Den udsatte normale okulære overflade består af hornhinde og bindehinden. Epitelceller, boblerceller og immunceller er til stede i bindehinden. Her beskrives en ikke-invasiv teknik med indtrykcytologi ved anvendelse af en indtrykcytologienhed og flowcytometri til analyse af immunceller i bindehinden.
Traditionelt studeres okular overfladecykologi med teknikker som spatelteknologi og børsteknologi. Problemet med disse teknikker er, at de kan fremkalde traumatiske læsioner på overfladen af øjet, som kan udvikle sig til ardannelse, øjenlågsdeformitet, lymfestamme mangel og i nogle tilfælde forårsage stort ubehag for subjektet. For at undgå disse kliniske problemer blev indtrykcytologi (IC) udviklet til diagnosticering af øje med tør øjne og senere neoplasi, atopisk sygdom, vernal keratoconjunctivitis og keratoconjunctivitis sicca. Typisk skærer klinikere manuelt filterpapirene i de krævede former og anvender disse på den okulære overflade. Her beskriver vi, hvordan man udfører IC ved hjælp af en kommercielt tilgængelig medicinsk enhed. Denne teknik forklares her efterfulgt af immunophenotyping ved hjælp af flowcytometri. Denne teknik kræver mindre manuel håndtering og forårsager mindre skade på den okulære overflade.
Impression cytology (IC) blev først udført i 1977 af Thatcher et al. 1 . De brugte en plastindtrykskive til at samle konjunktivceller fra patienter i stedet for andre tilgængelige teknikker, som f.eks. Skrabning, swabbing eller pipettering 1 . Den nuværende teknik i IC bruger et absorberende filterpapir 2 til at aftrykke bulbar og palpebral conjunctiva og samle det mest overfladiske lag af konjunktivalceller. Disse celler, der har nået deres sidste trin af differentiering, bliver løbende kaste i tårer 3 . Tre store populationer af celler findes i IC-prøver: epithelceller 4 , boblerceller 3 , 5 og mucosal-associeret lymfoidvæv, viz epithelium-associerede effektor-T-celler eller dendritiske celler 6 . Oculære overfladeceller i IC samPles kan analyseres ved mikroskopi, immunblotting og revers-transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) 7 . Flowcytometri er for nylig blevet anvendt til at analysere immunceller opsamlet ved at skrabe IC-membranen 8 . Interessant nok har IC 6 , 9 været anvendt til at evaluere mange okulære overflade sygdomme, herunder keratoconjunctivitis sicca, vitamin A-mangel, cicatricial pemphigoid, atopisk sygdom, overlegen limbisk keratokonjunctivitis, vernal keratoconjunctivitis og epithelial squamous metaplasi. IC er også blevet brugt til at evaluere virkningen af iført kontaktlinser, detektering af okulære overflademikrober og afprøvning af terapeutisk virkning og tolerance af terapeutiske interventioner i longitudinale studier 10 , 11 , 12 .
Den medicinske enhed (EyePrim) understøttes af en type polyEthersulfon (PES) 0,2 μm membran, som tidligere er valideret for teknikken til okulærtrykscytologi med flowcytometri (OSIC-flow) og åbner mulighed for at anvende langsgående prøveudtagning til at overvåge sygdomsprogression og respons på behandling ( fx den detaljerede Analyse af intraepitheliale leukocytter defineret som formodede sygdomsmarkører for progressiv conjunctival fibrose i slimhindepemphigoid) 13 . Tidlige forskere brugte autoklaverede PES-filtre, der krævede manuel indtryk. Som et resultat var udbyttet variabelt og brugerafhængigt. Fordelen ved denne medicinske enhed er brugervenlighed, standardiseret tryk (Pa eller N / m 2 ) og muliggør repeterbarhed, reproducerbarhed og konsistent cellulær genopretning. Denne teknik er nyttig i en klinisk klinik, fordi den er ikke-kirurgisk, nem at udføre og hurtig. Dette er en medicinsk udstyr i klasse I (steril) i henhold til direktivet 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Det kræver kunS aktuelle anæstesi under proceduren, hvilket sikrer vedligeholdelse af okularoverfladenes integritet. Efter IC kan celler behandles straks for flowcytometri. Desuden er det muligt for ikke-oftalmologi teknikere og sygeplejersker at blive uddannet til at prøve den okulære overflade.
