Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

Summary

Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir.

Abstract

Yetişkin kök hücreleri ve rejeneratif mekanizmaların çalışmada planarya yassı kurtların vivo model sisteminde bir elyaf. Bu onların bol pluripotent kök hücre nüfus ve çoğu hayvanlar için felaket olacaktır yaralanmalar sonrasında tüm hücre ve doku tiplerini rejenere etme kabiliyetine büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Son zamanlarda, planarya göz rejenerasyon için bir model olarak popülerlik kazanmıştır. (Iki doku tiplerinin gibidir: pigment hücreleri ve fotoreseptör) tüm göz yeniden kabiliyetleri görme sistemi rejenerasyonunu düzenleyen mekanizmaların diseksiyon sağlar. Göz ablasyon rejenerasyon büyük ölçüde tek başına göz doku ile sınırlı olduğunu En önemli olan göz spesifik yolları ve mekanizmaları incelemek için (örneğin, başı kesilerek ya da delik açma gibi) diğer tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Bu Video makalenin amacı güvenilir beyni rahatsız veya dokuları çevreleyen olmadan planarian optik fincan nasıl kaldırılacağını göstermektir.solucan ve kurulu bir koloninin bakım kullanımı da tarif edilmektedir. Bu teknik, cerrahi soğuk plaka üzerinde immobilize Planaryalar optik fincan oymak için bir 31 G, 5/16 inç insülin iğne kullanır. Bu yöntem geniş bir uygulama yelpazesi için izin 1-2 hafta içinde rejenere gözlü, tek ve çift göz ablasyon kapsar. Özel olarak, bu ablasyon tekniği kolayca rejeneratif mekanizmaları ve evrim, göz kök hücreleri ve bakım ve phototaxic davranışsal tepkileri ve nörolojik olarak daha iyi anlaşılması için farmakolojik ve genetik (RNA interferansı) ekranları ile birleştirilebilir.

Introduction

Planaryalar yetişkin kök hücre aracılı yenilenmeyi incelerken için güçlü bir model organizma bulunmaktadır. Bu parazitik olmayan tatlı su yassı kurtların, merkezi sinir sistemi ve beyin ¹ de dahil olmak üzere her türlü kayıp dokuları, yeniden yeteneği gösterirler. (In situ hibridizasyon, immünohistokimya, RNA interferans (RNAi), ve transkriptomik içinde, örneğin, bir sıralı genom olarak) kadar geri son 10-15 yılda planarian alanında 1700 ^2, teknolojik gelişmeler olarak ele bu tarihi organizma olduğu güncellenmiş . Özellikle, planarya geçenlerde göz araştırma ³ yükselen bir model olarak popülerlik kazanmıştır.

Planaryalar iki doku tipleri, fotoreseptör nöronlar ve pigment hücreleri ile prototipik gözleri; Bu onun göz kök hücre popülasyonunun karakterizasyonu etkin ve aynı genlerin birçoğu omurgalı gözü DE düzenleyen olduğunu göstermiştirvelopment Planaryalar ^{4, 5} muhafaza edilir. Optik bardak dorsal olarak bulunur ve fotoreseptör nöronların beyaz, pigmentsiz dendrit ve yarım ay siyah pigment yapan hücrelerden, ve bunun üzerine kiyazmanın ile beyin innerve edilir. Yeniden yaratıcı süreçler, ⁶ açıklık için bir model olmasının yanı sıra, planarian göz görme mekanizmaları ⁷ evrim eğitimi için uygundur, davranışsal tepkileri ışığa ⁸ ve davranış ⁹ nörolojik temeli (planarya negatif phototaxis ekran).

Planaryalar Göz rejenerasyon büyük ölçüde iki ana bağlamlarda incelenmiştir: Baş yenilenme parçası başının kesilmesini ^{4, 10} takip ve sadece göz dokularının ¹¹ eksizyonu aşağıdaki ^{gibi 12} 15 arkasında amputasyon gerçekleştirilir rağmen bugüne kadar en yaygın planarian göz eksizyon yöntem olup, ince bir cam kılcal boru ^{13, 14} ile delik açma ile olmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin tüm potansiyel olarak, sonuçların yorumunu komplike (örneğin, beyin, bağırsak, ve nephridia gibi) sadece göz dışındaki birçok doku kaybını içermektedir. Burada sunulan göz ablasyon protokolü göze daha özeldir verilerin ortaya çıkmasına neden (özellikle beyinde hariç) göz dokularına, eksizyonu kısıtlar. Ayrıca, beslenme başlamak için 7-14 gün sürebilir kafası kesilmiş solucanlar aksine, göz kesilip solucanlar performe edilmesi (RNAi gıda ile teslim edilir) RNAi deneyleri izin ablasyon ¹² 24 saat içinde besleyecekeş zamanlı d.

