मॉडलिंग के लिए सटीक सेलुलर पृथक्करण दृष्टिकोण Zebrafish के विकास में तीव्र किडनी चोट
Summary
यह काम गुर्दा जीएफपी ट्रांसजेनिक zebrafish का उपयोग कर कमानी किडनी की चोट के विवो मॉडल में एक नया प्रस्तुत करता है। मॉडल नेफ्रोन की चोट और मरम्मत के सेलुलर तंत्र दिखाने के लिए गुर्दा उपकला कोशिकाओं के लक्ष्यीकरण पृथक करने के लिए अनुमति देता है।
Abstract
तीव्र किडनी चोट (एसीआई) उच्च मृत्यु दर के साथ एक सामान्य चिकित्सा स्थिति है। गुर्दे की मरम्मत क्षमता के साथ, सहायक उपचार के बाद पर्याप्त गुर्दे की क्रिया को बहाल करना संभव है। हालांकि, सेलुलर स्तर पर नेफ्रॉन सेल की मौत और मरम्मत की प्रक्रिया को बेहतर ढंग से समझने के लिए सेल मृत्यु कम करने और पुनर्योजी प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए आवश्यक है। Zebrafish pronephros इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए एक अच्छा मॉडल प्रणाली है क्योंकि इसमें शारीरिक संरचना शामिल हैं जो स्तनधारी नेफ्रोन के समान हैं। इससे पहले, मछली में किडनी की चोट का अध्ययन करने वाला सबसे सामान्य मॉडल औषधीय सौम्यमिसिन मॉडल था। हालांकि, यह मॉडल चोट के सटीक स्टेटियोटेम्पोरल नियंत्रण की अनुमति नहीं देता है, और इसलिए किडनी की मरम्मत में शामिल सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करना मुश्किल है। इस सीमा को पार करने के लिए, यह काम एक विधि प्रस्तुत करता है, जिसके माध्यम से, जेनेमिसिन दृष्टिकोण के विपरीत, एक विशिष्ट ग्रीन फ्यूरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) -एक्सदबाने वाले नेफ़्रॉन सेगमेंट को वायलेट लेजर लाइट (405 एनएम) का उपयोग कर फोटोशोलेट किया जा सकता है। ए.के.आई. का यह उपन्यास मॉडल कई फायदे प्रदान करता है कि उपकला चोट के अन्य तरीकों की कमी है। इसका मुख्य लाभ चोट स्तर के "डायल" और विवो पशु मॉडल में मजबूत में सटीक spatiotemporal नियंत्रण की क्षमता है। इस नई विधि में गुर्दे की चोट और मरम्मत तंत्र की समझ के स्तर को महत्वपूर्ण रूप से आगे बढ़ाने की क्षमता है।
Introduction
तीव्र किडनी चोट (AKI) 1 , 2 , जिसे तीव्र गुर्दे की विफलता के रूप में भी जाना जा सकता है, को मोटे तौर पर गुर्दे की क्रिया 3 में अचानक हानि के रूप में परिभाषित किया गया है। हालांकि इस शर्त की समझ के स्तर को वर्षों से उल्लेखनीय रूप से बढ़ाया गया है, रोग और मृत्यु दर उच्च 1 , 2 बनी हुई हैं। इस स्थिति के लिए वर्तमान उपचार ज्यादातर सहायक है, क्योंकि ड्रग थेरेपी के कई नैदानिक परीक्षणों के परिणाम नकारात्मक 4 , 5 हैं । गुर्दा अद्वितीय है क्योंकि इसमें स्वयं की मरम्मत करने की क्षमता है। अतः, एसीआई के शुरुआती निदान के बाद सहायक चिकित्सा रुग्णता 6 को सीमित करने का सबसे अच्छा तरीका है। हालांकि, एकेआई को जल्दी से पहचानना मुश्किल है, और मृत्यु दर उन लोगों के लिए एक चौंका देने वाला 50-80% है, जिनके लिए डायलिसिस 5 की आवश्यकता होती है। इस स्थिति के लिए गुर्दे की अपनी क्षमता और इलाज के विकल्प की कमी की क्षमता के साथ, इस नेफ्रोन पुनर्जनन प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए तरीकों का विकास करना महत्वपूर्ण है।
AKI अनुसंधान के लिए कई अलग-अलग मॉडलों का इस्तेमाल किया गया है जिसमें चोट और जानवरों के मॉडल के विभिन्न एजेंट शामिल हैं। किडनी के नुकसान के एजेंट के संदर्भ में, एमिनोग्लिक्साइड एंटीबायोटिक gentamicin का उपयोग नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट के रूप में किया गया है जो AKI 7 , 8 की ओर जाता है। हालांकि, कई समूहों ने पाया है कि गर्भनिरोधक उपचार zebrafish भ्रूण 9 के लिए घातक है। यह नलिकात्मक क्षति का कारण बनता है जो भ्रूण की वसूली के लिए बहुत गंभीर है, बिना किसी प्रकार के हस्तक्षेप के उत्थान के अध्ययन को मुश्किल बनाते हैं। स्तनधारी मॉडल, जैसे माउस और चूहा, को मूल्यवान माना जाता है, लेकिन उन्हें AKI के अध्ययन के दौरान कई सीमाएं मिलती हैं। शायद कृंतक मॉडल का मुख्य नुकसान विज़ुआ में कठिनाई हैकृंतक किडनी को ले जाने और इस प्रकार सटीक स्टेतिओटेमोरल प्रक्रियाओं का निर्धारण करना जो उपकला मृत्यु और मरम्मत की ओर अग्रसर होता है
