Summary
露出した正常眼球表面は、角膜および結膜からなる。上皮細胞、杯細胞および免疫細胞が結膜内に存在する。ここでは、非侵襲的な印象細胞学の技術が印象細胞学装置とフローサイトメトリーを用いて結膜内の免疫細胞を分析することが記載されている。
Abstract
伝統的に、眼表面細胞学は、スパチュラ技術およびブラシ技術などの技術を用いて研究されている。これらの技術の問題点は、眼の表面に外傷性の病変を誘発し、瘢痕化、眼瞼変形、角膜幹細胞欠損症に進行し、場合によっては被験者に大きな不快感を引き起こす可能性があることである。これらの臨床上の問題を回避するために、乾性眼疾患およびその後の新形成、アトピー性疾患、春季角結膜炎および乾性角結膜炎を診断するための印象細胞学（IC）が開発された。典型的には、臨床医は手動で濾紙を必要な形状に切断し、これらを眼の表面に適用する。ここでは、市販の医療機器を使用してICを実行する方法について説明します。この技術は、フローサイトメトリーによる免疫表現型解析の後に続いて説明される。この技法は、手作業の取り扱いが少なくて済み、眼表面の損傷をより少なくする。
Introduction
印象細胞学（IC）は1977年にThatcher et al 。彼らは、スクラップ、拭き取り、またはピペッティングなど、その時に利用可能な他の技術の代わりに、患者から結膜細胞を収集するためにプラスチック印象ディスクを使用した1 。 ICの現在の技術は、吸収性濾紙2を用いて球膜および眼瞼結膜を刻印し、結膜細胞の最も表面の層を集める。分化の最終段階に達したこれらの細胞は、連続して涙を流す3 。上皮細胞4 、杯細胞3,5 、および粘膜関連リンパ組織（上皮関連エフェクターT細胞または樹状細胞6）の 3つの主要な細胞集団がIC標本に見出される。 ICSAMにおける眼球表面細胞プレートは、顕微鏡検査、免疫ブロッティングおよび逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR） 7によって分析することができる。最近、ICメンブレン8を擦って集めた免疫細胞の解析にフローサイトメトリーが使用されています。興味深いことに、IC 6,9は、乾性角結膜炎、ビタミンA欠乏症、瘢痕性食細胞性アポトーシス、アトピー性疾患、上肢角結膜炎、春季角結膜炎および上皮性扁平上皮化生を含む多くの眼表面疾患の評価に使用されている。 ICはまた、コンタクトレンズの装着、眼球表面の微生物の検出、および縦走試験10,11,12における治療的介入の治療有効性および耐性の試験の影響を評価するために使用されている。
医療機器（EyePrim）は、ポリフローサイトメトリー（OSIC-フロー）による眼の印象細胞学の技術について以前に検証されており、縦走サンプリングを使用して疾患の進行および処置に対する応答（ 例えば 、詳細粘膜膜類天疱瘡における進行性結膜線維症の推定上の疾患マーカーとして定義される上皮内白血球の分析） 13 。初期の研究者は、手動印象を必要とするオートクレーブされたPESフィルターを使用した。その結果、利回りは変動し、ユーザーに依存していました。この医療用具の利点は、使いやすさ、標準化圧力（PaまたはN / m 2 ）であり、再現性、再現性および一貫した細胞回復を可能にする。この技術は外科手術ではなく、容易に実施でき、迅速であるため、外来診療所で有用である。これは、指令93/42 / CEE、CE 0499（SNCH）に従ったクラスI（無菌）医療機器です。必要なのは眼球表面の完全性の維持を確実にする処置中の局所麻酔である。 ICに続いて、細胞をフローサイトメトリーのために直ちに処理することができる。さらに、非眼科技術者および看護師が眼表面をサンプリングするように訓練されることが可能である。
他の技術に対するICの改善にもかかわらず、いくつかの課題が残っている。例えば、ICの位置に応じて、サンプリング領域および眼球結膜における地域差に起因する変動が存在し得る。変動の別の原因は、IC中に異なる量の圧力を印加することによるものである。その他の方法論的問題には、細胞処理の標準化が含まれる：これらには、持続期間および固定方法、およびサンプリングされた材料の安定性に影響を与える可能性のある貯蔵条件が含まれる。
この技術の全体的な目標は、眼の印象サンプルの分離方法を開発することである。tは使いやすく、非侵襲性であり、臨床サンプルの免疫学的特徴付けに適用することができる。