Göz ablasyon başarılı dekapitasyon daha gerçekleştirmek için teknik olarak zor olsa da, göz eksizyonu içeren güncel çalışmalar onların prosedürlerine ilişkin ayrıntılı talimatlar yer verilmemiştir. Bu video makalede amacı sürekli altta yatan beyin dokuları rahatsız ve mümkün olduğunca az diğer dokulara çıkarmadan planarian optik fincan kaldırmak için araştırmacılar sağlamaktır. Bu yöntem hem tek ve çift göz yakmakta ve araştırmaların geniş bir yelpazede uygulanabilir edilebilir. En yenilenmesi deneylerinde olduğu gibi, göz ablasyon farmakolojik ve genetik (RNAi) ekranlar, hem de davranışsal çalışmalar her iki kombinasyon için uygundur. Burada, solucan işlenmesi için yöntemler tarif bir planarian koloni bakımı ve göz ablasyon tekniği kendisi.

Protocol

1. Hayvan Kültür ve Taşıma

NOT: Bu protokol Schmidtea mediterranea, yaygın rejenerasyon araştırma için kullanılan bir sıralı genomun ^{16, 17} ile diploit planarian türler kullanır. Bununla birlikte, deney gibi Girardia tigrina ve Girardia dorotocephala (ticari olarak temin edilebilir) gibi başka türler ile aynı başarılıdır.

1. Ultra saf (ya da süzülmüş deiyonize edilmiş) su içinde 0.5 g / L deniz tuzu yapılan "sonsuz su" solucanlar koruyun. Sonsuz su tutmak için steril bir polipropilen ya da cam kaplar kullanın. Bkz Ek Dosya 1 solucan su hazırlama ile ilgili ayrıntılar için.
   Not: sabun gibi kaplar (ya da diğer malzemeleri) temizlemek için sabun kullanmayın solucan için toksiktir; yerine% 70 etanol ile silin ve kurumaya bırakın. <ol>
2. mikroplardan korunmak için Planarya çalışırken eldiven giyin.
   Not: Solucanlar sabun, ağartıcı, şampuan, saç kremi, ve el temizleme dahil olmak üzere çevresel toksinler ve kimyasallar, çok hassastır.

Kapaklı polipropilen gıda kapları Ev koloniler, ~ 20 ° C (oda sıcaklığı) hava değişimi için kısmen açık bıraktı. Petri kutuları ya saklayın deney kurtlar (100 mm tabak için 20 solucanlar) veya non-muamele edilmiş doku kültürü plakaları (12 oyuklu plakalar için oyuk başına 1 solucan). Stresi azaltmak karanlıkta hem koloniler ve deneyleri tutmak.
NOT: Koloniler solucan litre suya en fazla 500-1000 den solucanlar olmalıdır. Hava akımı bu yemeklerin içine tasarlanmıştır beri deneyler için, tam yerinde kapaklarını bırakın.

Bir transfer pipeti ile ilgili püresi bırakarak kap boyunca yiyecek damla yerleştirerek püre haline getirilmiş organik et ve tavuk karaciğer haftada bir deneysel olmayan solucanlar besleyin. içinde gıda tüketmek Worms 2 saat izin verkabını temizlemeden önce koyu (adım 1.4). Uzun süreli (ay) C, mağaza kısa süreli (haftalar) boyunca -20 ° C'de püre ya da -80 Kullanımdan önce; (Bakteri çiçek ve solucanlar zarar verebilir gibi) yeniden kullanım için püresi dondurursam yoktur.
Not: Karaciğer bir hormon veya antibiyotik içerir ve tercihen önceden dondurulmuş edilemez. Santrifüj, dondurmadan önce püresi (ya da teknolojide beslemeye) havanın çıkartılması ve yüzer gıda önlemek için kullanılırlar. Gıda kabın dibine batar gerekir. püresi 1 mL 500-1,000 solucanlar için yeterlidir.

Kolonilerin ve deneyler hem taze solucan su ile haftada bir kez Değişim su. Koloni kaplar da ağartılmamış kağıt havlu ile silinmiştir edilmelidir (mukus lekeleri çıkarmak için tuzak atıklar) (besleme ve tekrar 2 gün sonra 2 saat sonra), besleme solucanlar için haftada iki kez solucanlar açlıktan veya bir haftada bir kez. biyofilm muhafaza etmek için, kabın% 80'den fazla silme yoktur.

Kaplarla (ya da cerrahi Setu arasında solucanlar taşıp) Bir transfer pipeti kullanarak. kap yüzeylerine yapışan serbest solucan için, yüzeyin serbest bırakmak için solucan / arkasında üzerinde su fışkırtma. pipet alt inç (tiner) kısmı içinde solucan tutmaya çalışırken Ardından, pipet içine solucan emmek.

1. onları emmeye önce solucan küçük bir su miktarı ile Backload pipetler.
2. pipet ile dokunarak yumuşak bedenli solucanlar yırtılma önlemeye yardımcı olmak için, daha doğrusu solucan kendisinden daha, solucan etrafında su taşımak için deneyin.
3. solucanlar transfer veya su yerine sürece örtülü deneysel yemekler tutun.

2. Hazırlık

1. Deneylerden önce solucanlar az bir hafta beslenmesi durdurun.
   1. ≥1 hafta boyunca beslenirler ve uzunluk olarak en az 5-7 mm edilmemiş olan solucanlar seçin. solucan su dolu bir Petri kabı 2/3 solucan aktarın ve çanak altına bir cetvel kaydırarak solucan uzunluğunu onaylayın. w ölçünnormlar ise tamamen uzatılmış ve hareketli.
      NOT: Sonraki .bağışık ve in situ hibridizasyon analiz içinde, daha büyük solucanlar (8-10 mm) performans ile çalışmak daha kolay olduğunda daha küçük (5-7 mm) solucanlar daha iyi çalışırken - özellikle aşındırılması için öğrenme.
   2. solucanlar, bütün hasarsız ve yakın zamanda yenileyici değildir emin olun.
      NOT: Normal solucanlar kıyasla rejenerasyon solucanlar, baş ve / veya arka bölgede daha hafif (veya hiç) pigment olacaktır.
   3. solucanlar üzerinde RNAi'yi veya farmakolojik tedaviler gerçekleştirmek, bu noktada bunu. kurtlar tedavisi (RNAi için gibi) bir parçası olarak beslenen olsaydı, 2.2 adıma devam etmeden önce en az 7 gün son beslenmeden sonra bekleyin.
2. % 70 etanol ile çalışma alanı ve diseksiyon mikroskobu baz temizleyin ve tamamen kurumasına izin verin. Kapsamı solundaki seçilen solucanların koyunuz. Kapsamı sağında, 5/16 inç insülin iğne 1 ile 5. forseps bir çift, bir 31 G yerml şırınga ve temiz bir aktarım pipet.
   1. alet tezgah (kontaminasyona neden olabilir) dokunmasını tutulmasını sağlamak. temiz forseps, iğne ve pipet tutmak için (örneğin bir çubuk geri kalanı gibi) sert bir öğesini kullanın. Alternatif olarak, yeni bir kahverengi (ağartılmamış) ve kağıt havlu üstüne yer araçlar.
