Summary
La superficie ocular normal expuesta consiste en córnea y conjuntiva. Las células epiteliales, las células caliciformes y las células inmunes están presentes en la conjuntiva. Aquí, se describe una técnica no invasiva de citología de impresión usando un dispositivo de citología de impresión y citometría de flujo para analizar células inmunes en la conjuntiva.
Abstract
Tradicionalmente, la citología de la superficie ocular se estudia con técnicas como la tecnología de la espátula y la tecnología de cepillo. El problema con estas técnicas es que pueden inducir lesiones traumáticas en la superficie del ojo, que pueden progresar a cicatrización, deformidad del párpado, deficiencia de células madre limbales y en algunos casos, causan gran incomodidad al sujeto. Para evitar estos problemas clínicos, la citología de impresión (IC) se desarrolló para diagnosticar la enfermedad ocular seca y posterior neoplasia, enfermedad atópica, queratoconjuntivitis vernal y queratoconjuntivitis sicca. Típicamente, los clínicos cortan manualmente los papeles de filtro en formas requeridas y los aplican a la superficie ocular. Aquí, describimos cómo realizar IC usando un dispositivo médico comercialmente disponible. Esta técnica se explica a continuación seguida de inmunofenotipificación por citometría de flujo. Esta técnica requiere menos manipulación manual y causa menos lesiones en la superficie ocular.
Introduction
Citología de impresión (IC) se realizó por primera vez en 1977 por Thatcher et al [ 1] . Ellos usaron un disco de impresión de plástico para recoger las células conjuntivales de los pacientes en lugar de otras técnicas disponibles en ese momento, como el raspado, frotamiento o pipeta 1 . La técnica actual de CI utiliza un papel absorbente 2 para imprimir la conjuntiva bulbar y palpebral y recoger la capa más superficial de las células conjuntivales. Estas células, habiendo alcanzado su etapa final de diferenciación, se vierten continuamente en lágrimas 3 . Tres grandes poblaciones de células se encuentran en los especímenes IC: células epiteliales 4 , células caliciformes 3 , 5 , y el tejido linfoide asociado a la mucosa, a saber , células T efectoras asociadas con el epitelio o células dendríticas [ 6] . Las células de la superficie ocular en IC samPles se pueden analizar por microscopía, inmunotransferencia y reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) 7 . Citometría de flujo se ha utilizado recientemente para analizar las células inmunes recogidas por raspado de la membrana de IC [ 8] . Curiosamente, IC 6,9 se ha utilizado para evaluar muchas enfermedades de la superficie ocular, incluyendo queratoconjuntivitis sicca, deficiencia de vitamina A, penfigoide cicatricial, enfermedad atópica, queratoconjuntivitis límbica superior, queratoconjuntivitis vernal y metaplasia epitelial escamosa. IC también se ha utilizado para evaluar el impacto del uso de lentes de contacto, la detección de microbios de superficie ocular, y la prueba de la eficacia terapéutica y la tolerancia de las intervenciones terapéuticas en estudios longitudinales [ 10 , 11 , 12] .
El dispositivo médico (EyePrim) está soportado por un tipo de poliUna membrana de 0,2 μm de éteresulfona (PES) previamente validada para la técnica de citología de impresión ocular con citometría de flujo (flujo OSIC) y abre oportunidades de utilizar el muestreo longitudinal para monitorear la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento ( p . Análisis de los leucocitos intraepiteliales definido como marcadores de enfermedad putativo para la fibrosis conjuntival progresiva en la membrana mucosa penfigoide) [ 13] . Los primeros investigadores usaron filtros de PES autoclavados que requerían impresión manual. Como resultado, el rendimiento fue variable y dependiente del usuario. La ventaja de este dispositivo médico es la facilidad de uso, la presión estandarizada (Pa o N / m 2 ), y permite la repetibilidad, la reproducibilidad y la recuperación celular consistente. Esta técnica es útil en una clínica ambulatoria porque es no quirúrgica, fácil de realizar y rápida. Este es un dispositivo médico Clase I (estéril) según la directiva 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Solo requiereS anestesia tópica durante el procedimiento, que asegura el mantenimiento de la integridad de la superficie ocular. Después de IC, las células se pueden procesar inmediatamente para la citometría de flujo. Además, es posible que los técnicos no oftalmológicos y las enfermeras sean entrenados para muestrear la superficie ocular.
