vid reversibla aktivatorer / blockerare, tillsätt 10 μL av varje läkemedelsdos från en 100X stamlösning.
Majoriteten av hjärtdifferentieringsprotokollen resulterar i en variabel blandad population av nodalliknande, atriumliknande och ventrikulärliknande kardiomyocyter, varvid ventrikulärtypen är den mest representerade. Detta kan utgöra en begränsning vid modellering av hjärtsjukdomar som påverkar en specifik kardiomyocyt-subtyp eller läkemedel som verkar på hjärt-subtypsspecifika jonkanaler. Även om flera studier har optimerade förhållanden för att styra mer kontrollerad specifikation under hjärtdifferentiering 3 , 5 , 37 , 38 , är deras bredare tillämpbarhet fortfarande under utredning.
Vidare varierar effektiviteten av differentiering (i olika experiment och i diFferent hPSC-linjer) kan observeras 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Kardiomyocytberika strategier baserade på ytproteinuttryck 35 , 45 (genom florescensassisterad cellsortering eller genom magnetisk pärlselektion 46 , 47 ) och metaboliskt urval 44 , 48 kan representera giltiga strategier som kan tillämpas på alla (genetiskt modifierade eller Omodifierad) hPSC-linje före plating av hPSC-CM, för att förbättra den elektriska signalen.
Även om hPSC-CMs är notoriskt omogna jämfört med humana vuxna kardiomyocyter 4 , 49 , har de visat sig vara värdefulla i rEcapitulering och identifiering av specifika sjukdomsrelaterade förändringar ( t ex i kanalopatier) 19 , 20 , 50 och läkemedelsinducerade svar ( t ex hjärt-jonkanalblockerare) 4 , 51 . Vidare är omogna celler lättare att dissociera och återhämta sig bättre än vuxna kardiomyocyter efter dissociation och plätering 44, därför kan hPSC-CM omogenhet belönas som en fördel i detta avseende. Men för att kunna rekapitulera t.ex. Sena hjärtkärlsjukdomar och trogen reproducera läkemedelsreaktioner hos vuxna kardiomyocyter, en mer mogen mekanisk, metabolisk och elektrisk hPSC-CM-stat bör erhållas. Metoder för att mogna dessa celler innefattar förlängd tid i odling 52 , mekanisk stam 53 , elektrisk stimulering 54 , tillsats av småMolekyler 55 , 3D-kultur 56 , samkultur med andra celltyper 57 och även en kombination av dessa tillvägagångssätt 58 ; Hittills har ingen av dessa metoder lett till en vuxenliknande fenotyp.
Som en del av omättningsegenskaperna visar hPSC-CMs elektrisk automatiskitet. Här anges detaljer om hur man exakt kan kvantifiera QT- och RR-intervaller. En begränsning av mätning av spontan elektrisk aktivitet är att jämförelse av QT-intervaller kan vara svårt när hPSC-CM visar olika slagfrekvenser. I detta fall kan Bazett eller Fridericia formler användas för att korrigera QT-intervallet för frekvensen. Men som tidigare rapporterats 30 rekommenderar vi starkt att utföra Major-Axis regressionsanalys genom att plotta QT-intervallet mot RR-intervall för både rå och korrigerad data, för att utesluta eventuell förspänning på grund av själva korrigeringsmetoden.
Protokollet som presenteras här tillsammans med tidigare beskrivna metoder 59 , 60 hjälper standardiseringen av förfarandena och analysen av hPSC-CM-FP, förbättrar datareproducerbarhet och möjliggör en bättre jämförelse av resultaten mellan laboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Det här arbetet stöddes av följande bidrag: CVON (HUSTCARE): Nederländskt kardiovaskulärt forskningsinitiativ (Holländska Hjärtfonden, Holländska federationen för universitetsmedicinska centra, Nederländska organisationen för hälsoforskning och utveckling och Kungliga Nederländernas vetenskapsakademi). Europeiska forskningsrådet (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). Vi tackar E. Giacomelli (LUMC) för hjälp med hPSC-hjärtdifferentiering.
Biological safety cabinet/laminar flow hood | Cleanair | ||
MEA2100 in vitro recording system | Multi Channel Systems | ||
CO2 cell culture incubator | Sanyo | MCO-15A | |
Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
Leica stereomicroscope | Leica Microsystems | MS5 | |
Handheld pipetman (P-10 (10μL), P-200 (200μL), P-1000 (1000μL)) | Gilson International | ||
Filter tips (10 μL, 200μL, 1000μL) | Corning | 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL) | |
Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) | Millipore | SCGVU02RE | |
Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL) | |
Tweezers | Dumont | ||
Autoclavable Petri dishes | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
MEA chip | Multi Channel Systems | MEA200/30iR-Ti-gr | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040-091 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-169 | |
Human recombinant fibronectin | Tebu-Bio | J64560 | |
Custom made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings | LUMC: department of Instrument Development | ||
Dissociation enzyme – TrypLE Select 1X | Thermo Fisher Scientific | 12563-029 | |
Tergazyme enzyme detergent | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | |
Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230-089 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for LI-BPEL medium | |||
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21056-023 | |
F12 | Thermo Fisher Scientific | 31765-027 | |
Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
Protein Free Hybridoma Medium-II (PFHMII) | Thermo Fisher Scientific | 12040-077 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Bovogen Biologicals Australia | BSAS05 | |
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Chemically Defined Lipid Concentrate (CDLC) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100X | Thermo Fisher Scientific | 51599-056 | |
α-Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Name | Company | Software version | Comments |
MC_Rack | Multi Channel Systems | 4.6.2 | Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems) |
TCX Control | Multi Channel Systems | 1.3.4 | |
MEA Select | Multi Channel Systems | 1.3.0 | |
MC_Data Tool | Multi Channel Systems | 2.6.15 | Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.) |
Clampfit | Molecular Devices | 7.0.0 | Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code. |