På trods af forbedringen af IC over andre teknikker er der stadig flere udfordringer. For eksempel kan der være variation på grund af området for prøveudtagningen og regionale forskelle i bulbens conjunctiva afhængigt af IC'ens position. En anden kilde til variation skyldes anvendelsen af forskellige mængder tryk under IC. Andre metodologiske problemer involverer standardisering af cellebehandling: disse involverer varighed og fastgørelsesmetode og betingelserne for mulig opbevaring, som kan påvirke stabiliteten af det samplede materiale.
Det overordnede mål med denne teknik er at udvikle en metode til isolering af de okulære indtryksprover thaT er let at bruge, ikke-invasiv og kan anvendes til den immunologiske karakterisering af de kliniske prøver.
Dette er en nem, hurtig og mindre invasiv teknik, der kan bruges i klinikkerne til ekstremt hurtig immunprofilering i modsætning til de konventionelle teknikker som skrabning, sugning, pipettering eller absorberende filterpapir 1 , 2 . En variant af denne teknik anvendes allerede i forskningsindstillinger 22 . Den fremtidige anvendelse af den foreslåede metode er for patientstratifikation i kliniske forsøg med okulære sygdomme, især dem der kræver immunfenotyping.
En stor udfordring med denne teknik er de relativt få immunceller, der hentes efter indtryk indsamling og skrabning. Det samlede antal CD3 + T-celler genvundet fra fire visninger pr. Individ varierede fra ~ 500-1000 celler. De okulære prøver blev vasket før flowcytometrianalysen i et minimalt antal gange for at undgå yderligere tab af celles. Kritiske trin og udfordringer, der forbliver inden for protokollen, er effektiv samling af okulære prøver og korrekt skrabning af membranen for at opnå højere celleantal. Ikke desto mindre er denne begrænsning usandsynligt, at den forstyrrer nogen specifik immunfænotype. Fejlfinding udført her for at maksimere udbyttet af celler var at reducere antallet af vaske trin efter og før inkubation af antistoffer.
Der er andre begrænsninger for at bruge IC. Hos patienter med alvorligt keratiniseret eller fibroseret okulær overflade, såsom i Steven Johnsons syndrom, kan det cellulære udbytte være endnu mindre end det i denne undersøgelse. Andelen af immunceller kan ændres, hvis prøverne opbevares i stedet for analyseret samme dag. Det er svært at forudsige, om visse celletyper er mere modstandsdygtige over for opbevaring end andre. Tidligere undersøgelser har rapporteret forhøjede niveauer af HLA-DR-ekspression i conjunctivalepithelcellerne 23 , så det ville være interEstimerer korrelationen mellem HLA-DR og niveauer af specifikke immunceller. Immunkeller kan også være forbundet med ekspressionsniveauet af kemokiner. Disse spørgsmål bør behandles i fremtidige undersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Nandini Nallappan og Sharon Yeo for at hjælpe med de tekniske trin. Undersøgelsen blev finansieret af en Start-Up Grant til KGC fra Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University og af en Senior Clinician Scientist Award fra Singapore's Ministry of Health's National Medical Research Council (NMRC) til LT (NMRC / CSA / 045/2012) og ved et tilskud fra NMRC og administreret af National Health Innovation Center til KGC og LT (NHIC-12D-1409007).
Reagents | |||
anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
Pippetes | Eppendorf | NA | |
Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipments | |||
Keratograph 5M | Oculus | NA | |
Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
EyePrim | Opia Technologies | NA | |
FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Softwares | |||
GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
FACSVerse analysis software | BD | NA |