A pesar de la mejora de IC sobre otras técnicas, varios retos permanecen. Por ejemplo, puede haber variación debido al área del muestreo y las diferencias regionales en la conjuntiva bulbar dependiendo de la posición del CI. Otra fuente de variación se debe a la aplicación de diferentes cantidades de presión durante el IC. Otras cuestiones metodológicas implican la estandarización del procesamiento celular: éstas implican duración y método de fijación, y las condiciones de posible almacenamiento, que pueden afectar la estabilidad del material muestreado.
El objetivo general de esta técnica es desarrollar un método de aislamiento de las muestras de impresión ocular thaT es fácil de usar, no invasivo y puede aplicarse a la caracterización inmunológica de las muestras clínicas.
Protocol
Todas las muestras oculares utilizadas en este estudio se recolectaron de la Clínica de Ojos Secos en el Centro Nacional de Ojos de Singapur aprobado por la Junta de Revisión Institucional Centralizada de SingHealth y la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur.
NOTA: Los sujetos fueron sometidos a pruebas clínicas para evaluar el grado de inflamación y la gravedad de la disfunción lagrimal antes de la IC. Las pruebas clínicas incluyeron tiempo de desgarre no invasivo (NI-TBUT) 14 y enrojecimiento conjuntival (hiperemia) 15 , 16 evaluados con un instrumento de diagnóstico, el test de Schirmer 17 , el cuestionario Estándar de Evaluación del Ocultamiento de los Ojos (SPEED) 18 y la cornea Tinción 19 .
1. Recolección de muestras oculares por IC
- Después de la determinación del estado clínico, anestesiarLos ojos del participante aplicando 1 - 2 gotas de anestesia tópica, clorhidrato de proparacaina, a la conjuntiva bulbar superior y fornix inferior. Espere de 4 a 5 minutos para que la sensación de picadura del anestésico se desvanezca.
- Recolectar muestras de la conjuntiva bulbar nasal y temporal con dos dispositivos de citología de impresión.
NOTA: Se utiliza un dispositivo para la recogida de dos muestras de impresión. En este caso, se utilizaron dos dispositivos para la recogida de cuatro membranas de impresión.- Colocar el dispositivo de citología de impresión tangencialmente en la conjuntiva. Presione suavemente el pulsador y manténgalo pulsado durante 2 - 3 s.
NOTA: El dispositivo viene con la membrana. La presión se libera automáticamente después de pulsar el botón. Se tarda sólo unos segundos en liberar la presión y retirar el dispositivo.
- Colocar el dispositivo de citología de impresión tangencialmente en la conjuntiva. Presione suavemente el pulsador y manténgalo pulsado durante 2 - 3 s.
- Liberar la membrana en un tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de medio de cultivo (medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% de suero bovino fetal(FBS) + 1% Penicilina-Estreptomicina (Pen Strep)) mediante un bisturí.
- Aísle las células de la membrana del dispositivo mediante raspado continuo durante aproximadamente 1 minuto con una punta de pipeta de 10 μl.
NOTA: El raspado se completa cuando la superficie de la membrana se vuelve irregular. El número de células de cada membrana es variable (100 - 500 células / membrana). Procesar las muestras dentro de 2 - 3 h de la colección.
2. Células de inmunofenotipificación por citometría de flujo
- Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar el medio. Resuspender el sedimento celular con 50 mu l de tampón de tinción de citometría de flujo (solución salina tamponada con fosfato (PBS) + albúmina de suero bovino al 0,05% (BSA)).
- Las células de coloración con un panel de anticuerpos ( por ejemplo , CD3 violeta brillante (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanine-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 ficoeritrina (PE) -A, CD45RO PE- Cy7) -A, y marca celular viva / muerta 7-ADD) a temperatura ambiente durante 20 - 30 min en eloscuro. Utilizar anticuerpos directamente del stock de acuerdo con el protocolo del fabricante.
NOTA: Para la concentración de anticuerpos, use 2,5 μL de CD3-BV510, 1,25 μL de CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD y 10 μL de CCR7-PE. Utilizar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) para titular las diferentes concentraciones de anticuerpos. Para la titulación, tome la concentración de anticuerpos mencionada en el protocolo del fabricante y utilice la mitad y una cuarta parte de la concentración recomendada. Utilice la concentración mínima de anticuerpos para evitar el derrame a otros canales de fluorocromo. Se observaron señales claras con las concentraciones de anticuerpos mencionadas. La compensación se realizó mediante pruebas PBMCs inicialmente de acuerdo con el protocolo mencionado en Williams et al . 20 Para la prueba, las PBMCs se incubaron con el mismo conjunto de anticuerpos usados aquí y se compensaron comparando las tinciones de anticuerpos individuales y múltiples. - Después de la incubación periOd, añadir 1 ml de tampón de tinción al tubo, mezclar bien y centrifugar a 450 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender las células en 200 μ l de buffer de tinción.