Protocol
この研究で使用されたすべての眼球試料は、SingHealth Centralized Institutional Review BoardとSingapore Nanyang Technological University Institutional Review Boardによって承認されたシンガポール国立眼センターのドライアイクリニックから収集されました。
注：被験者は、ICを実施する前に、炎症の程度および涙の機能障害の重篤度を評価するために臨床試験を受けた。臨床試験には、非侵襲的涙液分泌時間（NI-TBUT） 14および結膜の赤み（hyperemia） 15,16が含まれ、診断装置、Schirmerの試験17 、標準的患者の眼乾燥（SPEED）質問18 、および角膜染色19 。
ICによる眼球試料の採取
- 臨床状態の決定後、麻酔上眼球結膜と下眼円蓋に1〜2滴の局所麻酔薬、塩酸プロパラカインを適用することにより、参加者の眼を刺激する。麻酔薬の刺すような感覚が消えるまで4〜5分待ちます。
- 2つの印象細胞学装置を用いて、鼻および眼球結膜結膜から試料を採取する。
注記：2つのインプレッションサンプルの収集に1つのデバイスが使用されます。ここでは、4つの印象膜の収集のために2つの装置を使用した。- 印象細胞学装置を結膜上に接線方向に配置する。プッシュボタンを静かに押し、2〜3秒間押し続けます。
注記：デバイスにはメンブレンが付属しています。ボタンを押すと自動的に圧力が解放されます。圧力を解放して装置を取り外すのに数秒しかかかりません。
- 印象細胞学装置を結膜上に接線方向に配置する。プッシュボタンを静かに押し、2〜3秒間押し続けます。
- 1mLの培養培地（ロズウェルパークメモリアルインスティチューション培地（RPMI）+ 10％ウシ胎仔血清（FBS）+ 1％ペニシリン - ストレプトマイシン（Pen Strep））をメスにより投与した。
- 10μLのピペットチップで約1分間連続掻爬することにより、デバイスの膜から細胞を分離する。
注記：膜の表面が不均一になると削り取りが完了します。各膜からの細胞数は可変である（100〜500細胞/膜）。収集の2〜3時間以内に試料を処理する。
2.フローサイトメトリーによる細胞の免疫表現型解析
- 培地を除去するために、室温で5分間400xgで細胞を遠心分離する。フローサイトメトリー染色バッファー（リン酸緩衝食塩水（PBS）+ 0.05％ウシ血清アルブミン（BSA））50μLで細胞ペレットを再懸濁する。
- CD4アロフィコシアニン-H7（APC-H7）（SK3）、CCR7フィコエリトリン（PE）-A、CD45RO PE-シアニン7（PE- Cy7）-A、および生存/死細胞マーカー7-ADD）を室温で20〜30分間、ダーク。製造元のプロトコールに従って、ストックから抗体を直接使用する。
注：抗体濃度は、CD3-BV510 2.5μL、CD4-APC-H7、CD45RO-PE-Cy7、7-AAD 1.25μLおよびCCR7-PE 10μLを使用してください。末梢血単核細胞（PBMC）を使用して、異なる濃度の抗体を滴定する。滴定には、メーカーのプロトコールに記載されている抗体濃度を使用し、推奨濃度の1/2を使用する。抗体の最小濃度を使用して、他の蛍光色素チャネルへのこぼれを避ける。上記の抗体濃度では、明確なシグナルが観察された。この補償は、当初、Williams et al 。試験のために、PBMCをここで使用した同じセットの抗体と共にインキュベートし、単一および複数の抗体染色を比較することによって補正した。 - インキュベーション後、ペリチューブに染色バッファー1 mLを添加し、よく混合し、450 xgで5分間室温で遠心分離する。 200μLの染色バッファーに細胞を再懸濁する。
- フローサイトメトリー機でサンプルを分析する。
- データを取得する前に、サイトメーターセットアップおよびトラッキング（CS＆T）ビーズでフローサイトメーターチャネル電圧を較正して、メーカーの指示に従って異なる日にデータ収集を標準化します。
- フローサイトメトリーデータ収集ソフトウェアを開き、 "Set up＆QC"ボタンをクリックし、正しいCS＆Tビーズロット番号を選択し、ビーズをロードして、 "Start"ボタンをクリックします。
