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Immunology and Infection

कंजन्टाटावा से अलगाव और फेनोटाइप कोशिकाओं का एक गैर-इनवेसिव मार्ग

Published: July 5, 2017 doi: 10.3791/55591
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3,4,5, 1
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute, 3Singapore National Eye Center, 4Duke-NUS Medical School, 5Yong Loo Lin School of Medicine

Summary

उजागर सामान्य ओक्यूलर सतह में कॉर्निया और कंजाक्तिवा होते हैं। उपकला कोशिकाओं, पिंड कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिका कंजाक्तिवा में मौजूद हैं। यहां, एक गैर-इनवेसिव, इंप्रेशन साइटोलॉजी की तकनीक, इम्प्रेशन साइोटिकॉजी डिवाइस का प्रयोग करके वर्णित की जाती है और नेत्रश्लेष्मला में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए फ्लो साइटमैट्री।

Abstract

परंपरागत रूप से, ओक्यूलर सतह कोशिका विज्ञान का अध्ययन तकनीक तकनीक और ब्रश प्रौद्योगिकी जैसे तकनीकों के साथ किया जाता है। इन तकनीकों के साथ समस्या यह है कि वे आँख की सतह पर घावों को प्रभावित कर सकते हैं, जो झुर्री, पलक विरूपता, स्नायु स्टेम कोशिका की कमी और कुछ मामलों में प्रगति कर सकती है, इस विषय के लिए काफी परेशानी पैदा कर सकता है। इन नैदानिक ​​समस्याओं से बचने के लिए, सूक्ष्म आंखों की बीमारी का निदान करने के लिए इंप्रेशन साइटोलॉजी (आईसी) विकसित किया गया था और बाद में नेपलाशिया, एपोटीक रोग, वर्नाल केरैटोकोनजंक्टिवैटिस और केरैटोकोनजंक्टिविटिस सिसा। आमतौर पर, चिकित्सक मैन्युअल रूप से आवश्यक कागजात में फिल्टर पेपर काटते हैं और यह ओक्यूलर सतह पर लागू होते हैं। यहां, हम यह वर्णन करते हैं कि वाणिज्यिक तौर पर उपलब्ध चिकित्सा उपकरण का उपयोग करके आईसी कैसे करें। इस तकनीक को यहाँ समझाया गया है जो फ्लो साइटोमेट्री द्वारा इम्युनोफेनोटाइपिंग है। इस तकनीक को कम मैनुअल से निपटने की आवश्यकता है और ओक्यूलर सतह को कम चोट का कारण बनता है।

Introduction

इंप्रेशन साइटोलॉजी (आईसी) सबसे पहले थैचर एट अल 1 द्वारा 1 9 77 में किया गया था । वे उस समय अन्य तकनीकों के बजाय मरीजों से कंजन्क्चुअल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक प्लास्टिक इंप्रेशन डिस्क का इस्तेमाल करते थे जैसे स्क्रैपिंग, स्बबिंग या 1 pipetting आईसी की वर्तमान तकनीक एक शोषक फिल्टर पेपर 2 का प्रयोग करती है ताकि वह बल्ब और पेप्ब्रल कंजाक्तिवा को छापे और कंज़ेक्टिवल कोशिकाओं की सबसे सतही परत एकत्र कर सके। इन कोशिकाओं, जो अपने अंतर के अंतिम चरण तक पहुंच गए हैं, लगातार 3 आँसू में बहाए जाते हैं। आईसी नमूनों में कोशिकाओं की तीन प्रमुख आबादी पाए जाते हैं: उपकला कोशिकाएं 4 , कोशिका कोशिकाओं 3 , 5 , और श्लेष्म-जुड़े लिम्फोइड ऊतक जैसे एपिथेलियम से जुड़े प्रभावकारी टी कोशिकाएं या वृक्ष के समान कोशिकाएं 6 आईसी सैम में ऊपरी सतह कोशिकाएंPles माइक्रोस्कोपी, प्रतिरक्षा-धुंधला और रिवर्स-ट्रांस्क्रिप्टेज़ पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) 7 द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। आईसी झिल्ली 8 को स्क्रैप करके एकत्रित प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए फ्लो साइटमैट्री हाल ही में उपयोग किया गया है दिलचस्प है, आईसी 6 , 9 का उपयोग कई ओकुलर सतह रोगों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है जिनमें केराटोकोएंजेक्टिवैटिस सिका, विटामिन ए की कमी, सिट्रेटिक एपीपी, एपोटीक रोग, बेहतर लिम्बिक केरैटोकोनजेंटिवैटिस, वर्नाल केरैटोकोनजंक्टिवैटिस, और उपकला स्क्वैमस मेटाप्लासिआ शामिल हैं। आईसी का संपर्क लेंस पहनने, ओक्यूलर सतह रोगाणुओं का पता लगाने, और अनुप्रस्थ अध्ययन 10 , 11 , 12 में चिकित्सीय हस्तक्षेप की चिकित्सीय प्रभावकारिता और सहनशीलता का परीक्षण करने के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया है।