- Ejecutar muestras en una máquina de citometría de flujo.
- Antes de adquirir los datos, calibre los voltajes del canal del citómetro de flujo con perlas de configuración y seguimiento del citómetro (CS & T) para normalizar la adquisición de datos en días diferentes según las instrucciones del fabricante.
- Abra el software de recolección de datos de citometría de flujo, haga clic en "Configurar y QC" botón, elija el número de lote de cuentas CS & T correcto, cargue las cuentas y, a continuación, haga clic en el botón "Inicio".
- Resuspenda las células golpeando suavemente el tubo antes de cargar las muestras en la máquina. Abra el software de recopilación de datos y haga clic en "Vista previa". Cuando la tasa umbral es estable, haga clic en "Adquirir". Supervise el nivel de muestra y haga clic en "Detener" cuando se agoten las muestras.
NOTA: Adquirir 10.000 eventos por muestra. Después de adquirir 10.000 eventos, genere un diagrama de puntos SSC-A y FSC-A en la hoja de cálculo.- Haga clic en el botón "Polygon Gate" y dibuje una puerta (esto es P1) sobre todos los eventos con un valor FSC-A> 5 x 10 4 para excluir los desechos. Haga clic en el botón "Crear gráfico de puntos" para generar un nuevo gráfico de puntos, haga clic con el botón derecho en la mancha de puntos, seleccione "Propiedades" para abrir la ventana "Editor de gráficos" y luego elija "P1". Haga clic en el FSC-A en el eje x del gráfico de puntos P1, cambie a CD3-BV510. Dibuje una "Puerta de polígono" para elegir la población de CD3 + y denomínela "P2".
- Haga clic en el botón "Crear gráfico de puntos" para generar un nuevo gráfico de puntos, haga clic con el botón derecho en la mancha de puntos y seleccione "Propiedades" para abrir la ventana "Editor de gráficos". Haga clic en el FSC-A en el eje x del gráfico de puntos P2 y cambie a 7-AAD. Dibuje una '' Puerta de polígono '' para 7-AAD - población y elija '' P3 ''. P3 aquí es CD3 +Células vivas.
- Haga clic en el botón "Crear gráfico de puntos" para generar un nuevo gráfico de puntos, haga clic con el botón derecho en la mancha de puntos y seleccione "Propiedades" para abrir la ventana "Editor de gráficos". Haga clic en el CD3-BV510 en el eje x y CD4-APCH7 en el eje y del gráfico de puntos P3. Dibuje las puertas Rectángulo en los lados superior e inferior del cuadrante y elija '' P4 '' y '' P5 '', respectivamente. P4 es CD3 + CD4 + vivo y P5 es CD3 + CD4 - células T vivas.
- Haga clic en el botón "Crear gráfico de puntos" para generar un nuevo gráfico de puntos, haga clic con el botón derecho en la mancha de puntos y seleccione "Propiedades" para abrir la ventana "Editor de gráficos". Haga clic en el CD45RO PE-Cy7 en el eje x y CCR7-PE en el eje y de los gráficos P4 y P5. Dibuje '' Puerta Cuádruple '' en esta parcela de puntos.
NOTA: Los cuadrantes superior izquierdo, superior derecho, inferior derecho y inferior izquierdo son los siguientes: naïve, memoria central (T CM ), e(T EM ), células T de memoria efectora terminalmente diferenciada (T EMRA ), respectivamente.
- Antes de adquirir los datos, calibre los voltajes del canal del citómetro de flujo con perlas de configuración y seguimiento del citómetro (CS & T) para normalizar la adquisición de datos en días diferentes según las instrucciones del fabricante.
