Summary
노출 된 정상적인 안구 표면은 각막과 결막으로 이루어져 있습니다. 상피 세포, 배 세포 및 면역 세포가 결막에 존재한다. 여기, 노출 세포학의 비 침습적 기술은 인상 세포학 장치 및 결막의 면역 세포를 분석하는 유동 세포 계측법을 사용하여 설명합니다.
Abstract
전통적으로 안구 표면 세포학은 주걱 기술 및 브러시 기술과 같은 기술로 연구됩니다. 이 기술의 문제점은 눈의 표면에 외상성 병변을 유발할 수 있다는 것입니다. 외상성 병변은 흉터, 눈꺼풀의 기형, 윤부 줄기 세포 결핍으로 진행될 수 있으며 경우에 따라 피험자에게 커다란 불편 함을 유발할 수 있습니다. 이러한 임상 적 문제를 피하기 위해 안구 건조증과 신 생물, 아토피 성 질환, 춘추 각 결막염 및 각 결막염을 진단하기위한 인상 세포학 (IC)이 개발되었습니다. 전형적으로, 임상의는 수작업으로 여과지를 필요한 모양으로 자르고이를 안구 표면에 적용합니다. 여기서는 시중에서 판매되는 의료 기기를 사용하여 IC를 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기법은 유동 세포 계측법에 의한 면역 표현형 분석이 뒤 따릅니다. 이 기술은 수동 조작을 덜 필요로하고 안구 표면 손상을 줄입니다.
Introduction
Impression cytology (IC)는 Thatcher et al .에 의해 1977 년에 처음 수행되었다 . 그들은 스크래핑, 스왑 또는 피펫 팅과 같은 그 당시 사용 가능한 다른 기술 대신 환자로부터 결막 세포를 수집하기 위해 플라스틱 인상 디스크를 사용했습니다 1 . IC의 현재 기술은 구와 눈의 결막을 각인시키고 결막 세포의 가장 표면층을 모으기 위해 흡수성 여과지 2 를 사용합니다. 분화의 최종 단계에 도달 한이 세포들은 계속 눈물을 흘립니다 3 . 상피 세포 4 , 상 세포 3 , 5 및 점막 관련 림프 조직 - 상피 - 관련 이펙터 T 세포 또는 수지상 세포 6의 세 가지 주요 개체군이 IC 표본에서 발견됩니다. IC 칩 표면의 안구 세포ples은 현미경 검사, 면역 블 랏팅 및 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)으로 분석 할 수 있습니다 7 . 유동 세포 계측법은 최근에 IC 멤브레인을 긁어서 수집 한 면역 세포를 분석하는데 사용되었습니다 8 . 흥미롭게도 IC6,9는 점막 각 결막염, 비타민 A 결핍, 간질 성 천포창, 아토피 성 질환, 상연 성 각 결막염, 춘추 각 결막염 및 상피 편평 상피화를 포함한 많은 안구 질환을 평가하는데 사용되어왔다. IC는 또한 콘택트 렌즈 착용, 안구 표면 미생물 검출, 종단 연구 10 , 11 , 12의 치료 효과 및 내성 시험에 미치는 영향을 평가하는 데 사용되었습니다.
의료 기기 (EyePrim)는 일종의 폴리이전에 유동 세포 계측법 (OSIC-flow)으로 안과 인상 세포학 기술에 대해 검증 된 종전 샘플링을 사용하여 질병 진행 및 치료에 대한 반응을 모니터 할 수있는 기회를 열어주는 PES 0.2 μm 멤브레인 점막 유 천포창에서 진행성 결막 섬유증의 추정 질환 마커로 정의 된 상피 세포 백혈구 분석 13) . 초기 연구자들은 수동 인상이 필요한 고압 증기 멸균 된 PES 필터를 사용했습니다. 결과적으로 생산량은 가변적이었고 사용자에 따라 결정되었습니다. 이 의료 기기의 장점은 사용 편의성, 표준화 된 압력 (Pa 또는 N / m 2 )이며 반복성, 재현성 및 일관된 세포 재생을 가능하게합니다. 이 기술은 비 외과 수술이며, 수행하기 쉽고 빠르기 때문에 외래 환자 클리닉에서 유용합니다. 이 지침은 지침 93 / 42 / CEE, CE 0499 (SNCH)에 따라 Class I (무균) 의료 장비입니다. 필요한 것만이는 안구 표면의 무결성 유지를 보장하는 시술 중의 국소 마취이다. IC 이후에, 세포는 유동 세포 계측법을 위해 즉시 처리 될 수 있습니다. 또한, 비 안과 기술자 및 간호사가 안구 표면을 샘플링하도록 훈련받을 수 있습니다.
다른 기술에 비해 IC의 향상에도 불구하고 몇 가지 과제가 남아 있습니다. 예를 들어, IC의 위치에 따라 샘플링 영역 및 구 결막에서 지역적 차이로 인해 변동이있을 수 있습니다. 변동의 또 다른 원인은 IC 동안 다양한 양의 압력을 가하기 때문입니다. 다른 방법 론적 쟁점은 세포 처리 표준화와 관련이있다. 여기에는 지속 기간과 고정 방법, 시료 채취 된 물질의 안정성에 영향을 줄 수있는 저장 조건이 포함된다.
이 기술의 전반적인 목표는 안구 인상 샘플을 고립시키는 방법을 개발하는 것입니다.t는 사용하기 쉽고 비 침습적이며 임상 샘플의 면역 학적 특성 분석에 적용 할 수 있습니다.
Protocol
이 연구에 사용 된 모든 안구 샘플은 SingHealth Centralized Institutional Review Board와 싱가포르 남양 기술 대학교 제도 심사위원회의 승인을받은 싱가포르 국립 안과 센터의 Dry Eye Clinic에서 수집했습니다.
참고 : 피험자는 IC를 실시하기 전에 염증 정도와 눈물 기능 장애의 중증도를 평가하기 위해 임상 검사를 받았다. 임상 시험은 진단 장비, Schirmer 's test 17 , SPEED (Standard Patient Evaluation of Eye Dryness) 18 설문지, 각막 절개술 (SPEED) 설문 18을 사용하여 비 침습적 눈물 방울 차단 시간 (NI-TBUT) 14 및 결막 충혈 염색 19 .
1. IC에 의한 안구 샘플 채취
- 임상 상태의 결정 후, 마취참가자의 눈은 상지 구 및 결막에 1 ~ 2 방울의 국소 마취제 인 염산 프로 팔라 카인 (proparacaine hydrochloride)을 적용하여 관찰 하였다. 마취의 쑤시는 감각이 지치기까지 4 ~ 5 분 동안 기다리십시오.
- 두 가지 인상 세포학 장치로 비강 결막 결막에서 샘플을 수집합니다.
참고 : 두 개의 노출 샘플을 수집하는 데 하나의 장치가 사용됩니다. 여기서는 두 개의 장치를 사용하여 4 개의 임프레션 멤브레인을 수집했습니다.- 결막에 인상 세포학 장치를 접선 방향으로 위치시킵니다. 누름 단추를 부드럽게 누르고 2 - 3 초 동안 누릅니다.
참고 : 장치는 멤브레인과 함께 제공됩니다. 버튼을 누르면 압력이 자동으로 해제됩니다. 압력을 해제하고 장치를 제거하는 데 단지 몇 초가 걸립니다.
- 결막에 인상 세포학 장치를 접선 방향으로 위치시킵니다. 누름 단추를 부드럽게 누르고 2 - 3 초 동안 누릅니다.
- 막 1 ML 문화 미디어 (로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) + 10 % 태아 소 혈청이 들어있는 microcentrifuge 튜브로 막을 출시(FBS) + 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 스트렙토 마이신)
- 10 μL 피펫 팁으로 약 1 분 동안 지속적으로 긁어 냄으로써 장치의 막에서 세포를 분리합니다.
참고 : 멤브레인 표면이 고르지 않으면 긁힘이 완료됩니다. 각 막으로부터의 세포 수는 가변적이다 (100 - 500 세포 / 막). 수집 2 ~ 3 시간 이내에 샘플을 처리하십시오.
2. 유동 세포 계측법에 의한 세포의 면역 표현형 측정
- 매체를 제거 실온에서 5 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 유동 세포 계측법 완충액 (인산 완충 식염수 (PBS) + 0.05 % 소 혈청 알부민 (BSA)) 50 μL로 세포 펠렛을 Resuspend.
- 항체 ( 예 : CD3 브릴리언트 바이올렛 (BV) 510 (UCHT1), CD4 알로 피코시 아닌 -H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 피코 에리 트린 (PE) -A, CD45RO PE 시아닌 7 Cy7) -A, live / dead cell mark 7-ADD)를 실온에서 20-30 분 동안어두운. 제조업체의 프로토콜에 따라 항체를 직접 사용하십시오.
참고 : 항체 농도는 CD3-BV510 2.5 μL, CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD 1.25 μL 및 CCR7-PE 10 μL를 사용하십시오. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 사용하여 다양한 농도의 항체를 적정합니다. 적정을 위해 제조자의 프로토콜에 언급 된 항체 농도를 취하고 권장 농도의 1/2을 사용하십시오. 다른 형광 색 채널로 넘치지 않도록 항체의 최소 농도를 사용하십시오. 언급 된 항체 농도에서 명확한 신호가 관찰되었습니다. 보정은 초기에 Williams et al .에서 언급 된 프로토콜에 따라 PBMC를 시험함으로써 수행되었다. 시험을 위해 PBMC를 여기에 사용 된 동일한 항체 세트와 함께 배양하고 단일 및 다중 항체 얼룩을 비교하여 보상했습니다. - 부화 후od, 튜브에 얼룩 버퍼 1 ML을 추가 잘 혼합하고 실온에서 5 분 450 XG에서 원심 분리기. 얼룩 버퍼 200 μL에 Resuspend 세포.
- 플로우 cytometry 기계에서 샘플을 실행합니다.
- 데이터를 수집하기 전에 제조 업체의 지침에 따라 다른 일에 데이터 수집을 정상화하기 위해 cytometer 설정 및 추적 (CS & T) 비즈와 함께 흐름 cytometer의 채널 전압을 보정.
- 유동 세포 계측법 데이터 수집 소프트웨어를 열고 "Set up & QC"버튼을 클릭하고 올바른 CS & T 비드 로트 번호를 선택하고 비즈를로드 한 다음 "시작"버튼을 클릭하십시오.
- 기계에 샘플을로드하기 전에 부드럽게 튜브를 두드려 세포를 Resuspend. 데이터 수집 소프트웨어를 열고 "미리보기"를 클릭하십시오. 임계 값 속도가 안정되면 "획득"을 클릭하십시오. 샘플 레벨을 모니터하고 샘플이 부족하면 "중지"를 클릭하십시오.
참고 : 샘플 당 10,000 개의 이벤트를 확보하십시오. 10,000 이벤트를 획득 한 후, 워크 시트에 SSC-A 및 FSC-A 도트 플롯을 생성하십시오.- "Polygon Gate"버튼을 클릭하고 파편을 제외하기 위해 FSC-A 값> 5 x 10 4 인 모든 이벤트에 게이트 (P1 임)를 그립니다. "도트 플롯 만들기"버튼을 클릭하여 새 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 "속성"을 선택하여 "플롯 편집기"창을 연 다음 "P1"을 선택하십시오. P1 도트 플롯의 X 축에서 FSC-A를 클릭하고 CD3-BV510으로 변경하십시오. '다각형 게이트'를 그려 CD3 + 인구를 선택하고 이름을 'P2'로 지정하십시오.
- "도트 플롯 만들기"버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 "속성"을 선택하여 "플롯 편집기"창을 엽니 다. P2 도트 플롯의 x 축에있는 FSC-A를 클릭하고 7-AAD로 변경하십시오. 7-AAD 인구를위한 '다각형 게이트'를 그리고 'P3'을 선택하십시오. 여기서 P3은 CD3 +살아있는 세포.
- "도트 플롯 만들기"버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 "속성"을 선택하여 "플롯 편집기"창을 엽니 다. X 축에서 CD3-BV510을 클릭하고 P3 도트 플롯의 y 축에서 CD4-APCH7을 클릭합니다. 직사각형 그리기 사분면의 위쪽과 아래쪽에 각각 'P4'와 'P5'를 선택하십시오. P4는 라이브 CD3 + CD4 + 이고 P5는 라이브 CD3 + CD4 - T 세포입니다.
- "도트 플롯 만들기"버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 "속성"을 선택하여 "플롯 편집기"창을 엽니 다. X 축에서 CD45RO PE-Cy7을 클릭하고 P4 및 P5 플롯의 y 축에서 CCR7-PE를 클릭합니다. 이 점 그림에 '쿼드 게이트'를 그립니다.
참고 : 여기 왼쪽 위, 오른쪽 위, 오른쪽 아래 및 오른쪽 아래 사분면은 순진한 중앙 메모리 (T CM ), 전자(T EM ), 최종 분화 된 이펙터 메모리 (T EMRA ) T 세포를 포함한다.
- 데이터를 수집하기 전에 제조 업체의 지침에 따라 다른 일에 데이터 수집을 정상화하기 위해 cytometer 설정 및 추적 (CS & T) 비즈와 함께 흐름 cytometer의 채널 전압을 보정.
Representative Results
이 임상 장치에 의한 IC를 사용하여 안구 표면을 손상시키지 않으면 서 안구 표면 면역 세포를 분리 할 수있었습니다. 그림 1 은 IC가 수행 된 방법을 설명합니다. 샘플이 수집 된 곳과 다른 눈의 부위가 표시됩니다. 그림 2 는 10 건강한 컨트롤에서 수집 한 유동 세포 계측법의 대표 결과를 보여줍니다. 게이팅을 위해서는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 SSC와 7-AAD를 사용하십시오. 7-AAD - 세포는 살아있는 세포로 확인됩니다. 이 생균은 CD3 + 및 CD4 + 마커에 의해 특성화됩니다. 또한 CD4 + 및 CD4 - 개체군은 각각 CCR7 및 CD45RO 마커가있는 Naive, T EM , T CM 및 T EMRA 로 특징 지어졌습니다. CD3 + T 세포 중에는 인간의 안구 표면에서 이펙터 기억 T 세포가 우세합니다. 이전 e에서또한, CD8 + 기억 세포가 건강한 개체 중 결막 상피 세포의 주요 개체군임을 보여 주었다. 그림 3 은 CD4 + 및 CD8 + 이펙터 메모리 T 세포 (T EM 및 T EMRA )가 연구 된 건강한 대조군 10 명에서 인간 안구 표면의 주요 하위 집합임을 보여줍니다. 그림에 언급 된 각 집단은 그들의 마커 표현형 및 이름 (Naïve, T CM , T EM , T EMRA )으로 통보됩니다. 빨간색 숫자는 인구의 비율을 나타냅니다. 이 도면의 데이터는 평균 ± SEM
그림 1 : 인상 세포학 장치에 의한 안구 표면에서 IC 샘플 수집. 샘플은 측두엽으로부터 수집되었다ar 영역을 갖는다.
그림 2 : 유동 세포 계측법을 이용한 도트 플롯 그래프. 라이브 7-AAD - 세포가 선택되었습니다. CD3 + 세포는 먼저 문이 열리고,이 집단은 CD4 + 및 CD4 - 서브 세트로 게이팅되었다. 순진 (CCR7 + CD45RO - ), 중앙 기억 (CCR7 + CD45RO + ) 및 이펙터 메모리 (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) 부분의 비율은 CCR7 및 CD45RO 마커의 도움을 받아 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
에프그림 3 : 건강한 인간 안구 표면의 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 면역 세포 하위 유형. 건강한 사람 대조군에서 결막 내 CD4 + 및 CD8 + naive, central memory (T CM ) 및 effector memory (T EM 및 T EMRA ) 하위 집합의 분포 ; 각 데이터 포인트는 별도의 개별 평균 ± SEM을 나타냅니다. 인구의 비율은 각 인구의 이름 아래에 빨간색으로 표시됩니다. CD4 + T EMRA 인구가 언급 된 산점도에 포함되지 않았기 때문에 전체 인구 비율은 98 %이다 (Bose 등 21 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이는 스크래핑, 스왑 핑, 피펫 팅 또는 흡착 여과지 1 , 2 와 같은 기존 기술과 비교하여 비교적 빠른 면역 프로파일 링을 위해 외래 진료소에서 사용할 수있는 쉽고 빠르며 덜 침습적 인 기술입니다. 이 기법의 변형은 연구 설정에서 이미 사용되고 있습니다 22 . 향후 제안 된 방법론의 적용은 안구 질환, 특히 면역 표현형을 필요로하는 임상 시험에서 환자 층화에 적용됩니다.
이 기술의 주요 문제점은 인상 채취 및 스크래핑 후에 회수되는 비교적 적은 면역 세포입니다. 개체 당 4 번의 노출에서 회복 된 CD3 + T 세포의 총 수는 ~ 500 ~ 1,000 개의 세포에서 다양합니다. 안구 샘플은 세포의 추가 손실을 피하기 위해 최소 횟수 동안 유세포 분석을하기 전에 세척 하였다에스. 프로토콜 내에 남아있는 중요한 단계와 과제는 높은 세포 수를 달성하기 위해 눈 샘플을 효율적으로 수집하고 멤브레인을 적절히 스크래핑하는 것입니다. 그럼에도 불구하고이 제한은 특정 면역 표현형에 편향되지는 않을 것입니다. 세포 수율을 극대화하기 위해 여기에서 수행 된 문제 해결은 항체 배양 후 및 배양 전 세척 단계 수를 줄이는 것이 었습니다.
IC 사용에는 다른 제한 사항이 있습니다. 스티븐 존슨 (Steven Johnson) 증후군과 같이 심하게 각화되거나 섬유화 된 안구 표면을 가진 환자에서 세포 수율은 본 연구에서보다 낮을 수 있습니다. 같은 날 분석하지 않고 샘플을 보관하면 면역 세포의 비율이 달라질 수 있습니다. 특정 세포 유형이 다른 세포 유형보다 저장에 내성이 있는지를 예측하는 것은 어렵습니다. 이전 연구에서 결막 상피 세포의 HLA-DR 발현이 증가한 것으로보고되었으므로HLA-DR과 특정 면역 세포의 수준 사이의 상관 관계를 평가하기 위해 esting. 면역 세포는 또한 케모카인의 발현 수준과 관련 될 수있다. 이러한 문제는 향후 연구에서 다루어 져야한다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 금융 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 기술 단계를 돕는 Nandini Nallappan 및 Sharon Yeo에게 감사드립니다. 이 연구는 이공천 (Lee Kong Chian) 의대, 남양 공대 (Nanyang Technological University)의 KGC 창업 보조금 및 싱가포르 보건 성 국립 의료 연구위원회 (National Medical Research Council, NMRC)의 고위 임상 의학자 상 (Northern Clinician Scientist Award)의 LT (NMRC / CSA / 045 / 2012), NMRC의 보조금으로 KGC와 LT (NHIC-12D-1409007)에 국가 보건 혁신 센터 (National Health Innovation Center)가 관리한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
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