चिकित्सा उपकरण (आईप्रीम) को एक प्रकार की पाली द्वारा समर्थित किया गया हैएथरसफॉफ़ोन (पीईएस) 0.2-माइग्रो झिल्ली, जिसे प्रवाह कोशिकामी (ओएसआईसी-प्रवाह) के साथ ओक्यूलर इंप्रेशन साइटोलॉजी की तकनीक के लिए पहले से मान्य किया गया है और रोग की प्रगति और उपचार के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए अनुदैर्ध्य नमूने का उपयोग करने के अवसर खोलता है ( जैसे , विस्तृत इंटरेपिटेलियल ल्यूकोसाइट्स का विश्लेषण, श्लेष्म झिल्ली पेम्फीगॉइड में प्रगतिशील कंजन्क्चुअली फाइब्रोसिस के लिए पोटीन बीमारी मार्कर के रूप में परिभाषित) 13 शुरुआती शोधकर्ताओं ने ऑटोक्लेवेड पीईएस फिल्टर का उपयोग किया था जिनके लिए मैन्युअल इंप्रेशन आवश्यक था। नतीजतन, उपज चर और उपयोगकर्ता निर्भर था। इस चिकित्सा उपकरण का लाभ उपयोग, मानकीकृत दबाव (पीए या एन / एम 2 ) में आसानी है, और दोहराव, पुनरुत्पादन, और सुसंगत सेलुलर वसूली को सक्षम करता है। यह तकनीक आउट-रोगी क्लिनिक में उपयोगी है क्योंकि यह गैर-सर्जिकल, आसान-प्रदर्शन और तेज़ है। निर्देश 9 93/42 / सीईई, सीई 04 99 (एसएनसीएच) के अनुसार यह एक कक्षा 1 (बाँझ) चिकित्सा उपकरण है। यह केवल आवश्यकता होती हैप्रक्रिया के दौरान सामयिक संज्ञाहरण, जो ओक्यूलर सतह की अखंडता के रखरखाव को सुनिश्चित करता है। आईसी के बाद, प्रवाह कोशिकामितीय के लिए कोशिकाओं को तुरंत संसाधित किया जा सकता है। इसके अलावा, गैर-नेत्र विज्ञान तकनीशियनों और नर्सों को ओक्यूलर सतह का नमूना करने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है।

अन्य तकनीकों पर आईसी के सुधार के बावजूद, कई चुनौतियां बनी रहती हैं उदाहरण के लिए, आईसी की स्थिति के आधार पर बल्ब कंज़ुन्तुवा में नमूनाकरण और क्षेत्रीय मतभेदों के क्षेत्र में भिन्नता हो सकती है विविधता का एक अन्य स्रोत आईसी के दौरान विभिन्न मात्रा में दबाव के आवेदन के कारण होता है अन्य विधि संबंधी मुद्दों में सेल प्रसंस्करण के मानकीकरण शामिल होते हैं: इनमें अवधि और निर्धारण की विधि और संभावित भंडारण की स्थिति शामिल होती है, जो नमूनाकृत सामग्री की स्थिरता को प्रभावित कर सकती है।

