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Immunology and Infection

결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법

doi: 10.3791/55591 Published: July 5, 2017

Summary

노출 된 정상적인 안구 표면은 각막과 결막으로 이루어져 있습니다. 상피 세포, 배 세포 및 면역 세포가 결막에 존재한다. 여기, 노출 세포학의 비 침습적 기술은 인상 세포학 장치 및 결막의 면역 세포를 분석하는 유동 세포 계측법을 사용하여 설명합니다.

Abstract

전통적으로 안구 표면 세포학은 주걱 기술 및 브러시 기술과 같은 기술로 연구됩니다. 이 기술의 문제점은 눈의 표면에 외상성 병변을 유발할 수 있다는 것입니다. 외상성 병변은 흉터, 눈꺼풀의 기형, 윤부 줄기 세포 결핍으로 진행될 수 있으며 경우에 따라 피험자에게 커다란 불편 함을 유발할 수 있습니다. 이러한 임상 적 문제를 피하기 위해 안구 건조증과 신 생물, 아토피 성 질환, 춘추 각 결막염 및 각 결막염을 진단하기위한 인상 세포학 (IC)이 개발되었습니다. 전형적으로, 임상의는 수작업으로 여과지를 필요한 모양으로 자르고이를 안구 표면에 적용합니다. 여기서는 시중에서 판매되는 의료 기기를 사용하여 IC를 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기법은 유동 세포 계측법에 의한 면역 표현형 분석이 뒤 따릅니다. 이 기술은 수동 조작을 덜 필요로하고 안구 표면 손상을 줄입니다.

Introduction

Impression cytology (IC)는 Thatcher et al .에 의해 1977 년에 처음 수행되었다 . 그들은 스크래핑, 스왑 또는 피펫 팅과 같은 그 당시 사용 가능한 다른 기술 대신 환자로부터 결막 세포를 수집하기 위해 플라스틱 인상 디스크를 사용했습니다 1 . IC의 현재 기술은 구와 눈의 결막을 각인시키고 결막 세포의 가장 표면층을 모으기 위해 흡수성 여과지 2 를 사용합니다. 분화의 최종 단계에 도달 한이 세포들은 계속 눈물을 흘립니다 3 . 상피 세포 4 , 상 세포 3 , 5 및 점막 관련 림프 조직 - 상피 - 관련 이펙터 T 세포 또는 수지상 세포 6의 세 가지 주요 개체군이 IC 표본에서 발견됩니다. IC 칩 표면의 안구 세포ples은 현미경 검사, 면역 블 랏팅 및 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)으로 분석 할 수 있습니다 7 . 유동 세포 계측법은 최근에 IC 멤브레인을 긁어서 수집 한 면역 세포를 분석하는데 사용되었습니다 8 . 흥미롭게도 IC6,9는 점막 각 결막염, 비타민 A 결핍, 간질 성 천포창, 아토피 성 질환, 상연 성 각 결막염, 춘추 각 결막염 및 상피 편평 상피화를 포함한 많은 안구 질환을 평가하는데 사용되어왔다. IC는 또한 콘택트 렌즈 착용, 안구 표면 미생물 검출, 종단 연구 10 , 11 , 12의 치료 효과 및 내성 시험에 미치는 영향을 평가하는 데 사용되었습니다.

의료 기기 (EyePrim)는 일종의 폴리이전에 유동 세포 계측법 (OSIC-flow)으로 안과 인상 세포학 기술에 대해 검증 된 종전 샘플링을 사용하여 질병 진행 및 치료에 대한 반응을 모니터 할 수있는 기회를 열어주는 PES 0.2 μm 멤브레인 점막 유 천포창에서 진행성 결막 섬유증의 추정 질환 마커로 정의 된 상피 세포 백혈구 분석 13) . 초기 연구자들은 수동 인상이 필요한 고압 증기 멸균 된 PES 필터를 사용했습니다. 결과적으로 생산량은 가변적이었고 사용자에 따라 결정되었습니다. 이 의료 기기의 장점은 사용 편의성, 표준화 된 압력 (Pa 또는 N / m 2 )이며 반복성, 재현성 및 일관된 세포 재생을 가능하게합니다. 이 기술은 비 외과 수술이며, 수행하기 쉽고 빠르기 때문에 외래 환자 클리닉에서 유용합니다. 이 지침은 지침 93 / 42 / CEE, CE 0499 (SNCH)에 따라 Class I (무균) 의료 장비입니다. 필요한 것만이는 안구 표면의 무결성 유지를 보장하는 시술 중의 국소 마취이다. IC 이후에, 세포는 유동 세포 계측법을 위해 즉시 처리 될 수 있습니다. 또한, 비 안과 기술자 및 간호사가 안구 표면을 샘플링하도록 훈련받을 수 있습니다.