Representative Results
IC por este dispositivo clínico nos permitió aislar las células inmunes de la superficie ocular, manteniendo la superficie ocular intacta. La Figura 1 describe cómo se realizó la IC. Se marcan los diferentes sitios del ojo desde donde se recogieron las muestras. La Figura 2 muestra el resultado representativo de la citometría de flujo recogida de 10 controles sanos. Para el gating, use SSC y 7-AAD para distinguir entre células vivas y muertas. 7-AAD - las células se identifican como células vivas. Estas células vivas se caracterizan además por marcadores CD3 + y CD4 + . Además, las poblaciones CD4 + y CD4 - se caracterizaron cada una como Naïve, T EM , T CM y T EMRA con los marcadores CCR7 y CD45RO. Entre las células T CD3 + , predominan las células T de memoria efectoras en la superficie ocular humana. AntesXperimentos, también se ha demostrado que las células de memoria CD8 + son las principales poblaciones en las células T epitelial conjuntival entre los individuos sanos [ 20] . La Figura 3 muestra que las células T de memoria efectoras CD4 + y CD8 + (T EM y T EMRA ) son el subconjunto principal en la superficie ocular humana en 10 controles sanos estudiados. Cada población mencionada en la figura se notifica con su fenotipo marcador y sus nombres (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). Los números en rojo indican el porcentaje de la población. Los datos de esta figura se representan como media ± SEM
Figura 1: Recolección de muestras de CI de la superficie ocular por el dispositivo de citología de impresión. Se recogieron muestras del bulbo temporalComo se muestra.
Figura 2: Diagrama de gráficos de puntos usando citometría de flujo. Se seleccionaron células Live 7-AAD. Las células CD3 + fueron primero cerradas, y luego esta población se conectó a CD4 + y CD4 - subconjuntos. Se determinó la proporción de subconjuntos (CCR7 + CD45RO - ), memoria central (CCR7 + CD45RO + ) y memoria efectora (CCR7 - CD45RO + , CCR7 - CD45RO - ) con ayuda de marcadores CCR7 y CD45RO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
FFigura 3: Subtipos de células inmunes en células T CD4 + y CD8 + de superficie ocular humana sana. Distribución de subconjuntos conjuntivales CD4 + y CD8 + , memoria central (T CM ), y memoria efectora (T EM y T EMRA ) en controles humanos sanos; Cada punto de datos representa una media individual separada ± SEM mostrada. El porcentaje de la población está marcado como rojo por debajo del nombre de cada una de las poblaciones. El porcentaje total de la población es del 98%, debido a que la población de EMRA de CD4 + T no se incluyó en el diagrama de dispersión mencionado (modificado de Bose et al., 21 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Esta es una técnica fácil, rápida y menos invasiva que puede utilizarse en las clínicas ambulatorias para un perfil inmune relativamente rápido en contraste con las técnicas convencionales como raspado, frotamiento, pipeteado o papel de filtro absorbente 1 , 2 . Una variante de esta técnica ya se está utilizando en la investigación de configuración [ 22] . La aplicación futura de la metodología propuesta es para la estratificación de pacientes en ensayos clínicos con enfermedades oculares, especialmente aquellos que requieren inmunofenotipificación.
Un reto importante con esta técnica es el relativamente pocas células inmunitarias recuperadas después de la recolección de impresión y raspado. El número total de células T CD3 + recuperadas de cuatro impresiones por individuo varió de ~ 500 - 1.000 células. Las muestras oculares se lavaron antes del análisis de citometría de flujo durante un número mínimo de veces para evitar una pérdida adicional de célulasS. Los pasos críticos y desafíos que permanecen dentro del protocolo son la recolección eficiente de muestras oculares y el raspado adecuado de la membrana para lograr un mayor número de células. Sin embargo, es poco probable que esta limitación se oriente hacia ningún fenotipo inmune específico. La solución de problemas realizada aquí para maximizar el rendimiento de las células fue reducir el número de etapas de lavado después y antes de la incubación de anticuerpos.
Existen otras limitaciones al uso del IC. En pacientes con superficie ocular severamente queratinizada o fibrosada, como en el síndrome de Steven Johnson, el rendimiento celular puede ser incluso menor que en este estudio. La proporción de células inmunes puede cambiar si las muestras se almacenan en lugar de analizar el mismo día. Es difícil predecir si ciertos tipos de células son más resistentes al almacenamiento que otros. Estudios previos han informado niveles elevados de expresión de HLA-DR en las células epiteliales conjuntivales 23 , por lo que sería interPara evaluar la correlación entre HLA-DR y los niveles de células inmunes específicas. Las células inmunes también pueden estar asociadas con el nivel de expresión de quimiocinas. Estas cuestiones deben abordarse en futuros estudios.
Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Nandini Nallappan y Sharon Yeo por ayudar con los pasos técnicos. El estudio fue financiado por una subvención de arranque a KGC de Lee Kong Chian Escuela de Medicina de la Universidad Tecnológica de Nanyang y por un Senior Clinician Scientist Award del Ministerio de Salud de Singapur National Medical Research Council (NMRC) a LT (NMRC / CSA / 045/2012) y por una subvención de la NMRC y administrado por el Centro Nacional de Innovación en Salud a KGC y LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
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