      NOT: Sağ elini bireyler ilgilendirmeyen Bu ve sonraki talimatlar yazılır. Solak bireyler sağ / sol yön ters olmalıdır.
3. Sonraki bir çalışma alanı için ve lif içermeyen doku mendillerin bir kutu, taze sonsuz bir su kaynağı, ve (tezgah üstü korunmuş olarak) ilave bazı aktarım pipetler yerleştirin. yayma kolaylığı için bir plastik yıkama şişesinde yer solucanı su. Ayrıca ablasyona Hayvan toplam kapsamına sağındaki işaretlenmiş bir 12-kaynaklı plaka (veya 100 mm Petri kabı) yerleştirin.
4. Ismarlama bir Peltier plakası kullanılarak solucanlar hareketsiz hale getirmek için ise, t depresyon içine Peltier plakası pozisyonO mikroskop taban ve Peltier plakasının çalışma yüzeyi yeterince soğuk kadar DC güç kaynağı çıkış ayarlayabilirsiniz (tipik olarak ~ 5 V) .Alternatively, yarım su ile dolu bir 100 mm Petri kabı doldurarak soğuk plaka yapmak ve en az 24 saat süre ile dondurma. Kapağı atın ve kesici bir alan tabanındaki 100 mm tabak için alt tarafının, daha sonra buz (Şekil 1A) yüzeyine doğrudan baş aşağı bir 60 mm Petri kabı kapağını yerleştirin.
   1. Su, 100 mm tabak içinde dondurulur sonra, bir buz "volkan" plakasının merkezinde bir görünebilir. Bu durumda, yüzeyden herhangi bir düzensizlik kaldırmak için, buz düz kazımak için bir tıraş bıçağı kullanma.
      NOT: ameliyatları sırasında buz, erimeye çok daha zor ablasyon yapma olacaktır. önceden birkaç buz yemekleri hazırlayın, ve en kısa sürede 60 mm yemeğin kapak yüzen başlar başlamaz tahlil sırasında olanları eritmek için donmuş olanları değiştirin.
5. hazırlamakcerrahi yüzeyi. Plastik parafin film bir 5 cm x 10 cm parça kesin (4 ^cm2 olursa petri soğuk plaka kullanılarak) ve hareketsiz hale getirme cihazının merkezi üzerine yerleştirin. Bir lifsiz bir doku Katlama bir kare yaklaşık 2 ^cm2 olarak mendil ve filmin üzerine yerleştirin. Beyaz filtre kağıdı 1.5-2 ^cm2 'lik bir parça kesin ve mendilin üzerine yerleştirin. Şekil 1B-1E bakın.
   1. katlanmış tutun eldivenli parmak ile yerinde silin ve hafifçe katlanmış devam etmesini sağlamanın silin kırmak için solucan su kullanmayın. düz mendil rulo bir transfer pipeti kenarıyla.
      NOT: Soğuk sıcaklık hareket solucanlar tutmaya yardımcı olur. Çalışma "kuru" da hareketsiz hale yardımcı olur. Doku kurtlar (öldürücü olan) tamamen kurumasına izin vermeden, ameliyat sırasında nemli solucan tutarak, filtre kağıdı içinden su fitilleme eylemleri silin.