다른 기술에 비해 IC의 향상에도 불구하고 몇 가지 과제가 남아 있습니다. 예를 들어, IC의 위치에 따라 샘플링 영역 및 구 결막에서 지역적 차이로 인해 변동이있을 수 있습니다. 변동의 또 다른 원인은 IC 동안 다양한 양의 압력을 가하기 때문입니다. 다른 방법 론적 쟁점은 세포 처리 표준화와 관련이있다. 여기에는 지속 기간과 고정 방법, 시료 채취 된 물질의 안정성에 영향을 줄 수있는 저장 조건이 포함된다.

이 기술의 전반적인 목표는 안구 인상 샘플을 고립시키는 방법을 개발하는 것입니다.t는 사용하기 쉽고 비 침습적이며 임상 샘플의 면역 학적 특성 분석에 적용 할 수 있습니다.

Protocol

이 연구에 사용 된 모든 안구 샘플은 SingHealth Centralized Institutional Review Board와 싱가포르 남양 기술 대학교 제도 심사위원회의 승인을받은 싱가포르 국립 안과 센터의 Dry Eye Clinic에서 수집했습니다.

참고 : 피험자는 IC를 실시하기 전에 염증 정도와 눈물 기능 장애의 중증도를 평가하기 위해 임상 검사를 받았다. 임상 시험은 진단 장비, Schirmer 's test 17 , SPEED (Standard Patient Evaluation of Eye Dryness) 18 설문지, 각막 절개술 (SPEED) 설문 18을 사용하여 비 침습적 눈물 방울 차단 시간 (NI-TBUT) 14 및 결막 충혈 염색 19 .

1. IC에 의한 안구 샘플 채취

  1. 임상 상태의 결정 후, 마취참가자의 눈은 상지 구 및 결막에 1 ~ 2 방울의 국소 마취제 인 염산 프로 팔라 카인 (proparacaine hydrochloride)을 적용하여 관찰 하였다. 마취의 쑤시는 감각이 지치기까지 4 ~ 5 분 동안 기다리십시오.
  2. 두 가지 인상 세포학 장치로 비강 결막 결막에서 샘플을 수집합니다.
    참고 : 두 개의 노출 샘플을 수집하는 데 하나의 장치가 사용됩니다. 여기서는 두 개의 장치를 사용하여 4 개의 임프레션 멤브레인을 수집했습니다.
    1. 결막에 인상 세포학 장치를 접선 방향으로 위치시킵니다. 누름 단추를 부드럽게 누르고 2 - 3 초 동안 누릅니다.
      참고 : 장치는 멤브레인과 함께 제공됩니다. 버튼을 누르면 압력이 자동으로 해제됩니다. 압력을 해제하고 장치를 제거하는 데 단지 몇 초가 걸립니다.
  3. 막 1 ML 문화 미디어 (로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) + 10 % 태아 소 혈청이 들어있는 microcentrifuge 튜브로 막을 출시(FBS) + 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 스트렙토 마이신)
  4. 10 μL 피펫 팁으로 약 1 분 동안 지속적으로 긁어 냄으로써 장치의 막에서 세포를 분리합니다.
    참고 : 멤브레인 표면이 고르지 않으면 긁힘이 완료됩니다. 각 막으로부터의 세포 수는 가변적이다 (100 - 500 세포 / 막). 수집 2 ~ 3 시간 이내에 샘플을 처리하십시오.

2. 유동 세포 계측법에 의한 세포의 면역 표현형 측정

  1. 매체를 제거 실온에서 5 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 유동 세포 계측법 완충액 (인산 완충 식염수 (PBS) + 0.05 % 소 혈청 알부민 (BSA)) 50 μL로 세포 펠렛을 Resuspend.
  2. 항체 ( 예 : CD3 브릴리언트 바이올렛 (BV) 510 (UCHT1), CD4 알로 피코시 아닌 -H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 피코 에리 트린 (PE) -A, CD45RO PE 시아닌 7 Cy7) -A, live / dead cell mark 7-ADD)를 실온에서 20-30 분 동안어두운. 제조업체의 프로토콜에 따라 항체를 직접 사용하십시오.
    참고 : 항체 농도는 CD3-BV510 2.5 μL, CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD 1.25 μL 및 CCR7-PE 10 μL를 사용하십시오. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 사용하여 다양한 농도의 항체를 적정합니다. 적정을 위해 제조자의 프로토콜에 언급 된 항체 농도를 취하고 권장 농도의 1/2을 사용하십시오. 다른 형광 색 채널로 넘치지 않도록 항체의 최소 농도를 사용하십시오. 언급 된 항체 농도에서 명확한 신호가 관찰되었습니다. 보정은 초기에 Williams et al .에서 언급 된 프로토콜에 따라 PBMC를 시험함으로써 수행되었다. 시험을 위해 PBMC를 여기에 사용 된 동일한 항체 세트와 함께 배양하고 단일 및 다중 항체 얼룩을 비교하여 보상했습니다.
  3. 부화 후od, 튜브에 얼룩 버퍼 1 ML을 추가 잘 혼합하고 실온에서 5 분 450 XG에서 원심 분리기. 얼룩 버퍼 200 μL에 Resuspend 세포.
  4. 플로우 cytometry 기계에서 샘플을 실행합니다.
    1. 데이터를 수집하기 전에 제조 업체의 지침에 따라 다른 일에 데이터 수집을 정상화하기 위해 cytometer 설정 및 추적 (CS & T) 비즈와 함께 흐름 cytometer의 채널 전압을 보정.
      1. 유동 세포 계측법 데이터 수집 소프트웨어를 열고 "Set up & QC"버튼을 클릭하고 올바른 CS & T 비드 로트 번호를 선택하고 비즈를로드 한 다음 "시작"버튼을 클릭하십시오.
    2. 기계에 샘플을로드하기 전에 부드럽게 튜브를 두드려 세포를 Resuspend. 데이터 수집 소프트웨어를 열고 "미리보기"를 클릭하십시오. 임계 값 속도가 안정되면 "획득"을 클릭하십시오. 샘플 레벨을 모니터하고 샘플이 부족하면 "중지"를 클릭하십시오.
      참고 : 샘플 당 10,000 개의 이벤트를 확보하십시오. 10,000 이벤트를 획득 한 후, 워크 시트에 SSC-A 및 FSC-A 도트 플롯을 생성하십시오.
      1. "Polygon Gate"버튼을 클릭하고 파편을 제외하기 위해 FSC-A 값> 5 x 10 4 인 모든 이벤트에 게이트 (P1 임)를 그립니다. "도트 플롯 만들기"버튼을 클릭하여 새 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 "속성"을 선택하여 "플롯 편집기"창을 연 다음 "P1"을 선택하십시오. P1 도트 플롯의 X 축에서 FSC-A를 클릭하고 CD3-BV510으로 변경하십시오. '다각형 게이트'를 그려 CD3 + 인구를 선택하고 이름을 'P2'로 지정하십시오.
      2. "도트 플롯 만들기"버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 "속성"을 선택하여 "플롯 편집기"창을 엽니 다. P2 도트 플롯의 x 축에있는 FSC-A를 클릭하고 7-AAD로 변경하십시오. 7-AAD 인구를위한 '다각형 게이트'를 그리고 'P3'을 선택하십시오. 여기서 P3은 CD3 +살아있는 세포.
      3. "도트 플롯 만들기"버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 "속성"을 선택하여 "플롯 편집기"창을 엽니 다. X 축에서 CD3-BV510을 클릭하고 P3 도트 플롯의 y 축에서 CD4-APCH7을 클릭합니다. 직사각형 그리기 사분면의 위쪽과 아래쪽에 각각 'P4'와 'P5'를 선택하십시오. P4는 라이브 CD3 + CD4 + 이고 P5는 라이브 CD3 + CD4 - T 세포입니다.
      4. "도트 플롯 만들기"버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 "속성"을 선택하여 "플롯 편집기"창을 엽니 다. X 축에서 CD45RO PE-Cy7을 클릭하고 P4 및 P5 플롯의 y 축에서 CCR7-PE를 클릭합니다. 이 점 그림에 '쿼드 게이트'를 그립니다.
        참고 : 여기 왼쪽 위, 오른쪽 위, 오른쪽 아래 및 오른쪽 아래 사분면은 순진한 중앙 메모리 (T CM ), 전자(T EM ), 최종 분화 된 이펙터 메모리 (T EMRA ) T 세포를 포함한다.