- サンプルを装置にロードする前に、チューブを静かにタップして細胞を再懸濁します。データ収集ソフトウェアを開き、[プレビュー]をクリックします。閾値率が安定したら、「取得」をクリックします。サンプルがなくなると、サンプルレベルを監視し、「停止」をクリックします。
注：1サンプルにつき10,000のイベントを取得します。 10,000イベントを取得した後、ワークシートにSSC-AおよびFSC-Aドットプロットを生成します。- 「ポリゴンゲート」ボタンをクリックし、FSC-A値> 5 x 10 4のすべてのイベントにゲート（これはP1）を描き、デブリを除外します。 "ドットプロットを作成"ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 "プロパティ"を選択して "プロットエディタ"ウィンドウを開き、 "P1"を選択します。 P1ドットプロットのx軸上のFSC-Aをクリックし、CD3-BV510に変更します。 「ポリゴンゲート」を描き、CD3 +の母集団を選択し、それを「P2」と命名します。
- "ドットプロットを作成"ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 "プロパティ"を選択して "プロットエディタ"ウィンドウを開きます。 P2ドットプロットのx軸上のFSC-Aをクリックし、7-AADに変更します。 7-AAD母集団のための「ポリゴンゲート」を描き、「P3」を選択します。ここでのP3はCD3 +生きている細胞。
- "ドットプロットを作成"ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 "プロパティ"を選択して "プロットエディタ"ウィンドウを開きます。 x軸のCD3-BV510をクリックし、P3ドットプロットのy軸のCD4-APCH7をクリックします。四角形の上辺と下辺にそれぞれ「P4」と「P5」を選択します。 P4は生CD3 + CD4 +であり、P5は生CD3 + CD4 - T細胞である。
- "ドットプロットを作成"ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 "プロパティ"を選択して "プロットエディタ"ウィンドウを開きます。 x軸上のCD45RO PE-Cy7をクリックし、P4とP5の両方のプロットのy軸上のCCR7-PEをクリックします。このドットプロットで「クアッドゲート」を描く。
注：ここでは、左上、右上、右下、左下の四分円はナイーブな中央メモリ（T CM ）、e（T EM ）、最終分化したエフェクターメモリー（T EMRA ）T細胞である。
- データを取得する前に、サイトメーターセットアップおよびトラッキング（CS＆T）ビーズでフローサイトメーターチャネル電圧を較正して、メーカーの指示に従って異なる日にデータ収集を標準化します。
Representative Results
この臨床装置によるICにより、眼表面を損なわずに眼球表面免疫細胞を単離することができた。 図1は、ICの実行方法を示しています。サンプルが収集された眼の異なる部位がマークされる。 図2は、10人の健常対照から収集したフローサイトメトリーの代表的な結果を示す。ゲーティングには、生細胞と死細胞を区別するためにSSCと7-AADを使用します。 7-AAD -細胞は生細胞として同定される。これらの生細胞は、CD3 +およびCD4 +マーカーによってさらに特徴付けられる。さらに、CD4 +およびCD4 -集団は、それぞれ、CCR7およびCD45ROマーカーを有するNaive、T EM 、T CMおよびT EMRAとしてさらに特徴付けられた。 CD3 + T細胞の中では、エフェクターメモリーT細胞がヒトの眼の表面で優勢である。以前のeではまた、CD8 +記憶細胞は、健常個体20の結膜上皮T細胞の主要な集団であることも示されている20 。 図3は、研究された10人の健常対照において、CD4 +およびCD8 +エフェクターメモリーT細胞（T EMおよびT EMRA ）がヒト眼表面の主要なサブセットであることを示す。図に記載された各集団は、マーカー表現型および名前（Naive、T CM 、T EM 、T EMRA ）で通知される 。赤い数字は人口の割合を示します。この図のデータは、平均±SEM
図1：インプレッションサイトロジーデバイスによる眼球表面からのICサンプルの収集。側球から試料を採取したar領域を含む。
図2：フローサイトメトリーを用いたドットプロットグラフ。ライブ7-AAD -細胞を選択した。 CD3 +細胞を最初にゲーティングし、次いでこの集団をCD4 +およびCD4 -サブセットにゲートした。ナイーブ（CCR7 + CD45RO - ）、中央記憶（CCR7 + CD45RO + ）およびエフェクター記憶（CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ）サブセットの割合は、CCR7およびCD45ROマーカーの助けを借りて決定された。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
F図3：健康なヒト眼球表面のCD4 +およびCD8 + T細胞における免疫細胞サブタイプ。健康なヒトコントロールにおける結膜のCD4 +およびCD8 +ナイーブ、セントラルメモリー（T CM ）、およびエフェクターメモリー（T EMおよびT EMRA ）サブセットの分布 ;各データ点は、別個の平均±SEMを示す。母集団の割合は、各母集団の名前の下に赤色で表示されます。 CD4 + T EMRA集団は、前述の散布図に含まれていないため（Bose ら 21から改変されている）、集団の総百分率は98％である。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
Discussion
これは、スクレイピング、拭き取り、ピペッティングまたは吸収性濾紙1,2のような従来の技術とは対照的に、比較的迅速な免疫プロファイリングのために外来診療所で使用することができる、簡単で迅速かつ侵襲性の低い技術である。この技術の変種はすでに研究セッティング22で使用されています。提案された方法論の将来の適用は、眼疾患、特に免疫表現型検査を必要とする臨床試験における患者層別化である。
この技術の主な課題は、印象採取および掻爬後に回収される比較的少ない免疫細胞である。個体当たり4回のインプレッションから回収されたCD3 + T細胞の総数は、約500〜1,000個の細胞から変動した。眼球試料をフローサイトメトリー分析の前に最小限の回数洗浄して、さらなる細胞喪失を回避したs。プロトコール内に残る重要なステップおよび課題は、より高い細胞数を達成するために、眼球サンプルの効率的な収集および膜の適切な掻爬である。それにもかかわらず、この制限は特定の免疫表現型に偏っているとは考えにくい。細胞の収率を最大にするためにここで行われたトラブルシューティングは、抗体のインキュベーションの前後の洗浄工程の数を減らすことであった。
ICの使用には他の制限があります。スティーブンジョンソン症候群のような重度の角質化または線維化した眼球表面を有する患者では、細胞収量は本研究のそれよりも少なくてもよい。免疫細胞の割合は、試料が同じ日に分析される代わりに保存される場合に変化し得る。ある種の細胞型が他の細胞型よりも貯蔵に耐性があるかどうかを予測することは困難である。以前の研究では、結膜上皮細胞におけるHLA-DR発現レベルの上昇が報告されているため、HLA-DRと特異的免疫細胞のレベルとの間の相関を評価するために評価した。免疫細胞はまた、ケモカインの発現レベルと関連し得る。これらの問題は今後の研究で取り上げられるべきである。
Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。
Acknowledgments
著者は技術的なステップを支援してくれたNandini NallappanとSharon Yeoに感謝したいと思います。この研究は、Lee Kong Chian School of Medicine、Nanyang Technological UniversityからのKGCへのスタートアップグラント、シンガポール保健省のNational Medical Research Council（NMRC）からLT（NMRC / CSA / 045/2012）およびNMRCの助成金により、KGCおよびLT（NHIC-12D-1409007）に国立衛生イノベーションセンターによって管理されている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
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