3. Cerrahi Ablasyon

1. Yerleştirmek üzere bir transfer pipet kullanınfiltre kağıdı üzerine, e solucan sırt tarafı yukarı. Işık kaynağını açın ve hafif solucan odaklanmış şekilde Goosenecks yönlendirmek. Gözleri (tüm solucan görünümünde olması gerekmez) açıkça görünecek şekilde diseksiyon kapsamı odağı ve büyütme ayarlayın; 5X büyütmede iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Kafa (mikroskop ön tarafına doğru) araştırmacı doğru işaret şekilde sağa doğru, açılı 30-40 derece parafin filmi döndürerek solucan döndürün.
   1. Aşırı solucan hareket etmesini önlemek için parlak ışık kullanımından kaçının. Planaryalar olumsuz phototaxis görüntülemek ve parlak ışık kaçmasına dener.
   2. Solucan (boğaz görünür açılış) yukarı bakacak şekilde ventral yana konumlandırılmış, yavaşça (gözleri görünür olan) sonsuz dorsal tarafına kadar yeniden konumlandırmak için forseps donuk tarafında kullanır. hayvan yeniden konumlandırma zaman yumuşak doku yoluyla yırtılma riskini en aza indirmek için forseps sivri ucu ile hayvanın yaklaşan kaçının.
2. O (başparmak ve işaret parmağı arasında) kalem sanki sağ elinde taze bir iğne / şırınga tutun. Peltier plakasına (veya Petri kabı soğuk plaka) karşı sola başparmak Brace ve şırınganın alt kısmı dinlenme olan bir dayanak noktası (Şekil 2A) ve sol baş kullanımı. Mikroskopla Bak ve iğne konik görünür olmasını sağlamak.
   NOT: İğneler çok keskindir. Onları tutarken dikkatli olun. lateks veya nitril eldiven giyerek biraz koruma sunabilir.
   1. prosedürü boyunca sürekli iğne / şırınga tutun yardımcı ve tokalaşarak önlemek için sol baş parmağını kullanın.
   2. Ameliyat yüzey stabil tutmak yardımcı olmak için sol başparmak ve (cerrahi yüzeyinde parmağı ile) sol işaret parmağı ile yaklaşık 40 ° 'lik bir açı olun.
3. İle(Kaşık gibi) yukarı doğru bakacak şekilde iğne konik, göz (Şekil 2B) dik açılarda iğne yerleştirin. yavaşça sağdan sola scooping gözün optik fincan (beyaz, pigmentsiz bölge) üzerinde uzanan doku ince tabaka nüfuz iğne ucu kullanın. Çok nazikçe dibe delinme veya optik fincan sınırlarını yok etmek değil dikkat ederek optik fincan içinde yer alan herhangi bir pigmentli dokuyu.
   1. Sonsuz işlemi sırasında herhangi bir noktada> 1-2 dakika için bir filtre kağıdı üzerinde kalmışsa, solucan rehidrate sonsuz bir su damla ekleyin.
      NOT: Dehidrasyon müthiş yaralanmalara solucanın duyarlılığını artıracaktır.
4. Tekrar siyah pigmentli dokularda (pigment hücreleri) her kadar adım 3.3, hem de optik fincan (fotoreseptör hücrelerinin dendritler) beyaz dokuların her olarak çıkarılır. dikkatli bir doku temizleme ile silerek iğnenin ucuna yapışmış kesilmiş dokuları çıkarın. çift ​​göz abla isesiyon, istenen bu noktada ikinci gözü baskılamak edilir.
   Not: zarar görmesini önlemek için, iğneler daha sonra silme uzak başparmak ve işaret parmağı arasından yoluyla iğne çekmek için diğer elini kullanarak, başparmak ve işaret parmağı ile yapılan mendil temiz bir doku ile iğne kavranarak temizlenebilir. Seçenek olarak ise, iğne ıslak bir doku temizleme yüzeyi üzerine sürülmüştür ve temizlik için incelenebilir.
5. Tamamlandığında taze solucan su içeren bir etiketlenmiş çanak solucan taşımak için bir transfer pipet kullanın. Grup verileri analiz için, bir tek 100 mm Petri tabağına 20 solucanlar yerleştirebilir. Zamanla aynı bireylerde rejenerasyonu izleme Eğer bir 12 plaka her kuyuya 1 solucan yerleştirin. Tüm solucanlar transfer edildikten sonra, tabaklar / kuyu tüm solucan suyun çıkarılması ve daha fazla taze solucan su ile değiştirerek solucanlar yıkayın.
   1. filtreden solucanlar kaldırmak için, sonsuz küçük bir su miktarı ile pipet backload ve solucan üzerine su bırakın. Bu t kaldırması gerektiğinifiltre kağıdı kapalı o solucan, derhal transfer için pipet içine emilmesine.
6. ışıktan korunmalıdır ~ 20 ° C (oda sıcaklığı) deneyleri inkübe edin ve rejeneratif süreci takip.
   NOT: Solucanlar sabit bir sıcaklıkta muhafaza etmek sıcaklık kontrollü inkübatör içinde saklanabilir, ancak bu kesinlikle gerekli değildir. Çoğu oda sıcaklıkları yeniden oluşturmak için solucan yeteneğini etkilemez 5 ° C, sadece değişir.
7. Arzu edildiği takdirde, imünohistokimya için solucan (Şekil 3-4) ve / ya da in situ hibridizasyon gen ekspresyonunun analiz düzeltmek. Farklı tespit yöntemleri planarian immünohistokimya ^{18, 19, 20} ve in situ melezleme ^{21, 22, 23} protokolleri bulunmaktadır.
8. Deneyler sonuçlandığı, sacrifice çanak sonsuz suyun çıkarılması ve% 70 etanol ile değiştirerek solucanlar canlı. parçalanması ve grimsi açmak için solucanlar için kontrol 3-5 dakika solucanlar inkübe edin.
9. bir kez kurban Normal atık olmayan tedavi solucanlar yerleştirin. çevre, özellikle yerli olmayan türlerin içine canlı solucanlar tanıtan kaçının.