जॉनसन एट अल भ्रूण और लार्वा zebrafish 9 में तीव्र गुर्दा की चोट के लिए प्रेरित करने के लिए एक लेजर पृथक-आधारित तकनीक की सूचना दी है। डेक्सट्रान संयुग्म के साथ इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के बाद वे गुर्दे को नुकसान पहुंचाने के लिए स्पंदित लेजर पृथक्करण का इस्तेमाल करते थे। डेक्सट्रान संयुग्म से प्रतिदीप्ति, ट्यूबुल एपिथेलियम 9 में क्षति और उत्थान के दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह मॉडल ऊपर उल्लिखित दो सीमाओं पर काबू पाता है, लेकिन यह चोट के वर्गीकृत स्तरों की अनुमति नहीं देता है और बड़े, मनमाना सेल समूहों पर काम करना मुश्किल है।
यहां वर्णित ए.के.आई. के नए लेजर पृथक-आधारित ज़ेब्राफी मॉडल ने सभी उपरोक्त सीमाओं को संबोधित किया। लैर्वल ज़ेब्राफिश में प्रमेफ्रिक किडनी एक परिपक्व, कार्य अंग है जिसमें स्तनधारी के समान खंड शामिल हैंएक ग्लोमेरुलस, प्रॉक्सिमल और डिस्टल नलिकाएं, और एक कलेक्शन डक्ट 10 सहित फ़ोरन ज़ेबराफिष लार्वा भी ऑप्टिकली पारदर्शी हैं, जिससे कि प्रतिदीप्ति तकनीक के माध्यम से गुर्दे का पालन करना संभव है। इस प्रकार, zebrafish AKI के vivo मॉडल में एक मूल्यवान हैं , और गुर्दा की चोट और मरम्मत में शामिल सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लार्वा प्रमेफ्रिक किडनी (5-12 दिन-बाद के निषेचन (डीपीएफ) का उपयोग किया जा सकता है
यह पत्र एक ऐसी विधि को प्रस्तुत करता है जिसके द्वारा विशिष्ट ग्रीन फ्लूरोसेन्ट प्रोटीन (जीएफपी) -छोटे जा रहे नेफ़्रोन सेगमेंट को कम-ऊर्जा (स्पंदित-लेजर सिस्टम की तुलना में) वायलेट लेजर लाइट (405 एनएम) का उपयोग कर फोटोशोलेट किया जा सकता है। GFP प्रतिदीप्ति जीएफपी फोटोबलीचिंग के अवलोकन के माध्यम से दिखाई देने वाले बदलावों को बनाने के लिए, कोशिकाओं के समूह के लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है। इसके अलावा, जीएफपी (वायलेट प्रकाश को अवशोषित करके) जीएफपी-व्यक्त गुर्दा कोशिकाओं में चोट को मजबूत करने के लिए एक ऊर्जा सिंक के रूप में कार्य करता है। समय चूक माइक्रोफिर कॉपी की मरम्मत प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। अध्ययनों में सेल प्रसार, सेल प्रवासन, और सेल मेटाप्लासिलिया 11 , 12 , 13 को सभी संभावित प्रक्रियाएं मिल सकती हैं जो कि गुर्दा की मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं। हालांकि, इन प्रक्रियाओं के सापेक्ष महत्व और उनके परस्पर क्रिया का विवरण ए.के.आई. के मौजूदा मॉडलों की सीमाओं के कारण उजागर करना मुश्किल हो गया है। इस उपन्यास के दृष्टिकोण का प्रयोग करना, यह दिखाना संभव था कि तीव्र क्षति के बाद सेल माइग्रेशन गुर्दे की मरम्मत में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सिस्टम के बीच कुल लेजर शक्ति भिन्न होती है हालांकि, प्रतिशत जीएफपी फोटोबलीचिंग का उपयोग लेसर शक्ति में भिन्नता से स्वतंत्र फ्लोरोसेंट किडनी को दिया जाने वाली कुल ऊर्जा के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम गुर्दा जीएफपी ट्रांसजेनिक लाइनों को साझा करने के लिए डॉ। इयान ड्रमोंड और डा। व्लादिमीर कोर्ज को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम यह काम करने के लिए आवश्यक संसाधन उपलब्ध कराने के लिए भी NYITCOM को धन्यवाद देना चाहेंगे। यह अध्ययन अनुदान द्वारा समर्थित था: K08DK082782, R03DK097443 (एनआईएच), और एचएससीआई पायलट अनुदान (ए वी)।
Materials
| Petri Dishes, 35 x 10mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4,2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
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