Representative Results

이 임상 장치에 의한 IC를 사용하여 안구 표면을 손상시키지 않으면 서 안구 표면 면역 세포를 분리 할 수있었습니다. 그림 1 은 IC가 수행 된 방법을 설명합니다. 샘플이 수집 된 곳과 다른 눈의 부위가 표시됩니다. 그림 2 는 10 건강한 컨트롤에서 수집 한 유동 세포 계측법의 대표 결과를 보여줍니다. 게이팅을 위해서는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 SSC와 7-AAD를 사용하십시오. 7-AAD - 세포는 살아있는 세포로 확인됩니다. 이 생균은 CD3 + 및 CD4 + 마커에 의해 특성화됩니다. 또한 CD4 + 및 CD4 - 개체군은 각각 CCR7 및 CD45RO 마커가있는 Naive, T EM , T CM 및 T EMRA 로 특징 지어졌습니다. CD3 + T 세포 중에는 인간의 안구 표면에서 이펙터 기억 T 세포가 우세합니다. 이전 e에서또한, CD8 + 기억 세포가 건강한 개체 중 결막 상피 세포의 주요 개체군임을 보여 주었다. 그림 3 은 CD4 + 및 CD8 + 이펙터 메모리 T 세포 (T EM 및 T EMRA )가 연구 된 건강한 대조군 10 명에서 인간 안구 표면의 주요 하위 집합임을 보여줍니다. 그림에 언급 된 각 집단은 그들의 마커 표현형 및 이름 (Naïve, T CM , T EM , T EMRA )으로 통보됩니다. 빨간색 숫자는 인구의 비율을 나타냅니다. 이 도면의 데이터는 평균 ± SEM

그림 1
그림 1 : 인상 세포학 장치에 의한 안구 표면에서 IC 샘플 수집. 샘플은 측두엽으로부터 수집되었다ar 영역을 갖는다.

그림 2
그림 2 : 유동 세포 계측법을 이용한 도트 플롯 그래프. 라이브 7-AAD - 세포가 선택되었습니다. CD3 + 세포는 먼저 문이 열리고,이 집단은 CD4 + 및 CD4 - 서브 세트로 게이팅되었다. 순진 (CCR7 + CD45RO - ), 중앙 기억 (CCR7 + CD45RO + ) 및 이펙터 메모리 (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) 부분의 비율은 CCR7 및 CD45RO 마커의 도움을 받아 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
에프그림 3 : 건강한 인간 안구 표면의 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 면역 세포 하위 유형. 건강한 사람 대조군에서 결막 내 CD4 + 및 CD8 + naive, central memory (T CM ) 및 effector memory (T EM 및 T EMRA ) 하위 집합의 분포 ; 각 데이터 포인트는 별도의 개별 평균 ± SEM을 나타냅니다. 인구의 비율은 각 인구의 이름 아래에 빨간색으로 표시됩니다. CD4 + T EMRA 인구가 언급 된 산점도에 포함되지 않았기 때문에 전체 인구 비율은 98 %이다 (Bose 21 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이는 스크래핑, 스왑 핑, 피펫 팅 또는 흡착 여과지 1 , 2 와 같은 기존 기술과 비교하여 비교적 빠른 면역 프로파일 링을 위해 외래 진료소에서 사용할 수있는 쉽고 빠르며 덜 침습적 인 기술입니다. 이 기법의 변형은 연구 설정에서 이미 사용되고 있습니다 22 . 향후 제안 된 방법론의 적용은 안구 질환, 특히 면역 표현형을 필요로하는 임상 시험에서 환자 층화에 적용됩니다.