Representative Results

ilk 1-2 saat sonra cerrahi, hayvanlar sağlam solucanlar (ancak yine de hareket edecek) ile karşılaştırıldığında hareket azalma gösterebilir. Arzu edildiği takdirde, solucanlar (RNAi beslenmesi için, örneğin) ameliyattan sonraki 24 saat içinde yiyeceklerdir. zamanla aynı bireylerde göz rejenerasyonu aşağıdaki, her iki ameliyat öncesi (bozulmamış) ve 1 saat sonrası ablasyon (HPA) her solucanın fotoğrafını çekmek için emin olun. 4 gün sonra ablasyonu (DPA) tarafından rejenere pigment hücreleri görünür olacak ve 14 tüm göz tamamen yeniden olacak DPA (Şekil 3A-B) göre olmalıdır. Bu fotoreseptör nöronlar ve beyin (Şekil 3C) innervasyonlu, hem de görsel sistemin (Şekil 4A-C) fonksiyonel iyileşmeyi içerir. Başarılı ablasyonlar beyin (Şekil 4D-E) altındaki dokulara rahatsız, ne de bir hayvan (Şekil 5A), diğer doku hasarlarına yol olmayacaktır. Başarısız ablasyonlarıventral epidermis (Şekil 5D) ile karıştırmak ve / veya yara sitesi, iki gözü (Şekil 5B) bağlayan bir hayvana (Şekil 5C) lateral kenar gözyaşları bir aşırı büyük eksizyon: ile hayvanları içerir. Bundan başka, başarısız ablasyonlar beyaz pigmentsiz doku ve siyah pigment hücreleri (Şekil 5E-F) her ikisiyle beraber oluşmakla tüm optik kabın tam olmayan bir ayrılmaya içerir.

Şekil 1: Cerrahi hazırlığı. (Buz ile doldurulmuş) 100 mm'lik bir Petri kabı alt ve (buz yüzeyde ters yerleştirilmiş) bir 60 mm Petri kabı kapağı kullanılarak soğuk levha yapı (A) Diyagram,. (Üstten alta doğru) beyaz bir filtre kağıdı, bir nemli katlanan doku silin, bir yığın ve parafin bir filmin imal cerrahi yüzeyi (B) Diyagram,.(C) (sağ elini kullanan için) kurmak cerrahi. C: kesme alanı, B: boynu aydınlatma, C: cerrahi yüzeyi, D: Peltier plakası, E: ablasyonu için hazır, 5-7 mm solucanların çanak, K: solucan su yıkama şişesi, G: çubuk kalan temiz transfer pipeti tutan H: çubuk kalan tutma iğne / şırınga, I: çubuk kalan forseps tutarak, J: Daha fazla aktarım pipetler kabı. (D) Özel Peltier plakası konfigürasyonu. (E) Petri kabı soğuk plaka konfigürasyonu. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2: ablasyon esnasında el ve iğne / şırınga pozisyonu. (Sağ elini kullanan için) ellerin (A) Yerleştirme. sol başparmak şırıngayı desteklemek için kullanılır unutmayın (düzenledisağ elinde) hareketini en aza indirmek için. Solucanın gözüne ilişkin iğnenin (B) Yerleştirme. iğne eğimli yüzeyi yukarıya bakacak unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3: ablazeydi planarian gözler yeniden. Schmidtea mediterranea morfolojisi (A) çift göz ablasyon ve (B) tek göz ablasyon aşağıdaki gözleri regrowing planaryadır. (C) İmmünohistokimya tek göz ablasyon aşağıdaki fotoreseptör nöronlar (anti-arrestin) yenilenmesini gösteren. Sağlam solucanlar ameliyattan önce gösterilir ve yeniler gün 4 ve ablasyon sonra 14 de gösterilmiştir. Tek göz ablasyon için, sol gözü olan birblated ve sağ göz bir iç (yaralanmamış) kontrol olarak hizmet vermektedir. Kırmızı ok başları: ablasyon gözler. Ölçek çubukları 100 um =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4: ablasyon sonra görsel sisteminin işlevsel geri kazanım. (A - C) Fonksiyonel deney planarian fotofobi test etmek. (A) Tam solucanlar, örneğin yeşil bir lazer işaretleyici bir nokta olarak ışık alanları üzerinden seyahat kaçının. 24 saat sonra ablasyonu 'de (B) "kör" çift göz kesilip solucanlar spotlu gezinir. 7 gün sonra ablasyon At (C), çift göz kesilip solucanlar ışık kaçınma kurtarmak için yeterince görsel sistemini rejenere olması. Sarı ok ucu: anormal davranışark yanıt. (D - D) Göz ablasyon optik bardağın doku ile sınırlı olduğunu, ve altta yatan beyin dokuları rahatsız etmez. (D), beyin mimarisi (anti-sinapsin) gösteren immünohistokimya 1 saat sonra ablasyon ablasyon önce değişmez. Hasarı gösteren bir enine kesit 1 saat sonra ablasyonu (e) hematoksilin ve eozin (H & E) boyama büyük ölçüde ablasyon optik fincan yerinde ile sınırlandırılmıştır. (Siyah pigment hücreleriyle) Sağ göz iç kontrol olarak hizmet vermektedir. Kırmızı ok başları: ablasyon gözler. Ölçek çubukları = (AC) 1 mm, 1 mm, 100 um (DE). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5: başarılı ve başarısız ablasyon önemli özelliklerinden. (A) Başarılı tek ve çift göz ablasyonları (5 dk sonrası ablasyon de) orijinal optik fincan boyut olarak kabaca benzer yaralar var. (B - D) Başarısız ablasyonlar: (B), çok fazla doku çıkarılır ya da yara ile iki gözü, (C), yara sitesi gözyaşı bağlanır ve marjı uzanan, yara çok derin ve (D) boyunca uzatıp ventral (D') yan ve (E - F) sırt (D), tüm optik kap dokuların çıkarılır, morfolojik (E) gözlendi ve fotoreseptör nöronlar (F), anti-arrestin boyama ile. Sarı ok başları: anormal ablasyonları. Sarı çevreler: ablasyon sitesi. Ölçek çubukları 100 um =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Discussion

Bu göz ablasyon tekniği beyin dokusu hariç ve göz dokuları için esas eksizyon kısıtlayarak (örneğin, delikli zımba gibi) mevcut yöntemlerle daha da iyileştirir. teknisyenler deneyimsiz ama vicdani lisans öğrencilerine microsurgeries yaşanan den uygulama ile, bu teknik, çoğu kişiler tarafından yapılabilir. Tekniğin önceki immünohistokimya ile ya da göz işaretçi (ler) ^{4, 5, 13} için in situ melezleme her göz dokuları tamamen çıkarılması (mümkün olduğunda) bir onay da dahil olmak üzere, deneylerde ablasyon kullanılarak birçok kez tatbik edilmesi tavsiye edilir. Bu protokolde en kritik adım dokuların dışarı scooping olduğunu. Çok fazla ya da çok az ya dokuyu kaldırmaz önemlidir. Bu solucanın ventral tarafına nüfuz önlemek için, iğne ile çok derinden scooping değil önlenebilir. nee ucudle sadece yaklaşık 0.4 mm derinliğinde eklenmesi gereken ve iğnenin eğimli kısmı tüm yol deliğinden geçmesi asla. Özel bakım iki göz arasındaki kırılgan dokuyu (her gözün siyah pigmentli bölgenin medial kenarı her gözün sınırlarını gösterir) zarar vermeyecek alınmalıdır. göz ve solucanın uzak farkla arasındaki Hasar de kaçınılmalıdır. Daha küçük solucanlar rip veya bilmeyerek yaralı olması daha olasıdır, bu nedenle daha büyük solucanlar (özellikle uygulama için) kullanılması tavsiye edilir. Bu tekniğin başlıca kısıtlamaları nispeten zaman alıcı (ve yüksek verimli taramalar için uygun olan) olduğu, ve bu sonuçların doğruluğunu sağlamak için pratik bir ilk yatırım gerektirir. Ancak, uygulama ile 10 gözü ~ 15 dakika içinde kesilip edilebilir.

Sorun giderme için önemli bir alan işlem sırasında hareketsiz Planaryalar uyum içindedir. iki ana nedeni solucan ablasyon gerçekleştirmek için yeterince hareketsiz değildirSoğuk sıcaklık: (a) çok fazla su ve (b) kaybı vardır. cerrahi yüzeyinde havuzları transfer solucanlar solucanlar taşımak ve cerrahi karmaşık izin vermekle birlikte, (A) aşırı planarian su. cerrahi yüzeyi (tüysüz bir doku silin ve filtre kağıdı) sadece nemli kalmalıdır. solucan, su ile doymuş hale silme işlemi sırasında herhangi bir noktada, ya değiştirilmelidir ya da bir transfer pipeti hafifçe silin dokudan fazla sıvıyı uzaklaştırmak için kullanılabilir (her zaman silme olup, filtre kağıdı çizmek). Doku mendiller ayrıca, cerrahi yüzeyi üzerinde fazla su havuzu çıkarmak için de kullanılabilir. Bu süreç solucanlar sayısı ablazeydi ediliyor bağlı olarak birçok kez tekrar edilmesi gerekebilir. (B) ayarlanmış bir petri tabağı, soğuk plaka kullanılarak durumunda, buz eritme başlar ve 60 mm Petri kabı kapağı dalgalanmaya başlar başlamaz, soğuk plaka yerine unutmayın. Bu şekilde dayanıklı bir cerrahi yüzey ve uygun şekilde soğuk bir yüzey temin edecektir. Alternatif olarak, Peltier plakası kullanılarak halindeKurmak kullanım 45 dakika ila 1 saat sonra, dış halkalar ısı merkezinde soğuk plaka üstesinden ve tüm soğutma kaybolur unutmayın. Bu durumda, bu ablasyon devam etmeden önce oda sıcaklığına gelmesini sağlamak için 5-10 dakika Peltier plakası kapatın.

sorun giderme başka alan tekrar çanak ve cerrahi yüzeyi ile arasındaki solucan transferi sırasında olduğunu. ablasyon solucanlar filtre kağıdı çıkarılması zordur, filtre kağıdı üzerindeki sıvı havuzları kadar solucanına sonsuz bir damla su koyun. Solucanlar daha sonra her zamanki gibi aktarma pipet içine emilebilir. Sorun devam ederse, (forseps donuk tarafını kullanarak) ilk ventral yüzü üzerine solucan saygısız deneyin. Bir solucan transferi pipet sıkışırsa, bu çok fazla su (solucanlar bir karış öteye transferi pipet içine çizilmelidir) kadar alınmış olduğunu bir işareti genellikle. Bir transfer pipet sıkışmış bir solucan kaldırmak için, solucan wat 1-2 mL hazırlamaker pipet içine, böylece solucan su ile kaplıdır. solucan pipet duvardan çıkarır ve yüzer kadar sıkıca pipet tarafını fiske.

İğne donuk hale gelirse, yeni bir iğne / şırınga ile değiştirin. ≥30 gözlerini olarak attığı kullandıktan sonra iğneyi değiştirmeyi düşünün. bir doku ile silerek rezeke dokuların aşırı çıkarma ablasyonlar daha zor hale da donuk bir iğne olabilir silin. rezeksiyon dokular (hatta birden hayvanlar arasında) prosedürü boyunca iğnenin eğimli kısmı dahilinde kalmak eğer tamamdır. Her zaman farklı koşullardan solucanlar arasında (örneğin doğal suş vs RNAi solucanlar) değiştirirken taze iğne / şırınga kullanmak, hem de (yani farklı günlerde) yeni ablasyon oturumları başlarken.

Bu durum bunların cerrahi göz ablasyon tekniği, özellikle, Planaryalar ışık kaynaklı davranışları (ve bunların genetik ve nörolojik temeli) araştırmak için güçlü bir araçtırfarmakolojik tedaviler veya RNA etkileşimi ile birlikte. Göz ablasyon in vivo olarak da endojen planarian göz yenilenmesi (ve göz kök hücre bakım ve farklılaşma) düzenleyen mekanizmaların ortaya çıkartılması için bir büyük bir araçtır. En omurgalılar planarya gelecekteki terapiler içine çeviri için olası mekanizmalar belirlenmesinde önemli olacaktır gözlerini yeniden edebiliyoruz nasıl anlamak göz dokularını yenilemek için çok sınırlı yetenekleri, sahip olduğundan.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional