Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians

Summary

Dit protocol toont hoe planarian ogen (optische koppen) consistent snijden zonder verstoring omliggende weefsels. Via een insuline naald en spuit, een of beide ogen kunnen worden geablateerd voor onderzoek naar de mechanismen reguleren oog regeneratie, de ontwikkeling van visuele regeneratie en de neurale basis van door licht geïnduceerde gedragingen vergemakkelijken.

Abstract

In de studie van volwassen stamcellen en regeneratieve mechanismen, planarian platwormen zijn een nietje in vivo modelsysteem. Dit is grotendeels te danken aan hun overvloedige pluripotente stamcellen bevolking en het vermogen om alle cellen en weefsels types na verwondingen die katastrofisch voor de meeste dieren zou regenereren. Onlangs hebben planarians populairder geworden als een model voor oog regeneratie. Hun vermogen om het gehele oog regenereren (bestaande uit twee weefseltypen: pigmentcellen en fotoreceptoren) maakt de dissectie van de mechanismen reguleren visuele systeem regeneratie. ablatie oog heeft verschillende voordelen boven andere technieken (zoals onthoofding of gaten) voor de behandeling oogspecifieke pathways en mechanismen, de belangrijkste daarvan is dat regeneratie grotendeels beperkt tot alleen oogweefsels. Het doel van deze video artikel is om te demonstreren hoe de planarian optische kop op betrouwbare wijze te verwijderen zonder de hersenen verstoren of de omliggende weefsels.De behandeling van wormen en het onderhoud van een gevestigde kolonie wordt ook beschreven. Deze techniek maakt gebruik van een 31 G 5/16 inch insuline naald operatief schep de optische kop planarians geïmmobiliseerd op een koude plaat. Deze werkwijze omvat zowel enkele als dubbele oog ablatie, met de ogen regenereren binnen 1-2 weken, waardoor een groot aantal toepassingen. In het bijzonder kan deze ablatietechniek goed te combineren met farmacologische en genetische (RNA interferentie) schermen voor een beter begrip van regeneratieve mechanismen en hun evolutie, oog stamcellen en hun onderhoud en phototaxic gedragsreacties en de neurologische basis.

Introduction

Planarians een krachtige modelorganisme voor het bestuderen van volwassen stamcellen celgemedieerde regeneratie. Deze niet-parasitaire zoetwater platwormen bezitten het vermogen om alle ontbrekende weefsels, waaronder het centrale zenuwstelsel en de hersenen ¹ regenereren. Bestudeerde al in 1700 ^2, technologische ontwikkelingen op het gebied planarian de afgelopen 10-15 jaar (zoals een gesequenced genoom, in situ hybridisatie, immunohistochemie, RNA interferentie (RNAi) en transcriptomics) hebben deze historische modelorganisme bijgewerkt . In het bijzonder, hebben planarians onlangs steeds populairder geworden als een opkomend model voor oog onderzoek ^3.

Planarians hebben prototypische ogen met twee weefseltypen de fotoreceptor neuronen en pigmentcellen; Dit is de karakterisering van zijn oog stamcellen populatie ingeschakeld en toonden dat veel van de genen die de vertebrate eyekeling zijn geconserveerd in planarians ^{4, 5.} De optische bekers dorsaal gelegen en uit de witte, ongepigmenteerde dendrieten van de fotoreceptor neuronen en halve maanvormige zwarte pigmentcellen en de ogen innerveren de hersenen via een optische opticum. Naast het feit dat een model voor het ophelderen van regeneratieve processen ^6, planarian het oog is geschikt voor het bestuderen van de ontwikkeling van automomous ^7, gedragsreacties licht (planarians weer negatief phototaxis) ⁸ en de neurologische basis van het gedrag ^9.

Eye regeneratie planarians is grotendeels bestudeerd in twee situaties: in het kader van kopregeneratie onthoofding na ^{4, 10,} en na excisie van alleen de oogweefsels ^{11, 12 13, 14,} hoewel sommige studies hebben ook uitgevoerd amputaties net achter de ogen (gedeeltelijke onthoofding) ^15. Echter, al deze methoden omvatten het verlies van andere dan alleen het oog vele weefsels (zoals de hersenen, darmen, en nephridia), potentieel complicerende interpretatie van de resultaten. Het oog ablatie protocol hier gepresenteerde beperkt excisie aan de oogweefsels (met uitzondering van met hersenen), wat resulteert in gegevens die specifieker zijn voor het oog. Bovendien, in tegenstelling onthoofd wormen die 7-14 dagen om voeding te beginnen, zal Eye weggenomen wormen voeden binnen 24 uur ablatie ^12, waardoor RNAi experimenten (waar RNAi via voedsel wordt geleverd) wordt performed gelijktijdig.

Hoewel oog ablatie is technisch moeilijker om met succes uit te voeren dan onthoofding, hebben de huidige studies met oog uitsnijding niet inbegrepen gedetailleerde instructies over hun procedures. Het doel van deze video artikel is onderzoekers in staat te stellen de planarian optische kop consequent te verwijderen zonder de onderliggende hersenweefsel en het verwijderen van zo weinig andere weefsels mogelijk te maken. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor zowel enkele als dubbele oog ablatie en is toepasbaar op een groot aantal onderzoeken. Zoals de meeste regeneratie testen oog wordt ablatie goed geschikt voor combinatie met zowel farmacologische en genetische (RNAi) schermen en gedragsonderzoek. Hier beschrijven we methoden voor de behandeling van wormen, het handhaven van een planarian kolonie, en het oog ablatie techniek zelf.

Protocol

1. Dierlijke Cultuur en Handling

Opmerking: In dit protocol wordt Schmidtea mediterranea, een diploïde planarian soort met een genoom gesequenced ^{16, 17} die gewoonlijk wordt gebruikt voor regeneratie onderzoek. De test is even succesvol bij andere soorten, zoals tijgerplatworm en girardia dorotocephala (die commercieel verkrijgbaar zijn).

1. Handhaven wormen "worm water" van de 0,5 g / l zeezouten in ultrazuiver (of gefilterd gedeïoniseerd) water. Gebruik steriele polypropyleen of glazen containers naar de worm water vast te houden. Zie aanvullend bestand 1 voor meer informatie over worm water voorbereiding.
   LET OP: Gebruik nooit zeep om containers (of andere benodigdheden) als zeep te reinigen is giftig voor wormen; plaats af met 70% ethanol en aan de lucht drogen. <ol>
2. Draag handschoenen tijdens het werken met planaria om hen te beschermen tegen besmetting.
   LET OP: Worms zijn erg gevoelig voor milieu-toxines en chemicaliën, met inbegrip van zeep, bleekmiddel, shampoo, conditioner, en met de hand lotion.

Huis kolonies in polypropyleen houders, waarbij het deksel gedeeltelijk open gelaten voor luchtuitwisseling bij ~ 20 ° C (kamertemperatuur). Opslag experimentele wormen in beide petrischalen (20 wormen per 100 mm plaat) of niet-behandelde weefsel-kweekplaten (1 worm per putje voor platen met 12 putjes). Om stress te verminderen, houd beide kolonies en experimenten in het donker.
LET OP: Colonies mag niet meer dan 500-1000 wormen per liter worm water te hebben. Voor experimenten, laat deksels volledig op zijn plaats, omdat de luchtstroom is ontworpen om in deze gerechten.

Feed niet-experimentele wormen een keer per week met gepureerde biologisch rundvlees of kip lever door het droppen van puree van een transfer pipet, het plaatsen van druppels van voedsel door de container. Toestaan ​​wormen 2 uur om voedsel te consumeren in dedonker vóór het reinigen out container (zie stap 1.4). Voorafgaand aan gebruik, opslag puree bij -20 ° C voor korte termijn (weken) of -80 ° C voor lange termijn (maanden); do puree niet opnieuw invriezen voor hergebruik (zoals bacteriën kunnen bloeien en schadelijk zijn voor de wormen).
OPMERKING: Liver mag geen hormonen of antibiotica bevatten en bij voorkeur niet eerder worden ingevroren. Centrifuge puree voor het invriezen (of vóór het voeren) om lucht te verwijderen en te voorkomen dat voedsel drijven. Voedsel moet zinken naar de bodem van de container. 1 ml puree volstaat 500-1000 wormen.

Exchange water een keer per week met verse worm water voor zowel de kolonies en experimenten. Colony containers moeten ook naar beneden worden afgeveegd met een ongebleekt papieren handdoek (om slijm resten te verwijderen die val afval) een keer per week voor uitgehongerde wormen, of twee keer per week voor het voeden van wormen (2 uur na het voeden en weer 2 dagen later). Om de biofilm behouden door niet met meer dan 80% van de houder.

Verplaats wormen tussen de containers (of een operatie Setup) met een transferpipet. Om vrij wormen gehecht aan houderoppervlakken, spuiten water boven / achter de worm om deze uit het oppervlak. zuigen vervolgens de worm in de pipet, terwijl het proberen om de worm in de bodem inch (dunner) gedeelte van de pipet te houden.

1. Backload pipetten met een kleine hoeveelheid van de worm water voordat zuigen ze op.
2. Probeer om het water rond de worm te verplaatsen, in plaats van de worm zelf, om te voorkomen dat scheuren soft-bodied wormen door ze aan te raken met de pipet.
3. Houd experimentele gerechten vallen, tenzij de overdracht van wormen of het vervangen van water.

2. Bereiding

1. Stop het voeden wormen ten minste een week voorafgaand aan de experimenten.
   1. Selecteer wormen die zijn niet gevoed ≥1 week en ten minste 5-7 mm in lengte. Breng de wormen een petrischaal 2/3 met water worm en bevestig worm lengte door er met een liniaal onder de schotel. meten wOrms met volledige uitgeschoven en bewegen.
      OPMERKING: Tijdens kleiner (5-7 mm) wormen werken beter bij het uitvoeren van latere immunofluorescentie en in situ hybridisatie analyses, grotere wormen (8-10 mm) zijn gemakkelijker om mee te werken - met name bij het leren ablate.
   2. Zorg ervoor dat de wormen zijn geheel, onbeschadigd en niet recent regenereren.
      OPMERKING: Regenereren wormen zal veel lichter (of geen) pigment in het hoofd en / of de staart regio in vergelijking met normale wormen.
   3. Als het uitvoeren van RNAi of farmacologische behandelingen op wormen, doe dat dan op dit moment. Indien wormen werden toegevoerd als onderdeel van de behandeling (zoals voor RNAi), wacht ten minste 7 dagen na de laatste voeding alvorens verder met stap 2.2.
2. Reinig de werkruimte en dissectiemicroscoop basis met 70% ethanol en laat het dan volledig opdrogen. Zet de schaal van de geselecteerde wormen aan de linkerkant van de scope. Rechts van het toepassingsgebied, plaats een paar # 5 tang, een 31 G 5/16 inch insuline naald met een 1ml spuit en een schone overdracht pipet.
   1. Waarborgen dat de instrumenten niet tegen de bank (die verontreinigingen kan voorstellen) worden gehouden. Met een stijf voorwerp (bijvoorbeeld een eetstokje rust) om de tang, naald, pipet en schoon te houden. Als alternatief, plaats instrumenten op de top van een verse bruine (ongebleekt) papieren handdoek.
      LET OP: Deze en volgende instructies zijn geschreven als ze betrekking hebben op rechtshandig personen. Linkshandige mensen moeten de links / rechts richting te keren.
3. Naast de werkruimte, plaats een doos met pluisvrij doekje doekjes, een bron van zoet worm water, en een aantal extra pipetten (beschermd tegen de bank boven). Plaats worm water in een plastic spuitfles voor het gemak van doseren. Plaats ook een gelabelde 12-putjesplaat (of 100 mm petrischaal) rechts van de mogelijkheden voor het verzamelen van dieren geablateerd.
4. Bij gebruik van een op maat gemaakte Peltier plaat wormen immobiliseren, plaats de Peltier plaat in de holte in tHij onderkant van de dissectiemicroscoop en stel de uitgang van de DC-voeding tot het werkoppervlak van de Peltier plaat voldoende is afgekoeld (gewoonlijk -5 V) .Alternatively, maak een koude plaat vult een 100 mm petrischaal ½ vol met water en vries gedurende ten minste 24 uur. Gooi het deksel en plaats de bodem van de schaal van 100 mm op basis van het ontleden scope en plaats het deksel van een 60 mm petrischaal omgekeerd direct op het oppervlak van het ijs (Figuur 1A).
   1. Nadat het water is bevroren in de schaal van 100 mm, een "vulkaan" ijs verschijnen in het midden van de plaat. Als dit gebeurt, gebruik een scheermesje om het ijs vlakke schrapen, om eventuele onregelmatigheden van het oppervlak te verwijderen.
      LET OP: Tijdens operaties het ijs zal smelten, waardoor ablaties veel moeilijker. Bereid een aantal ijs gerechten op voorhand, en vervang diepvriesproducten voor het smelten van degenen die tijdens de test zodra het deksel van de 60 mm gerecht begint zweven.
5. Bereid dechirurgie oppervlak. Snijd een 5 cm x 10 cm stuk plastic paraffinefilm (4 ^cm2 bij gebruik van de petrischaal koude plaat) en plaats het op het midden van de fixeerinrichting. Vouw een pluisvrije tissue wipe in een vierkant ongeveer 2 ^cm2 en plaatst deze bovenop de film. Snijd een stuk wit filterpapier 1,5-2 ^cm2 en zet deze boven van het afveegdoekje. Zie Figuur 1B-1E.
   1. Houd de gevouwen vegen op zijn plaats met een gehandschoende vinger, en gebruik worm water om licht te dempen het doekje te zorgen dat het blijft gevouwen. Met de zijkant van een transferpipet te rollen het doekje flat.
      OPMERKING: Cold temperatuur helpt om wormen in beweging te houden. Werken "droge" helpt ook bij immobilisatie. Het weefsel wipe werkt om water opzuigen door het filterpapier, waarbij de worm vochtig tijdens de operatie zonder dat wormen volledig laten drogen (die dodelijk).

3. Chirurgische Ablatie

1. Gebruik een transfer pipet om op te plaatsene worm dorsale zijde naar boven op de filter papier. Draai de lichtbron en richt de goosenecks zodat het licht is gericht op de worm. Stel het ontleden scope focus en vergroting, zodat de ogen zijn duidelijk zichtbaar (het hele worm niet hoeft te worden in het oog); 5X vergroting is een goed uitgangspunt. Oriënteren de worm door aan de paraffinefilm zodat de kop gericht is naar de onderzoeker (naar de voorzijde van de microscoop), hoekig 30-40 graden naar rechts.
   1. Vermijd het gebruik van felle licht om overtollige worm beweging te voorkomen. Planarians tonen negatieve phototaxis en zal proberen aan fel licht te ontwijken.
   2. Indien de worm gepositioneerd ventrale zijde naar boven (met faryngeale opening zichtbaar) Gebruik de doffe kant van de tang voorzichtig positie van de worm dorsale zijde naar boven (met de ogen zichtbaar). Vermijd het naderen van het dier met de scherpe punt van de tang om de kans op scheuren door zachte weefsels bij de herpositionering van de dieren zo weinig mogelijk.
2. Houd een nieuwe naald / spuit in de rechterhand alsof het een pen (tussen duim en wijsvinger). Brace de linker duim tegen de Peltier plaat (of petrischaal koude plaat) en gebruikt de linker duim als een draaipunt, waarop de bodem van de spuit rusten (figuur 2A). Kijk door de microscoop, en zorg ervoor dat de schuine kant van de naald zichtbaar is.
   LET OP: Naalden zijn erg scherp. Wees voorzichtig bij de omgang met hen. Het dragen van latex of nitril kan enige bescherming bieden.
   1. Gebruik de linker duim te helpen houden de naald / spuit stabiel gedurende de procedure en te voorkomen dat handen schudden.
   2. Maak een hoek van ongeveer 40 ° met de linker duim en linker wijsvinger (met de wijsvinger op de operatie oppervlak) om te helpen houden de operatie oppervlak stabiel.
3. Metde schuine kant van de naald naar boven gericht (zoals een lepel), plaatst de naald loodrecht op het oog (figuur 2B). Met de punt van de naald subtiel in de dunne laag weefsel boven de optische kop (wit gepigmenteerde gebied) van het oog, scheppen van rechts naar links. Zeer verwijder voorzichtig gepigmenteerde weefsel zich in de optische kop, verzorgen de bodem niet te doorboren en de grenzen van de optische kop te vernietigen.
   1. Indien de worm op het filtreerpapier gedurende> 1-2 min is op enig moment tijdens de procedure, één druppel water worm de worm rehydrateren.
      OPMERKING: Uitdroging zal de gevoeligheid van de worm te verhogen tot scheuren verwondingen.
4. Herhaal stap 3.3 totdat alle zwart gepigmenteerd weefsels (pigmentcellen), alsook elk van witte weefsels van de optische kop (dendrieten van de fotoreceptor cellen) worden verwijderd. Verwijderen uitgesneden weefsels vast aan het uiteinde van de naald door voorzichtig afvegen met een tissue afvegen. Als dubbele oog ablatie is gewenst ablatie het tweede oog op dit punt.
   Opmerking: Om verwonding te voorkomen, kunnen naalden worden gereinigd door het grijpen van de naald met een schone tissue wipe gehouden met de duim en wijsvinger, vervolgens met de andere hand de naald te trekken door het wegvegen van de duim en wijsvinger. Als alternatief kan de naald worden geveegd op het oppervlak van een natte tissue wipe en onderzocht op reinheid.
5. Wanneer u klaar bent, gebruik maken van een transfer pipet om de worm te verplaatsen naar een gelabeld schaal met vers worm water. Wanneer het analyseren groepsgegevens plaatst tot 20 wormen in een 100 mm petrischaal. Indien het volgen regeneratie in dezelfde individuen de tijd, plaats 1 worm in elk putje van een 12-wells plaat. Zodra alle wormen worden overgebracht, spoel wormen door alle worm water van de borden / putten en te vervangen door meer verse worm water.
   1. Wormen uit het filter te verwijderen, backload de pipet met een kleine hoeveelheid water worm en het water vrij op de schroef. Dit moet tillen tHij worm uit het filterpapier onmiddellijk wordt gezogen in de pipet voor de overdracht.
6. Incubeer experimenten bij ~ 20 ° C (kamertemperatuur) beschermd tegen licht en volg het regeneratieve proces.
   OPMERKING: Wormen kunnen worden opgeslagen in een thermisch geïsoleerde incubator om een ​​constante temperatuur te handhaven, maar dit is niet strikt noodzakelijk. De meeste kamer temperatuur varieert alleen 5 ° C, die niet van invloed op het vermogen van de worm te regenereren.
7. Desgewenst vast wormen voor immunohistochemie (zie figuren 3-4) en / of in situ hybridisatie analyse van genexpressie. Verschillende bevestigingsmethoden aanwezig voor planarian immunohistochemie ^{18, 19, 20} en in situ hybridisatie ^{21, 22, 23} protocollen.
8. Wanneer experimenten worden gesloten, sacrifice leven wormen door het verwijderen worm water uit de schaal en te vervangen door 70% ethanol. Incubeer wormen gedurende 3-5 minuten, het controleren op wormen lyseren en draai grijsachtig.
9. Plaats de niet-behandelde wormen in de normale afvalstroom eenmaal opgeofferd. Voorkomen dat er levende wormen in het milieu, met name niet-inheemse soorten.

Representative Results

Voor de eerste 1-2 uur na de operatie, kunnen dieren vertonen verminderde beweging ten opzichte van intacte wormen (maar ze zullen nog bewegen). Indien gewenst, wormen eet binnen 24 uur van chirurgie (bijvoorbeeld voor RNAi voeding). Bij het volgen van eye regeneratie in dezelfde individuen over de tijd, zorg ervoor dat je een foto van elke worm te nemen, zowel voorafgaand aan de operatie (intact) en op 1 uur na ablatie (HPA). Per 4 dagen na ablatie (dpa) regenereren van pigmentcellen zichtbaar, en met 14 dpa het gehele oog wordt volledig geregenereerd (Figuur 3A-B). Dit omvat de fotoreceptor neuronen en hun innervatie naar de hersenen (figuur 3C), en functioneel herstel van het visuele systeem (figuur 4A-C). Succesvolle ablaties niet verstoren de onderliggende weefsels van de hersenen (Figuur 4D-E), noch introduceren andere verwondingen van de dieren (figuur 5A). mislukte ablationsomvatten dieren met: een te grote excisie dat de gewrichten (figuur 5B) aansluit, scheurt de laterale rand van het dier (figuur 5C), en / of wondplekken die steken door de ventrale epidermis (Figuur 5D). Bovendien mislukte ablaties omvatten onvolledige verwijdering van het gehele optische kop, omvattende zowel de witte ongepigmenteerde weefsel en het zwarte pigment cellen (Figuur 5E-F).

Figuur 1: Chirurgische voorbereiding. (A) Schematische weergave van koude plaatconstructie via de bodem van een 100 mm petrischaal (gevuld met ijs) en het deksel van een 60 mm petrischaal (ondersteboven geplaatst op het ijs). (B) Schematische weergave van de operatie oppervlak, gemaakt van een stapel (boven naar beneden) wit filterpapier, een vochtige gevouwen doekje af te vegen, en een stuk paraffinefilm.(C) De set-up operatie (voor de rechtshandige). A: ontleden scope, B: zwanenhals verlichting, C: oppervlakte chirurgie, D: Peltier plaat, E: schotel van 5-7 mm wormen klaar voor ablatie, F: wasfles worm water, G: chopstick rust die schoon transferpipet, H: chopstick rust die naald / spuit, I: chopstick rust die forceps, J: container extra pipetten. (D) Custom Peltier plaat configuratie. (E) petrischaal koud plaatconfiguratie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: positie van handen en naald / spuit gedurende de ablatie. (A) Plaatsing van de handen (voor de rechtshandige). Merk op dat de linker duim wordt gebruikt om de spuit te ondersteunen (aangehoudenin de rechterhand) om beweging te minimaliseren. (B) Plaatsing van de naald ten opzichte van het oog van de worm. Merk op dat het afgeschuinde oppervlak van de naald naar boven wijst. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: weggenomen planarian ogen te regenereren. Morfologie van Schmidtea mediterranea planarians hergroei ogen volgende (A) dubbel oog ablatie en (B) één oog ablatie. (C) Immunohistochemie toont regeneratie van de fotoreceptor neuronen (anti-arrestin) na één oog ablatie. Intact wormen worden getoond voor de operatie, en regenereert worden getoond op dag 4 en 14 na ablatie. Voor alleenstaande oog ablations, het linkeroog was eenblated en het rechteroog dient als een inwendige (niet-beschadigde) controle. Red pijlpunten: weggenomen ogen. Schaalbalken = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Functioneel herstel van het visuele systeem na ablatie. (A - C) Functionele assay voor planarian fotofobie testen. (A) Intact worms voorkomen dat reizen door gebieden van licht, zoals een vertrekpunt een groene laser pointer. (B) op 24 uur na de ablatie, "blind" double eye geablateerd wormen reizen door lichte vlekken. (C) Op 7 dagen na de ablatie, hebben dubbel oog weggenomen wormen hun visuele systeem voldoende geregenereerd om licht te vermijden herstellen. Yellow pijlpunt: afwijkend gedragal antwoord. (D - E) ablatie Eye beperkt tot de weefsels van de optische kop, en niet verstoren de onderliggende hersenweefsels. (D) Immunohistochemie toont hersenen architectuur (anti-synapsin) ongewijzigd van voor ablatie tot 1 uur na ablatie. (E) met hematoxyline en eosine (H & E) kleuring 1 uur na ablatie in een transversale doorsnede schade grotendeels beperkt tot de plaats van de weggenomen optische kop. Rechteroog (met zwart pigment cellen) dient als interne controle. Red pijlpunten: weggenomen ogen. Schaalbalken = 1 mm (AC) 1 mm, 100 pm (DE). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5: Kenmerken van geslaagde en mislukte ablations. (A) Succesvolle enkele en dubbele oog ablaties (5 min na ablatie) hebben wonden die in afmeting ongeveer gelijk aan de oorspronkelijke optische kop zijn. (B - E) Mislukte ablaties: (B) te veel weefsel verwijderd en de wond verbindt de twee ogen, (C) de wond tranen en zich uitstrekt tot de rand, (D) de wond te diep en steekt door van de dorsale (D) aan de ventrale (D') zijde, en (E - F) niet alle optische kop weefsels worden verwijderd, gevisualiseerd zowel morfologisch (E) en anti-arrestin kleuring van de fotoreceptor neuronen (F). Yellow pijlpunten: afwijkende ablations. Gele cirkels: ablatie plaats. Schaalbalken = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Dit oog ablatietechniek verbetert de huidige methoden (bijvoorbeeld gaten) door het uitsluiten hersenweefsels en beperken excisie voornamelijk aan de oogweefsels. Met de praktijk, kan deze techniek worden uitgevoerd door de meeste mensen, van technici met ervaring in microsurgeries te onervaren maar gewetensvolle undergraduate studenten. Aanbevolen wordt deze techniek vele malen worden uitgevoerd voor het gebruik in ablaties experimenten, waaronder (indien mogelijk) is bevestigd door volledige verwijdering van alle oogweefsels door immunohistochemie en in situ hybridisatie oog merker (s) ^{4, 5, 13.} De meest kritische stap in dit protocol is het scheppen van weefsels. Het is belangrijk om te veel of te weinig weefsel niet verwijderen. Dit kan worden vermeden door niet te diep scheppen met de naald te voorkomen doordringen tot de ventrale zijde van de worm. De tip van de neeDLE mag alleen worden geplaatst ongeveer 0,4 mm diep, en het schuine gedeelte van de naald moet nooit helemaal door het oog. Speciale aandacht moet worden genomen om de fragiele weefsel tussen de twee ogen (de mediale rand van de zwarte gepigmenteerde gebied van elk oog vertegenwoordigt de grenzen van elk oog) niet beschadigen. Beschadiging tussen het oog en de distale rand van de worm moet worden vermeden. Kleinere wormen hebben meer kans op scheuren of worden onbedoeld gewond, zodat het gebruik van grotere wormen (in het bijzonder voor de praktijk) wordt aanbevolen. De belangrijkste beperkingen van deze techniek is dat deze relatief tijdsintensief (en niet geschikt voor high-throughput screens), en het vereist een initiële investering in oefenen om de nauwkeurigheid van de resultaten te verzekeren. Echter, met de praktijk 10 ogen kunnen worden weggenomen in ~ 15 minuten.

Een belangrijk gebied voor het oplossen van problemen ligt in de lijn planarians nog tijdens de procedure. De twee belangrijkste redenen wormen onvoldoende geïmmobiliseerd ablaties voeren(a) te veel water en (b) verlies van koude temperatuur. (A) Bijkomend planarian water dat zwembaden op de operatie oppervlak tijdens het overbrengen wormen zal wormen bewegen en bemoeilijken de operatie. De operatie oppervlak (niet-pluizende tissue af te vegen en filter papier) mag alleen vochtig blijven. Als op enig moment tijdens de procedure het afveegdoekje wordt verzadigd met worm water, moet ofwel worden vervangen of overdracht pipet kan worden gebruikt om zachtjes overtollig vocht uit het weefsel wipe (altijd trekken uit het doekje en niet het filterpapier). Tissue doekjes kunnen ook worden gebruikt om overtollig water pooling te verwijderen op de operatie oppervlak. Dit proces kan het nodig zijn vele malen herhaald worden, afhankelijk van het aantal wormen worden weggenomen. (B) Als u de petrischaal koude plaat ingesteld, vergeet om de koude plaat te vervangen zodra het ijs begint te smelten en 60 mm petrischaal deksel begint te drijven. Dit zal zorgen voor zowel een stabiele operatie oppervlak en een adequaat koud oppervlak. Als alternatief, bij gebruik van de Peltier plaatopgericht rekening mee dat na 45 minuten tot 1 uur gebruik, de warmte in de buitenringen de koelplaat in het midden overwinnen en alle koeling verloren. In dat geval zet de Peltier plaat gedurende 5-10 minuten om op kamertemperatuur te komen voor hervatting ablaties.

Een ander punt van het oplossen van problemen is in worm-overdracht tussen het gerecht en de operatie oppervlak en weer terug. Als geablateerd wormen zijn moeilijk te verwijderen uit het filterpapier, plaats een druppel water op de worm worm tot vloeistofplassen boven op het filterpapier. Wormen kan dan opgezogen in de pipet overdracht zoals gebruikelijk. Als de problemen aanhouden, probeer dan het wegknippen van de worm op zijn buikzijde eerste (met behulp van de saaie kant van de tang). Als een worm in de overdracht pipet vast komt te zitten, dit is meestal een teken dat er te veel water is opgenomen (wormen dient in de overdracht pipet niet verder dan over een duim worden getrokken). Een worm vast in een transferpipet verwijderen opstellen 1-2 ml worm water in de pipet, zodat de worm is bedekt met water. Stevig flick de zijde van de pipet totdat de worm loskomt van de wand van de pipet en zweeft.

Als de naald dof wordt, vervangen door een nieuwe naald / spuit. Denk aan de naald te vervangen na het gebruik ervan te ≥30 ogen ablate. Overmatige verwijdering van gereseceerd weefsel door afvegen met een tissue afvegen kan ook doffe naald, waardoor ablaties moeilijker. Het is goed als weggesneden weefsels blijven binnen de afgeschuinde deel van de naald in de hele procedure (zelfs over meerdere dieren). Gebruik altijd een nieuwe naald / spuit bij het wisselen tussen de wormen van verschillende omstandigheden (bijvoorbeeld wildtype vs. RNAi wormen), evenals bij het begin van nieuwe ablatie sessies (dat wil zeggen op verschillende dagen).

Deze chirurgische oog ablatietechniek is een krachtig middel om licht geïnduceerde gedrag (en hun genetische en neurologische basis) in planarians onderzoeken, met namein combinatie met farmacologische behandelingen of RNA interferentie. Ablatie oog is ook een groot middel om de mechanismen die endogeen planarian oog regeneratie (en ogen stamcel onderhoud en differentiatie) in vivo reguleren helderen. Aangezien de meeste gewervelde dieren hebben een zeer beperkte mogelijkheden om oog weefsels te regenereren, te begrijpen hoe planarians in staat zijn om hun ogen te regenereren belangrijk bij het identificeren van mogelijke mechanismen voor de vertaling in de toekomst therapieën zal zijn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional