उजागर सामान्य ओक्यूलर सतह में कॉर्निया और कंजाक्तिवा होते हैं। उपकला कोशिकाओं, पिंड कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिका कंजाक्तिवा में मौजूद हैं। यहां, एक गैर-इनवेसिव, इंप्रेशन साइटोलॉजी की तकनीक, इम्प्रेशन साइोटिकॉजी डिवाइस का प्रयोग करके वर्णित की जाती है और नेत्रश्लेष्मला में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए फ्लो साइटमैट्री।
परंपरागत रूप से, ओक्यूलर सतह कोशिका विज्ञान का अध्ययन तकनीक तकनीक और ब्रश प्रौद्योगिकी जैसे तकनीकों के साथ किया जाता है। इन तकनीकों के साथ समस्या यह है कि वे आँख की सतह पर घावों को प्रभावित कर सकते हैं, जो झुर्री, पलक विरूपता, स्नायु स्टेम कोशिका की कमी और कुछ मामलों में प्रगति कर सकती है, इस विषय के लिए काफी परेशानी पैदा कर सकता है। इन नैदानिक समस्याओं से बचने के लिए, सूक्ष्म आंखों की बीमारी का निदान करने के लिए इंप्रेशन साइटोलॉजी (आईसी) विकसित किया गया था और बाद में नेपलाशिया, एपोटीक रोग, वर्नाल केरैटोकोनजंक्टिवैटिस और केरैटोकोनजंक्टिविटिस सिसा। आमतौर पर, चिकित्सक मैन्युअल रूप से आवश्यक कागजात में फिल्टर पेपर काटते हैं और यह ओक्यूलर सतह पर लागू होते हैं। यहां, हम यह वर्णन करते हैं कि वाणिज्यिक तौर पर उपलब्ध चिकित्सा उपकरण का उपयोग करके आईसी कैसे करें। इस तकनीक को यहाँ समझाया गया है जो फ्लो साइटोमेट्री द्वारा इम्युनोफेनोटाइपिंग है। इस तकनीक को कम मैनुअल से निपटने की आवश्यकता है और ओक्यूलर सतह को कम चोट का कारण बनता है।
इंप्रेशन साइटोलॉजी (आईसी) सबसे पहले थैचर एट अल 1 द्वारा 1 9 77 में किया गया था । वे उस समय अन्य तकनीकों के बजाय मरीजों से कंजन्क्चुअल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक प्लास्टिक इंप्रेशन डिस्क का इस्तेमाल करते थे जैसे स्क्रैपिंग, स्बबिंग या 1 pipetting आईसी की वर्तमान तकनीक एक शोषक फिल्टर पेपर 2 का प्रयोग करती है ताकि वह बल्ब और पेप्ब्रल कंजाक्तिवा को छापे और कंज़ेक्टिवल कोशिकाओं की सबसे सतही परत एकत्र कर सके। इन कोशिकाओं, जो अपने अंतर के अंतिम चरण तक पहुंच गए हैं, लगातार 3 आँसू में बहाए जाते हैं। आईसी नमूनों में कोशिकाओं की तीन प्रमुख आबादी पाए जाते हैं: उपकला कोशिकाएं 4 , कोशिका कोशिकाओं 3 , 5 , और श्लेष्म-जुड़े लिम्फोइड ऊतक जैसे एपिथेलियम से जुड़े प्रभावकारी टी कोशिकाएं या वृक्ष के समान कोशिकाएं 6 आईसी सैम में ऊपरी सतह कोशिकाएंPles माइक्रोस्कोपी, प्रतिरक्षा-धुंधला और रिवर्स-ट्रांस्क्रिप्टेज़ पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) 7 द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। आईसी झिल्ली 8 को स्क्रैप करके एकत्रित प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए फ्लो साइटमैट्री हाल ही में उपयोग किया गया है दिलचस्प है, आईसी 6 , 9 का उपयोग कई ओकुलर सतह रोगों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है जिनमें केराटोकोएंजेक्टिवैटिस सिका, विटामिन ए की कमी, सिट्रेटिक एपीपी, एपोटीक रोग, बेहतर लिम्बिक केरैटोकोनजेंटिवैटिस, वर्नाल केरैटोकोनजंक्टिवैटिस, और उपकला स्क्वैमस मेटाप्लासिआ शामिल हैं। आईसी का संपर्क लेंस पहनने, ओक्यूलर सतह रोगाणुओं का पता लगाने, और अनुप्रस्थ अध्ययन 10 , 11 , 12 में चिकित्सीय हस्तक्षेप की चिकित्सीय प्रभावकारिता और सहनशीलता का परीक्षण करने के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया है।
चिकित्सा उपकरण (आईप्रीम) को एक प्रकार की पाली द्वारा समर्थित किया गया हैएथरसफॉफ़ोन (पीईएस) 0.2-माइग्रो झिल्ली, जिसे प्रवाह कोशिकामी (ओएसआईसी-प्रवाह) के साथ ओक्यूलर इंप्रेशन साइटोलॉजी की तकनीक के लिए पहले से मान्य किया गया है और रोग की प्रगति और उपचार के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए अनुदैर्ध्य नमूने का उपयोग करने के अवसर खोलता है ( जैसे , विस्तृत इंटरेपिटेलियल ल्यूकोसाइट्स का विश्लेषण, श्लेष्म झिल्ली पेम्फीगॉइड में प्रगतिशील कंजन्क्चुअली फाइब्रोसिस के लिए पोटीन बीमारी मार्कर के रूप में परिभाषित) 13 शुरुआती शोधकर्ताओं ने ऑटोक्लेवेड पीईएस फिल्टर का उपयोग किया था जिनके लिए मैन्युअल इंप्रेशन आवश्यक था। नतीजतन, उपज चर और उपयोगकर्ता निर्भर था। इस चिकित्सा उपकरण का लाभ उपयोग, मानकीकृत दबाव (पीए या एन / एम 2 ) में आसानी है, और दोहराव, पुनरुत्पादन, और सुसंगत सेलुलर वसूली को सक्षम करता है। यह तकनीक आउट-रोगी क्लिनिक में उपयोगी है क्योंकि यह गैर-सर्जिकल, आसान-प्रदर्शन और तेज़ है। निर्देश 9 93/42 / सीईई, सीई 04 99 (एसएनसीएच) के अनुसार यह एक कक्षा 1 (बाँझ) चिकित्सा उपकरण है। यह केवल आवश्यकता होती हैप्रक्रिया के दौरान सामयिक संज्ञाहरण, जो ओक्यूलर सतह की अखंडता के रखरखाव को सुनिश्चित करता है। आईसी के बाद, प्रवाह कोशिकामितीय के लिए कोशिकाओं को तुरंत संसाधित किया जा सकता है। इसके अलावा, गैर-नेत्र विज्ञान तकनीशियनों और नर्सों को ओक्यूलर सतह का नमूना करने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है।
अन्य तकनीकों पर आईसी के सुधार के बावजूद, कई चुनौतियां बनी रहती हैं उदाहरण के लिए, आईसी की स्थिति के आधार पर बल्ब कंज़ुन्तुवा में नमूनाकरण और क्षेत्रीय मतभेदों के क्षेत्र में भिन्नता हो सकती है विविधता का एक अन्य स्रोत आईसी के दौरान विभिन्न मात्रा में दबाव के आवेदन के कारण होता है अन्य विधि संबंधी मुद्दों में सेल प्रसंस्करण के मानकीकरण शामिल होते हैं: इनमें अवधि और निर्धारण की विधि और संभावित भंडारण की स्थिति शामिल होती है, जो नमूनाकृत सामग्री की स्थिरता को प्रभावित कर सकती है।
इस तकनीक का समग्र लक्ष्य ओकुलर छाप के नमूने था कि अलगाव की एक विधि विकसित करना हैटी उपयोग करने में आसान है, गैर-इनवेसिव और क्लिनिकल नमूनों के प्रतिरक्षाविज्ञानी लक्षण वर्णन पर लागू किया जा सकता है।
यह एक आसान, त्वरित और कम आक्रामक तकनीक है, जिसे पारंपरिक रूप से स्क्रैपिंग, स्विब्बिंग, पिपेटिंग या शोषक फिल्टर पेपर 1 , 2 जैसे परंपरागत तकनीकों के विपरीत अपेक्षाकृत तेज प्रतिरक्षा रूपरेखा के लिए आउट-मरीज क्लीनिक में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तकनीक का एक रूप पहले से ही अनुसंधान सेटिंग्स 22 में इस्तेमाल किया जा रहा है । प्रस्तावित कार्यप्रणाली के भविष्य के आवेदन, नेत्र रोगों के साथ नैदानिक परीक्षणों में रोगी स्तरीकरण के लिए है, विशेषकर उन लोगों को जो इम्यूनोफेनोटाइपिंग की आवश्यकता होती है।
इस तकनीक के साथ एक बड़ी चुनौती इंप्रेशन संग्रह और स्क्रैपिंग के बाद प्राप्त अपेक्षाकृत कम प्रतिरक्षा कोशिकाओं है। सीडी 3 + टी कोशिकाओं की कुल संख्या ~ 500 – 1,000 कोशिकाओं से प्रति व्यक्ति अलग-अलग चार इंप्रेशन से बरामद हुई। सेल के आगे नुकसान से बचने के लिए कम समय के लिए फ्लो साइमेट्री विश्लेषण से पहले ओक्यूलर के नमूने धोए गए थेरों। प्रोटोकॉल के भीतर बने महत्वपूर्ण कदम और चुनौतियां, उच्च सेल नंबर प्राप्त करने के लिए ओकुलर नमूनों का समुचित संग्रह और झिल्ली के उचित स्क्रैपिंग। फिर भी, यह सीमा किसी विशिष्ट प्रतिरक्षा फेनोटाइप के प्रति पूर्वाग्रह की संभावना नहीं है। कोशिकाओं की पैदावार को अधिकतम करने के लिए यहां पर किए गए समस्या निवारण एंटीबॉडी के ऊष्मायन के बाद और पहले धोने के कदमों को कम करना था।
आईसी का उपयोग करने के लिए अन्य सीमाएँ हैं स्टीवन जॉन्सन सिंड्रोम जैसे गंभीर रूप से केराटाइज्ड या फाइब्रोज्ड ओक्यूलर सतह वाले रोगियों में, सेल्यूलर उपज इस अध्ययन से भी कम हो सकता है। प्रति दिन प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अनुपात बदल सकता है यदि नमूने उसी दिन विश्लेषण के बजाय संग्रहीत किए जाते हैं। यह भविष्यवाणी करना मुश्किल है कि यदि कुछ सेल प्रकार अन्य की तुलना में भंडारण के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं पिछला अध्ययनों ने कंजुक्यूप्टिव एपिथेलियल कोशिकाओं 23 में एचएलए-डीआर अभिव्यक्ति के ऊंचा स्तर की सूचना दी है, इसलिए यह अंतर होगाएचएलए-डीआर और विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्तर के बीच के संबंधों का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिरक्षी कोशिकाओं को भी रसायन के अभिव्यक्ति के स्तर से जोड़ा जा सकता है। इन मुद्दों को भविष्य के अध्ययनों में संबोधित किया जाना चाहिए
The authors have nothing to disclose.
तकनीकी कदमों के साथ मदद करने के लिए लेखक नंदिनी नल्लप्पन और शेरोन येओ को धन्यवाद देना चाहते हैं। स्टडी-अप ग्रांट से लीग कोंग चियन स्कूल ऑफ मेडीसिन, नानयांग टेक्नोलॉजीकल यूनिवर्सिटी और सिंगापुर मिनिस्ट्री ऑफ हेल्थ के नेशनल मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एनएमआरसी) से लेफ्टिनेंट (एनएमआरसी / सीएसए / एनएएमआरसी) से अध्ययन के लिए वित्त पोषित किया गया था। 045/2012) और एनएमआरसी से अनुदान के द्वारा और केजीसी और एलटी (एनएचआईसी -12 डी-140 9 007) के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य नवाचार केंद्र द्वारा प्रशासित।
Reagents | |||
anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
Pippetes | Eppendorf | NA | |
Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipments | |||
Keratograph 5M | Oculus | NA | |
Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
EyePrim | Opia Technologies | NA | |
FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Softwares | |||
GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
FACSVerse analysis software | BD | NA |