이 기술의 주요 문제점은 인상 채취 및 스크래핑 후에 회수되는 비교적 적은 면역 세포입니다. 개체 당 4 번의 노출에서 회복 된 CD3 + T 세포의 총 수는 ~ 500 ~ 1,000 개의 세포에서 다양합니다. 안구 샘플은 세포의 추가 손실을 피하기 위해 최소 횟수 동안 유세포 분석을하기 전에 세척 하였다에스. 프로토콜 내에 남아있는 중요한 단계와 과제는 높은 세포 수를 달성하기 위해 눈 샘플을 효율적으로 수집하고 멤브레인을 적절히 스크래핑하는 것입니다. 그럼에도 불구하고이 제한은 특정 면역 표현형에 편향되지는 않을 것입니다. 세포 수율을 극대화하기 위해 여기에서 수행 된 문제 해결은 항체 배양 후 및 배양 전 세척 단계 수를 줄이는 것이 었습니다.

IC 사용에는 다른 제한 사항이 있습니다. 스티븐 존슨 (Steven Johnson) 증후군과 같이 심하게 각화되거나 섬유화 된 안구 표면을 가진 환자에서 세포 수율은 본 연구에서보다 낮을 수 있습니다. 같은 날 분석하지 않고 샘플을 보관하면 면역 세포의 비율이 달라질 수 있습니다. 특정 세포 유형이 다른 세포 유형보다 저장에 내성이 있는지를 예측하는 것은 어렵습니다. 이전 연구에서 결막 상피 세포의 HLA-DR 발현이 증가한 것으로보고되었으므로HLA-DR과 특정 면역 세포의 수준 사이의 상관 관계를 평가하기 위해 esting. 면역 세포는 또한 케모카인의 발현 수준과 관련 될 수있다. 이러한 문제는 향후 연구에서 다루어 져야한다.

Disclosures

저자는 경쟁적인 금융 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자는 기술 단계를 돕는 Nandini Nallappan 및 Sharon Yeo에게 감사드립니다. 이 연구는 이공천 (Lee Kong Chian) 의대, 남양 공대 (Nanyang Technological University)의 KGC 창업 보조금 및 싱가포르 보건 성 국립 의료 연구위원회 (National Medical Research Council, NMRC)의 고위 임상 의학자 상 (Northern Clinician Scientist Award)의 LT (NMRC / CSA / 045 / 2012), NMRC의 보조금으로 KGC와 LT (NHIC-12D-1409007)에 국가 보건 혁신 센터 (National Health Innovation Center)가 관리한다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
anti-human CD3 BV510 BD Biosciences 563109
anti-human CD4 APCH7 BD Biosciences 641398
anti-human CD45RO PECy7 BD Biosciences 337168
7-AAD solution BD Biosciences 555816
anti-human CCR7 PE BD Biosciences 552176
Pippetes Eppendorf NA
Local Anaesthesia Alcaine NA
Fluorescein sodium solution Bausch & Lomb U.K Limited NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Keratograph 5M Oculus NA
Slit lamp BioMicroscope Haag Streit BM900
EyePrim Opia Technologies NA
FACS Verse BD BioSciences NA
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
GraphPad 6.0 Prism NA
FACSVerse analysis software BD NA

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References

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결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법
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Bose, T., Hou, A., Lee, R., Tong, L., Chandy, K. G. A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva. J. Vis. Exp. (125), e55591, doi:10.3791/55591 (2017).More

Bose, T., Hou, A., Lee, R., Tong, L., Chandy, K. G. A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva. J. Vis. Exp. (125), e55591, doi:10.3791/55591 (2017).

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