इस तकनीक का समग्र लक्ष्य ओकुलर छाप के नमूने था कि अलगाव की एक विधि विकसित करना हैटी उपयोग करने में आसान है, गैर-इनवेसिव और क्लिनिकल नमूनों के प्रतिरक्षाविज्ञानी लक्षण वर्णन पर लागू किया जा सकता है।

Protocol

सिंगापुर नेशनल आई सेंटर में सिंगल हॉलीवैट सेंट्रलाइज्ड इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड और नानयांग टेक्नोलॉजीकल यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड, सिंगापुर द्वारा अनुमोदित सिंगापुर नेशनल आई सेंटर में इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए सभी ओकुलर नमूने एकत्र किए गए थे।

नोट: आईसी के प्रदर्शन से पहले सूजन की आशंका और आंसू शिथिलता की गंभीरता का आकलन करने के लिए विषयों को चिकित्सीय परीक्षण किया गया है। नैदानिक ​​परीक्षणों में नॉन-इनवेसिव आंसू ब्रेक-अप टाइम (एनआई-टीबीयूटी) 14 और कंज़ेक्टीवल लालिनेस (हाइपरेमीया) 15 , 16 को डायग्नोस्टिक इंस्ट्रूमेंट, शर्मर के परीक्षण 17 , आइ ड्राईनेस (स्पीड) प्रश्नावली 18 के मानक रोगी मूल्यांकन और कॉर्नियल धुंधला 1 9

1. आईसी द्वारा ऑकुलर नमूने का संग्रह

  1. नैदानिक ​​स्थिति के निर्धारण के बाद, anesthetizeप्रतिभागी की आँखें सामयिक संज्ञाहरण, प्रोपराकाइन हाइड्रोक्लोराइड के 1 - 2 बूंदों को बेहतर बल्बर कंजाक्तिवा और अवर अवरिकर के लिए लगाने से। 4 से 5 मिनट तक इंतजार करें, क्योंकि संवेदनाहारी का डूबने लगने के लिए बंद करें।
  2. दो छाप कोशिका विज्ञान उपकरणों के साथ नाक और अस्थायी बल्ब कंजाक्तिवा दोनों से नमूने ले लीजिए
    नोट: एक उपकरण दो इंप्रेशन नमूने के संग्रह के लिए उपयोग किया जाता है। यहां, दो उपकरणों का उपयोग चार छाप झिल्ली के संग्रह के लिए किया गया था
    1. छद्म कोशिका विज्ञान तंत्र को कंजन्टाटावा पर स्पर्शरेखा तरीके से रखें पुश-बटन को धीरे से दबाएं और 2-3 के लिए पकड़ो
      नोट: डिवाइस झिल्ली के साथ आता है। बटन को दबाए जाने के बाद दबाव स्वचालित रूप से जारी किया जाता है यह दबाव को रिलीज करने के लिए केवल कुछ सेकंड लेता है और उपकरण को निकाल देता है
  3. 1 एमएल ऑफ़ कल्चर मीडिया (रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट माध्यम (आरपीएमआई) + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त माइक्रोप्रोसेफ्यूज ट्यूब में झिल्ली को जारी करना(एफबीएस) + 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन स्ट्रेप)) एक स्केलपेल द्वारा।
  4. एक 10 μL विंदुक टिप के साथ लगभग 1 मिनट के लिए लगातार स्क्रैपिंग द्वारा डिवाइस के झिल्ली से कोशिकाओं को अलग करें।
    नोट: झिल्ली की सतह असमान हो जाने पर स्क्रैपिंग पूरा हो गया है। प्रत्येक झिल्ली से सेल नंबर चर (100 - 500 कोशिकाएं / झिल्ली) है संग्रह के 2 - 3 ह के भीतर नमूनों पर प्रक्रिया करें।

2. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा इम्यूनोफेनोटाइपिंग सेल

  1. मीडिया को निकालने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 एक्सजी की कोशिकाओं को अपकेंद्रित करें। 50 μL प्रवाह cytometry staining बफर (फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) + 0.05% गोजातीय सीरम एल्बिन (बीएसए) के साथ सेल गोली resuspend)।
  2. एंटीबॉडी के पैनल के साथ दाग कोशिकाओं ( उदाहरण के लिए , सीडी 3 शानदार वीओलेट (बीवी) 510 (यूसीएचटी 1), सीडी 4 ऑलॉफीकोकायनिन-एच 7 (एपीसी-एच 7) (एसके 3), सीसीआर 7 फाइकेरीथ्रिन (पीई) -ए, सीडीआईआरओआरओ पीई-साइनाइन 7 (पीई- Cy7) -ए, और लाइव / डेड सेल मार्क 7-ADD) कमरे के तापमान पर 20 से 30 मिनट के लिएअंधेरा। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार स्टॉक से सीधे एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    नोट: एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए, 2.5 μL का सीडी 3-बीवी 510, 1.25 μL सीडी 4-एपीसी-एच 7, सीडीआईआरआरओ-पीई-सीआई 7, 7-एएडी और 10 μL सीसीआर 7-पीई का उपयोग करें। एंटीबॉडी के अलग-अलग सांद्रता का वर्णन करने के लिए परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) का उपयोग करें। अनुमापन के लिए, निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित एंटीबॉडी एकाग्रता ले लो और आधे और एक चौथाई अनुशंसित एकाग्रता का उपयोग करें। अन्य फ्लोरोक्रोम चैनलों पर फैल-ओवर से बचने के लिए एंटीबॉडीज की न्यूनतम एकाग्रता का उपयोग करें। स्पष्ट संकेत एंटीबॉडीज के उल्लेखनीय सांद्रता के साथ मनाए गए थे। मुआवजे पीबीएमसी के परीक्षण के द्वारा प्रारंभ में विलियम्स एट अल में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। 20 परीक्षण के लिए, पीबीएमसीज़ यहां इस्तेमाल एंटीबॉडी के एक ही सेट से युक्त थे और एकल और एकाधिक एंटीबॉडी स्टेंस की तुलना करके मुआवजा दिया गया था।
  3. ऊष्मायन पेरी के बादओडी, ट्यूब के धुंधला बफर के 1 एमएल को जोड़ने, अच्छी तरह से मिश्रण करें, और कमरे के तापमान पर 450 मिनट में 5 मिनट के लिए सेंटीफ्यूज करें। धुंधला बफर के 200 μL में रेसस्पेेंड कोशिकाएं।
  4. एक प्रवाह cytometry मशीन पर नमूने चलाएं।
    1. डेटा प्राप्त करने से पहले, निर्माता के निर्देशों के अनुसार अलग-अलग दिनों पर डेटा अधिग्रहण को सामान्य करने के लिए cytometer सेटअप और ट्रैकिंग (सीएस एंड टी) मोती के साथ प्रवाह cytometer चैनल के voltages जांचना।
      1. प्रवाह साइटमैट्री डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर खोलें, "सेट अप और क्यूसी" बटन पर क्लिक करें, सही सीएसएंडटी बीड लॉट संख्या चुनें, मोतियों को लोड करें, और फिर "स्टार्ट" बटन पर क्लिक करें।
    2. मशीन को नमूनों को लोड करने से पहले धीरे-धीरे ट्यूब दोहन करके कोशिकाओं को रिसेट करें। डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर खोलें और "पूर्वावलोकन" पर क्लिक करें थ्रेशोल्ड दर स्थिर होने पर, "प्राप्त करें" क्लिक करें नमूने स्तर की निगरानी करें और नमूनों को समाप्त होने पर "रोकें" पर क्लिक करें।
      नोट: नमूना प्रति 10,000 घटनाएं प्राप्त करें। 10,000 ईवेंट प्राप्त करने के बाद, वर्कशीट में एसएससी-ए और एफएससी-ए डॉट प्लॉट उत्पन्न करें।
      1. "बहुभुज गेट" बटन पर क्लिक करें और मलबे छोड़ने के लिए एफएससी-ए मान> 5 x 10 4 के साथ सभी घटनाओं पर गेट (यह पी 1 है) खीचें। एक नई डॉट प्लॉट बनाने के लिए "डॉट प्लॉट बनाएं" बटन पर क्लिक करें, डॉट ब्लॉट पर राइट क्लिक करें, "प्लॉट एडिटर" विंडो खोलने के लिए "गुण" चुनें, और फिर "P1" चुनें। पी 1 डॉट प्लॉट के एक्स-अक्ष पर एफएससी-ए पर क्लिक करें, इसे सीडी 3-बीवी 510 में बदलें। सीडी 3 + आबादी का चयन करने के लिए '' बहुभुज गेट '' बनाएं और इसे '' पी 2 '' नाम दें।
      2. एक नई डॉट प्लॉट बनाने के लिए "डॉट प्लॉट बनाएं" बटन पर क्लिक करें, डॉट ब्लॉट पर राइट क्लिक करें, "प्लॉट एडिटर" विंडो खोलने के लिए "गुण" चुनें। पी 2 डॉट साजिश के एक्स-अक्ष पर एफएससी-ए पर क्लिक करें और उसे 7-एएडी में बदलें। 7-एएडी के लिए '' बहुभुज गेट '' आरेखित करें और '' पी 3 '' चुनें। पी 3 यहां सीडी 3 + हैलाइव कोशिकाएं
      3. एक नई डॉट प्लॉट बनाने के लिए "डॉट प्लॉट बनाएं" बटन पर क्लिक करें, डॉट ब्लॉट पर राइट क्लिक करें, "प्लॉट एडिटर" विंडो खोलने के लिए "गुण" चुनें। पी 3 डॉट साजिश के वाई-अक्ष पर एक्स-अक्ष पर सीडी 3-बीवी 510 और सीडी 4-एपीसीएच 7 पर क्लिक करें। चतुर्भुज के ऊपरी और निचले पक्षों पर आयताकार गेट्स को निकालें और क्रमशः '' पी 4 '' और 'पी 5' चुनें। पी 4 लाइव सीडी 3 + सीडी 4 + और पी 5 लाइव सीडी 3 + सीडी 4 - टी कोशिका है।
      4. एक नई डॉट प्लॉट बनाने के लिए "डॉट प्लॉट बनाएं" बटन पर क्लिक करें, डॉट ब्लॉट पर राइट क्लिक करें, "प्लॉट एडिटर" विंडो खोलने के लिए "गुण" चुनें। दोनों पी 4 और पी 5 भूखंडों के वाई-अक्ष पर एक्स-अक्ष और सीसीआर 7-पीई पर CD45RO PE-Cy7 क्लिक करें। इस डॉट प्लॉट पर 'क्वाड गेट' को ड्रा करें
        नोट: ऊपरी बाएं हाथ की ओर, ऊपरी दाहिने हाथ की ओर, निचले दाहिने हाथ की तरफ और निचले बाएं हाथ वाले चौराहों को यहां भोले, केंद्रीय स्मृति ( टीसी ), ईफेक्टोरॉर मेमोरी (टी ईएम ), क्रमशः विभेदित प्रभावशाली मेमोरी (टी ईएमआरए ) टी कोशिका, क्रमशः।

Representative Results

इस नैदानिक ​​डिवाइस द्वारा आईसी ने ओक्यूलर सतह को बरकरार रखने के दौरान ओक्यूलर सतह प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पृथक करने की अनुमति दी। चित्रा 1 चित्रा 1 कैसे आईसी प्रदर्शन किया गया था। नमूने एकत्र किए गए थे, जहां से आंखों की विभिन्न साइटें चिह्नित हैं चित्रा 2 दिखाता है कि 10 स्वस्थ नियंत्रणों से एकत्रित प्रवाह साइटमैट्री के प्रतिनिधि परिणाम। जीटिंग के लिए, जीवित और मृत कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए एसएससी और 7-एएडी का उपयोग करें। 7-एएडी - कोशिकाओं को जीवित कोशिकाओं के रूप में पहचाना जाता है। इन जीवित कोशिकाओं को आगे सीडी 3 + और सीडी 4 + मार्करों द्वारा वर्णित किया गया है। इसके अलावा, सीडी 4 + और सीडी 4 - आबादी प्रत्येक को आगे की तरफ, सीआईआर 7 और सीडीआईआरआररो मार्करों के साथ साइड , टी ईएम , टीसीएम और टी ईएमआरए के रूप में चिह्नित किया गया। सीडी 3 + टी कोशिकाओं में, प्रभावकारिता मेमोरी टी कोशिकाएं मानव आकृतिगत सतह में प्रबल होती हैं। पहले ई मेंएक्सपरिएंट्स, यह भी दिखाया गया है कि सीडी 8 + मेमोरी सेल्स स्वस्थ व्यक्तियों के बीच 20 इंजेक्शनल उपकला टी कोशिकाओं में प्रमुख आबादी हैं। चित्रा 3 से पता चलता है कि अध्ययन में 10 स्वस्थ नियंत्रणों में सीडी 4 + और सीडी 8 + प्रभावकार स्मृति टी कोशिकाएं (टी ईएम और टी ईएमआरए ) मानवीय आकृति सतह में प्रमुख उपसमुच्चय हैं। इस आकृति में वर्णित प्रत्येक आबादी को उनके मार्कर फेनोटाइप और नाम (साधे, टीसीएम , टी ईएम , टी ईएमआरए ) से सूचित किया गया है । लाल रंग में संख्या जनसंख्या का प्रतिशत दर्शाती है। इस आंकड़े में डेटा को ± SEM कहा जाता है

आकृति 1
चित्रा 1: इंप्रेशन साइटोलॉजी डिवाइस द्वारा ओक्यूलर सर्फेस से आईसी नमूने का संग्रह। नमूने अस्थायी बल्ब से एकत्र किए गए थेएर क्षेत्र जैसा दिखाया गया है

चित्र 2
चित्रा 2: फ्लोट साइटोमेट्री का उपयोग कर डॉट प्लॉट ग्राफ़। लाइव 7-एएडी - कोशिकाओं का चयन किया गया। सीडी 3 + कोशिकाओं को पहले गेट लगाया गया था, और फिर ये आबादी सीडी 4 + और सीडी 4 - सबसेट्स में जुटाई गई थी। सीसीआर 7 और सीडीआईआरआररो मार्करों की सहायता से भोले के अनुपात (सीसीआर 7 + सीडी 45 आरओ - ), सेंट्रल मेमोरी (सीसीआर 7 + सीडी 45 आरओ + ) और एपरॉर मेमोरी (सीसीआर 7 - सीडीआईआरओआरओ + सीसीआर 7 - सीडीआईआरओआरओ - ) सबसेट का निर्धारण किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
एफआइगेर 3: सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं में स्वस्थ मानव ऑकुलर सतह के इम्यून सेल उप-प्रकार। स्वस्थ मानव नियंत्रणों में कंजन्क्चुल्वाइवल सीडी 4 + और सीडी 8 + भोले, केंद्रीय स्मृति ( टीसीएम ), और प्रेरक मेमोरी (टी ईएम और टी ईएमआरए ) के उप-समूह का वितरण ; प्रत्येक डेटा बिंदु एक पृथक व्यक्तिगत मतलब ± एसईएम दिखाया जाता है। आबादी का प्रतिशत प्रत्येक आबादी के नाम के नीचे लाल के रूप में चिह्नित किया गया है। आबादी का कुल प्रतिशत 98% है, क्योंकि सीडी 4 + टी ईएमआरए जनसंख्या उल्लेखनीय स्कैटरप्लोट में शामिल नहीं था (बोस एट अल 21 से संशोधित)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

यह एक आसान, त्वरित और कम आक्रामक तकनीक है, जिसे पारंपरिक रूप से स्क्रैपिंग, स्विब्बिंग, पिपेटिंग या शोषक फिल्टर पेपर 1 , 2 जैसे परंपरागत तकनीकों के विपरीत अपेक्षाकृत तेज प्रतिरक्षा रूपरेखा के लिए आउट-मरीज क्लीनिक में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तकनीक का एक रूप पहले से ही अनुसंधान सेटिंग्स 22 में इस्तेमाल किया जा रहा है । प्रस्तावित कार्यप्रणाली के भविष्य के आवेदन, नेत्र रोगों के साथ नैदानिक ​​परीक्षणों में रोगी स्तरीकरण के लिए है, विशेषकर उन लोगों को जो इम्यूनोफेनोटाइपिंग की आवश्यकता होती है।

इस तकनीक के साथ एक बड़ी चुनौती इंप्रेशन संग्रह और स्क्रैपिंग के बाद प्राप्त अपेक्षाकृत कम प्रतिरक्षा कोशिकाओं है। सीडी 3 + टी कोशिकाओं की कुल संख्या ~ 500 - 1,000 कोशिकाओं से प्रति व्यक्ति अलग-अलग चार इंप्रेशन से बरामद हुई। सेल के आगे नुकसान से बचने के लिए कम समय के लिए फ्लो साइमेट्री विश्लेषण से पहले ओक्यूलर के नमूने धोए गए थेरों। प्रोटोकॉल के भीतर बने महत्वपूर्ण कदम और चुनौतियां, उच्च सेल नंबर प्राप्त करने के लिए ओकुलर नमूनों का समुचित संग्रह और झिल्ली के उचित स्क्रैपिंग। फिर भी, यह सीमा किसी विशिष्ट प्रतिरक्षा फेनोटाइप के प्रति पूर्वाग्रह की संभावना नहीं है। कोशिकाओं की पैदावार को अधिकतम करने के लिए यहां पर किए गए समस्या निवारण एंटीबॉडी के ऊष्मायन के बाद और पहले धोने के कदमों को कम करना था।

आईसी का उपयोग करने के लिए अन्य सीमाएँ हैं स्टीवन जॉन्सन सिंड्रोम जैसे गंभीर रूप से केराटाइज्ड या फाइब्रोज्ड ओक्यूलर सतह वाले रोगियों में, सेल्यूलर उपज इस अध्ययन से भी कम हो सकता है। प्रति दिन प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अनुपात बदल सकता है यदि नमूने उसी दिन विश्लेषण के बजाय संग्रहीत किए जाते हैं। यह भविष्यवाणी करना मुश्किल है कि यदि कुछ सेल प्रकार अन्य की तुलना में भंडारण के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं पिछला अध्ययनों ने कंजुक्यूप्टिव एपिथेलियल कोशिकाओं 23 में एचएलए-डीआर अभिव्यक्ति के ऊंचा स्तर की सूचना दी है, इसलिए यह अंतर होगाएचएलए-डीआर और विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्तर के बीच के संबंधों का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिरक्षी कोशिकाओं को भी रसायन के अभिव्यक्ति के स्तर से जोड़ा जा सकता है। इन मुद्दों को भविष्य के अध्ययनों में संबोधित किया जाना चाहिए

Disclosures

लेखकों ने प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की अनुपस्थिति की घोषणा की।

Acknowledgments

तकनीकी कदमों के साथ मदद करने के लिए लेखक नंदिनी नल्लप्पन और शेरोन येओ को धन्यवाद देना चाहते हैं। स्टडी-अप ग्रांट से लीग कोंग चियन स्कूल ऑफ मेडीसिन, नानयांग टेक्नोलॉजीकल यूनिवर्सिटी और सिंगापुर मिनिस्ट्री ऑफ हेल्थ के नेशनल मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एनएमआरसी) से लेफ्टिनेंट (एनएमआरसी / सीएसए / एनएएमआरसी) से अध्ययन के लिए वित्त पोषित किया गया था। 045/2012) और एनएमआरसी से अनुदान के द्वारा और केजीसी और एलटी (एनएचआईसी -12 डी-140 9 007) के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य नवाचार केंद्र द्वारा प्रशासित।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
anti-human CD3 BV510 BD Biosciences 563109
anti-human CD4 APCH7 BD Biosciences 641398
anti-human CD45RO PECy7 BD Biosciences 337168
7-AAD solution BD Biosciences 555816
anti-human CCR7 PE BD Biosciences 552176
Pippetes Eppendorf NA
Local Anaesthesia Alcaine NA
Fluorescein sodium solution Bausch & Lomb U.K Limited NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Keratograph 5M Oculus NA
Slit lamp BioMicroscope Haag Streit BM900
EyePrim Opia Technologies NA
FACS Verse BD BioSciences NA
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
GraphPad 6.0 Prism NA
FACSVerse analysis software BD NA

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References

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Bose, T., Hou, A., Lee, R., Tong, L., Chandy, K. G. A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva. J. Vis. Exp. (125), e55591, doi:10.3791/55591 (2017).

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