Summary
Dit werk presenteert een nieuw in vivo model van segmentale nierbeschadiging met behulp van transplantale zebravis van GFP van de nieren. Het model zorgt voor de inductie van de gerichte ablatie van nierepitheelcellen om de cellulaire mechanismen van nephron letsel en reparatie te tonen.
Abstract
Acute nierbeschadiging (AKI) is een algemene medische aandoening met een hoge sterftecijfer. Met de herstelmogelijkheden van de nier, is het mogelijk om een adequate nierfunctie te herstellen na ondersteunende behandeling. Echter, een beter begrip van hoe nefroncel dood en reparatie op het cellulaire niveau optreden is nodig om de cel dood te minimaliseren en het regeneratieve proces te verbeteren. De zebravis pronephros is een goed model systeem om dit doel te bereiken omdat het anatomische segmenten bevat die vergelijkbaar zijn met de zoogdiernefron. Voorheen was het meest voorkomende model dat nierbeschadiging bij vis bestudeerde, het farmacologische gentamicine model. Dit model staat echter niet toe voor een nauwkeurige spatiotemporale controle op letsel, en daarom is het moeilijk om cel- en moleculaire processen die betrokken zijn bij nierherstel, te bestuderen. Om deze beperking te overwinnen, presenteert dit werk een methode waarbij, in tegenstelling tot de gentamicine-aanpak, een specifiek Groene Fuorescerende Proteïne (GFP) -exexHet drukken van nefronen kan worden gefotografeerd met behulp van een violet laserlicht (405 nm). Dit nieuwe model van AKI biedt vele voordelen die andere methoden van epitheliaal letsel ontbreken. De voornaamste voordelen hiervan zijn de mogelijkheid om het niveau van letsel te "dialeren" en de precieze spatiotemporale controle in het robuuste in vivo diermodel. Deze nieuwe methode heeft het potentieel om het niveau van begrip van nierbeschadiging en herstelmechanismen aanzienlijk te bevorderen.
Introduction
Acute nierbeschadiging (AKI) 1 , 2 , die ook kan worden aangeduid als acuut nierfalen, wordt algemeen gedefinieerd als een plotselinge aandoening bij nierfunctie 3 . Hoewel het niveau van begrip van deze aandoening in de loop der jaren opvallend verbeterd is, zijn de morbiditeit en sterftecijfers hoog 1 , 2 gebleven. De huidige behandeling voor deze aandoening is meestal ondersteunend, aangezien de resultaten van meerdere klinische proeven van geneesmiddelentherapie negatief zijn geweest, 4 , 5 . De nier is uniek omdat het het vermogen heeft zich te herstellen. Daarom is ondersteunende therapie na een vroege diagnose van AKI de beste manier om morbiditeit 6 te beperken. Het is echter moeilijk om vroegtijdig AKI te detecteren en de sterftecijfer is een vervelende 50-80% voor degenen die dialyse 5 nodig hebben. Met het vermogen van de nieren om zichzelf te repareren en het gebrek aan behandelingsopties voor deze conditie, is het belangrijk om methoden te ontwikkelen om dit nefronregeneratieproces te verbeteren.
Er zijn veel verschillende modellen gebruikt voor AKI onderzoek dat verschillende agenten van letsel en diermodellen omvat. Wat betreft agens van nierschade is het aminoglycoside antibiotica gentamicine gebruikt als een nefrotoxisch middel dat leidt tot AKI 7 , 8 . Echter, verschillende groepen hebben gevonden dat gentamicin behandeling dodelijk is voor het zebravis embryo 9 . Het veroorzaakt tubulaire schade die te ernstig is voor embryoherstel, waardoor de studie van regeneratie moeilijk is zonder enige vorm van interventie. Zoogdierenmodellen, zoals de muis en de ratten, worden ook als waardevol beschouwd, maar ze worden geconfronteerd met vele beperkingen tijdens de studie van AKI. Misschien is het grootste nadeel van knaagdiermodellen het probleem in visuaHet nieren van de knaagdier lanceren en daarmee de precieze spatiotemporale processen bepalen die leiden tot epitheliale dood en reparatie.
Johnson et al. Hebben een laser ablation-gebaseerde techniek aangemeld om acuut nierbeschadiging in embryonale en larvezebravis 9 te veroorzaken. Ze gebruikten pulsed laser ablation om de nier te beschadigen na een intramusculaire injectie met dextran conjugaten. De fluorescentie van dextranconjugaten zorgt voor het visualiseren van schade en regeneratie in het buisepitheel 9 . Dit model overwint de bovengenoemde twee beperkingen, maar staat niet toe voor gegradeerde niveaus van letsel en kan moeilijk worden uitgevoerd op grote, willekeurige celgroepen.
Het nieuwe laserablation-gebaseerde zebravismodel van AKI dat hier beschreven is, adresseert alle bovengenoemde beperkingen. De pronephrische nier in de zebravis van larve is een volwassen, functioneel orgaan dat segmenten bevat die vergelijkbaar zijn met de zoogdieren nePhron, inclusief een glomerulus, proximale en distale buisjes, en een verzamelkanaal 10 . Zebravis larven zijn ook optisch transparant, waardoor het mogelijk is om de nier te waarnemen door middel van fluorescentietechnieken. Zebravis zijn dus een waardevol in vivo model van AKI, en de larve pronephrische nier (5-12 dagen post-fertilisatie (dpf)) kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire processen die betrokken zijn bij nierletsel en reparatie te bestuderen.
In dit artikel wordt een methode beschreven, waarbij specifieke Nefron-segmenten van het Groene Fluorescerende Proteïne (GFP) -expressie kunnen worden gefabriceerd met behulp van een licht-energie (in vergelijking met een pulserend laser systeem) violet laserlicht (405 nm). De GFP-fluorescentie zorgt voor de targeting van een groep cellen, waardoor de veranderingen die optreden zichtbaar zijn door de waarneming van GFP photobleaching. Daarnaast dient GFP (door het absorberen van violet licht) als een energiezink om het letsel in GFP-expressieve niercellen te versterken. Time-lapse microsKopie kan dan gebruikt worden om het reparatieproces te bestuderen. Studies hebben cel proliferatie, celmigratie en celmetaplasia 11 , 12 , 13 gevonden voor alle mogelijke processen die een belangrijke rol kunnen spelen bij nierherstel. Het relatieve belang van deze processen en de details van hun wisselwerking is echter moeilijk te ontdekken door de beperkingen van bestaande modellen van AKI. Met behulp van deze nieuwe aanpak was het mogelijk om te laten aantonen dat celmigratie een centrale rol speelt bij nierherstel na acuut letsel 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie is uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren van de nationale instituten van gezondheid. Het protocol werd goedgekeurd door het NYIT College of Osteopathic Medicine Institutioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee (NYITCOM IACUC). Alle operaties en in vivo experimenten werden uitgevoerd onder tricine verdoving, en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren.
1. Het verkrijgen en handhaven van embryo's
- Verkrijg embryo's door het oversteken van nier GFP fluorescerende zebravis.
OPMERKING: Voorbeelden van fluorescent gelabelde zebravis transgene lijnen staan vermeld in tabel 1 . - Houd de embryo's bij 28,5 ° C in de E3-oplossing gedurende de 24 uur na bevruchting.
- Na 24 uur vervang het medium met een E3-oplossing die 0,003% 1-fenyl-2-thioureum (PTU) bevat.
OPMERKING: PTU wordt gebruikt omdat het de tyrosinase-afhankelijke stappen blokkeert bij melanogeneseEn voorkomt daarom pigmentatie. Hier wordt deze oplossing aangeduid als E3-PTU. - Verhoog de bevruchte embryo's bij 28,5 ° C tot ze> 6 dpf zijn, op welk punt de nieren zijn gerijpt.
OPMERKING: Het is het beste om larven in het 7-9 dpf venster te gebruiken. - Met behulp van een fluorescerende dissectiemicroscoop bij 40X vergroting en groene fluorescentie-emissiefilters, selecteer de larven met fijne GFP fluorescentie.
2. Zebravis monteren voor Live-imaging
- Als u de embryo's voor 3 dpf photoablating verwijdert, moet u de chorion van ongehakte zebravis verwijderen voordat u de zebravis voor het afbeelden installeert.
- Handmatig verankeren met tang (bij voorkeur) of gebruik een chemische behandeling met een protease mengsel.
OPMERKING: Dechorinatie zorgt voor de beste afbeeldingsresultaten.
- Handmatig verankeren met tang (bij voorkeur) of gebruik een chemische behandeling met een protease mengsel.
- Spoel de chorion puin in de petri schotel uit met behulp van E3-PTU oplossing en vul de schotel met E3-PTU.
- PrepaRe 1-2% laagmeltpunt (LMP) agarose met 0,2 mg / ml tricine oplossing om de zebravis te monteren voor nierfotoablation en live imaging.
- Als LMP agarose al eerder was voorbereid, verwarm het het in de magnetron om het te smelten.
- Zodra de LMP-agarose is bereid, plaats een 35 mm kunststof petrischaal op een dissectiemicroscoop. Plaats een getrokken glas sonde in de buurt om de verdovende larven goed te oriënteren.
OPMERKING: Het is belangrijk om deze stap tijdig te doen en alles op zijn plaats te hebben, omdat de embryo's moeten worden georiënteerd voordat de agarose ongeveer 1-3 minuten verdampt. - Alvorens het embryo naar de agarose over te brengen, zorg ervoor dat de agarose koel is ( dwz bij ongeveer lichaamstemperatuur). Gebruik een plastic of glasoverdrachtpipet om het embryo in de afgekoelde, gesmolten agarose-tricaïneoplossing te plaatsen.
OPMERKING: dit is gedaan omdat het te warm agarose kan zijn voor het embryo, wat leidt tot hartstilstandOf de dood - Herhaal het embryo in de agaroseoplossing met behulp van een transferpipet en plaats het embryo / larve in het midden van een 35 mm schotel.
- Verspreid de agarose die het embryo / larve bevat, snel om de bodem van de 35 mm schaal gelijkmatig te bedekken; Het beste volume agarose dat u wilt gebruiken is ~ 1-1,1 ml.
- Gebruik de glazen sonde om het embryo zo goed mogelijk te positioneren voor fotoablation en beeldvorming.
OPMERKING: Film 1 toont de beste oriëntatie van het embryo / larve voor eenzijdige fotoablation. Deze stap is het meest tijdgevoelig en moet snel worden uitgevoerd voordat de agarose begint te gel, omdat elke poging om de vis te heroriënteren na het gelijmd begint, schadelijk is.- Richt de larve zo op dat het nieren segment van belang loodrecht op het straalpad ligt, terwijl het contralaterale segment weg is van de laserstraal (zie film 1 ).
OPMERKING: dit kan worden bereikt door de larve te draaien zoals getoond in film 1 . - Laat ongeveer 15 minuten voor de agarose stollen. Bedek de petri schotel om verdamping te minimaliseren. Zodra de agarose is verstevigd, is het embryo of de larve klaar voor fotoablation.
3. Laser Ablatie
- Bedien het confocale beeldvormingssysteem.
OPMERKING: Bij gebruik van het beoogde beeldvormingsplatform (zie de materialenlijst) omvatten de aanbevolen instellingen 40X vergroting, een 0,8 NA waterdichtingslens en de eerste dichroische spiegelinstelling om zowel de 488 als 405 nm-verlichting van het monster toe te staan. De detectie moet op het groene kanaal worden uitgevoerd. - Plaats de schotel die de geïmmobiliseerde zebravis bevat in een confocale fase.
OPMERKING: Deze procedure is geoptimaliseerd voor de oprechte configuratie met een 40-60X waterdichtingslens. Het zou echter mogelijk zijn om de procedure voor een omgekeerde microscoop te wijzigen. - Plaats in de oprechte configuratie de petrienschaal die het embryo op een microsc bevatOpen schuif en houd het op zijn plaats met behulp van modellerende klei ( bijv. Plasticine). Plaats de glazen glijbaan met de petrischaal op het stadium van de confocale microscoop.
- Voeg 3 ml van de beeldoplossing E3-PTU toe (zie stap 1.3) met 0,2 mg / ml tricaïne.
OPMERKING: De beeldoplossing kan ook onmiddellijk worden toegevoegd voordat u de dia op het podium plaatst. De toevoeging van beeldoplossing moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat de agarose van de bodem van de schotel drijft. - Overschakelen naar de waterdichtingslens (40 of 60X). Zet het podium langzaam op, zorg ervoor dat de lens iets schuin is om te voorkomen dat de lucht in het straalpad wordt gevangen. Zodra de lens de oplossing tegen een hoek aanraakt, centreer het zo in het oogpunt van de embryo's.
- Vind het segment van belang met behulp van de fluorescentie lichtbron. Oppervlakkige positie van de tak gericht op letsel om de lichtverdeling te minimaliseren (zie Film 1 ).
OPMERKING: De subsequenT stappen maken gebruik van verwijzende software (zie de Tabel van Materialen), maar de procedure kan gemakkelijk aangepast worden aan andere platforms. - Open de software. Navigeer naar "Bekijken" | "Acquisitiecontrole" | "C2plus Compact GUI" en stel de "pixel dwell time" in op "1.9 μs," "frame size" tot "512 x 512 pixels" en "pinhole size" tot "90 μm." Stel '405 nm (of 408 nm in sommige systemen) laserintensiteit' op nul en '488 laserintensiteit' tot 'laag' (bij voorkeur <1%). Pas de 'gain' aan om een goed dynamisch bereik te krijgen, maar niet om het signaal te verzadigen.
OPMERKING: Deze waarden zijn niet kritisch en worden gebruikt voor consistentie. Wanneer een 405 nm laser wordt gebruikt, zal het resulteren in toenames in GFP fluorescentie. Om verzadiging van het signaal tijdens fotoboekvorming te vermijden (stap 3.11), moet de signaalversterkingswaarde op het groene kanaal worden afgebroken. De blauwe kanaalwinst kan op nul worden gelaten, omdat het niet wordt gebruikt voor sampling. - Klik op "Scan" in de software interface om de nier te scannen met een 488 nm laser. Vind het segment van belang die loodrecht op het straalpad ligt en dat is goed zichtbaar, met goede GFP-fluorescentie. Zodra die regio is geïdentificeerd, teken een regio van interesse met behulp van een elliptische regio-of-interest (ROI).
- Navigeer naar "ROI" | "Teken elliptische ROI."
OPMERKING: dit wordt gebruikt om de gemiddelde GFP-intensiteit doorlopend te meten terwijl de fotolakering plaatsvindt, waardoor een nauwkeurige dosis laserbehandeling wordt toegediend.
- Navigeer naar "ROI" | "Teken elliptische ROI."
- Navigeer naar "Bekijken" | "Acquisitiecontroles" | "C2plus Scan Area" en kies "Band Scan Area." Het rechthoekige masker verschijnt binnen die interface. Handmatig een rechthoekig scanvenster definiëren met behulp van de cursor ( dwz slepen, resizeer en draai het masker) om het segment te dekken die gericht is op laserablation. Klik met de rechtermuisknop in deMasker gebied om de selectie te accepteren.
OPMERKING: Alleen de geselecteerde regio wordt gescand. - Begin de tijdmeting terwijl u het groene kanaal opvolgt met alleen de 488 nm laser om GFP te activeren. Zorg ervoor dat de intensiteit van de 488 laser relatief laag is (~ 1%). Meet de gemiddelde intensiteit van de GFP in het gebied van interesse door "Meet" te selecteren Tijdmeting. Gebruik de tabbladen 'Grafiek' of 'Gegevens' om de gemiddelde intensiteitswaarden in de ROI te controleren.
OPMERKING: De aanschafsnelheid wordt bepaald door de pixel wachtijd en de grootte van het rechthoekige venster in stap 3.9, maar in het algemeen staat het voor de snelle controle van het signaal (~ 2-10 frames / s). - Schade aan de niercellen met de violette laser (405 nm) veroorzaken door de intensiteit te verhogen tot 100% door de "laser power" -regelaar helemaal naar rechts te schuiven. De 488 nm laser kan actief blijven als de intensiteit laag is.
- Let op een lijn gRaph met behulp van het tabblad "Grafiek" of de numerieke waarden van GFP intensiteit met behulp van het tabblad "Data" en wacht tot het naar een gewenst niveau druppelt, bijvoorbeeld 50% van de basislijn (zoals weergegeven in Figuur 1 ).
OPMERKING: een 20 mW laser is gebruikt als onderdeel van de referentie laser eenheid (zie de tabel van materialen ); Maximale intensiteit kan variëren tussen systemen. Lagere intensiteit kan gecompenseerd worden door langere blootstelling ( dwz het gebruik van percentage GFP bleken als een maat voor totale blootstelling).
- Let op een lijn gRaph met behulp van het tabblad "Grafiek" of de numerieke waarden van GFP intensiteit met behulp van het tabblad "Data" en wacht tot het naar een gewenst niveau druppelt, bijvoorbeeld 50% van de basislijn (zoals weergegeven in Figuur 1 ).
- Zodra de GFP-intensiteit binnen de elliptische ROI (stap 3.8) op een gewenst niveau is gedaald, vermindert de intensiteit van de violet (405 nm) laser onmiddellijk naar "0" door de schuifregelaar "laser power" helemaal naar links te verplaatsen Het software-bedieningspaneel.
- Verkrijg een nieuwe basislijn van GFP fluorescentie. Bevestig de ablatie door een verhouding van X / Y te verkrijgen.
OPMERKING: zie figuur1B; Y = gemiddelde intensiteit voor de ablatie en X = gemiddelde intensiteit na de ablatie, waarbij gemiddeld 4 opeenvolgende monsters binnen de ROI worden gebruikt. De exacte doelverhouding (50%, 60%, enz .) Hangt af van de hoeveelheid letsel die gewenst is voor een bepaald experiment.
- Verkrijg een nieuwe basislijn van GFP fluorescentie. Bevestig de ablatie door een verhouding van X / Y te verkrijgen.
4. Time-lapse Microscopy Met Propidium Iodide Staining
- Toepassen algemene overlijdensoverwegingen (omschreven in een eerdere studie 15 ) voor het visualiseren van propidiumjodide-kleuring als een correlaat van niercelletsel na fotoablation.
- Pre-incubeer de larven in 30 μM propidiumjodide oplossing (1% DMSO in E3-PTU) gedurende 3 uur voorafgaand aan inbedding en fotoablation, zoals beschreven in respectievelijk stappen 2 en 3.7.
OPMERKING: Er is geen extra propidiumjodide nodig in de agarose of de beeldvorming oplossing. - Zorg voor segmentale nierbeschadiging, zoals beschreven in stappen 3.1-3.12.
- Verkrijg tijdverliesbeeldstapels, zoals beschrijvingenBed in een eerdere studie 14 , met behulp van een 488 nm laser (GFP) en een 461 nm laser (Propidium Iodide, PI).
OPMERKING: De twee kleuren liggen in confocale stapels om de verdwijning van GFP en het verschijnen van propidiumjodide-kleuring te correleren. - Stel de parameters in voor het verkrijgen van de time-lapse beeldstapels als volgt: virtuele schijfdikte = 4 μm, z-stapelinterval = 2 μm, pixelvertragingstijd = 1,9 μs, afbeeldingsafmetingen = 512 x 512 en gemiddeld = 2.
OPMERKING: Deze parameters zorgen voor een continue, 10 tot 15 minuten interval opname van maximaal 4 larven en zorgen ervoor dat er minimaal fotobleken van het monster is. - Gebruik afbeeldingssoftware die compatibel is met het opnamebestandsformaat om de data te visualiseren en te analyseren.
- Richt de larve zo op dat het nieren segment van belang loodrecht op het straalpad ligt, terwijl het contralaterale segment weg is van de laserstraal (zie film 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Houd er rekening mee dat dit protocol succesvol is gebruikt met een aantal transgene GFP transgene lijnen, waaronder ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 en Tg (atp1a1a.4: GFP). De hier weergegeven voorbeeldresultaten werden verkregen met behulp van de ET (krt8: EGFP) sqet11-9 lijn.
Figuur 1 toont het voorbeeld photoablation protocol. De gemiddelde GFP-intensiteit wordt gecontroleerd in het gebied van belang ( Figuur 1A en Film 1 ). Een voorbeeld gemiddelde intensiteitsspoor is weergegeven in figuur 1B .
Zoals blijkt uit Figuur 2 , blijft de GFP-fluorescentie na blootstelling aan 405 nm laserlicht een cel tegelijk verdwijnen totdat tot 220 minuten het gehele ablatie-segment 100% van zijn GFP-positiviteit verliest. Dit verlies van GFP fLuorescentie is inderdaad te danken aan de dood van de cel en niet, bijvoorbeeld, de downregulatie van GFP expressie. Dit blijkt uit het verschijnen van rode fluorescerende propidiumjodide-positieve kernen in de cellen die GFP-positiviteit verliezen.
De mate van celdood kan worden beoordeeld door middel van gemiddelde GFP-fluorescentie in het geablateerde segment en vergelijken met de gemiddelde GFP-intensiteit direct voor en achteraf naar het geablateerde segment. Figuur 3 toont de relatie tussen de mate van laserblootstelling (gemeten door de initiële hoeveelheid fotobladen) en de mate van celdood in het blootgestelde segment. Het blijkt dat, door de initiële blootstelling te variëren, het mogelijk is om de verwonding en de reactie van het gewonde epithel te "dialeren". Met 10-20% van de initiële GFP fotoblokken wordt nagenoeg geen vermindering van GFP positiviteit waargenomen na 5 uur na verwonding. 50 en 60% fotobleaching leidt tot een complete afwezigheidAroma van GFP om 5 uur, terwijl 30 en 40% bleken leidt tot tussentijdse resultaten, met 50% geschatte sterfte waargenomen bij ongeveer 35% fotobleaching. Deze resultaten worden ondersteund door PI-kleuring ( Figuur 3B ). 20% photobleaching resulteert in vrijwel geen PI-kleuring bij 100 minuten na ablatie. 50% fotobleaching leidt tot continue PI positiviteit in het ablateerde epithelium na 60 minuten, terwijl 30 en 40% fotobleaching leidt tot intermediaire PI-integratie. Zoals uit deze gegevens blijkt kan deze methodologie de inductie van gegradeerde hoeveelheden epitheliaal letsel en voor de studie van het epitheliale respons op dodelijke en sublodale epitheliale schade toestaan.
Figuur 1: Photoablation Procedure. ( A ) Schematische weergave van embryo / larve oriëntatie, laserblootstelling en de regio-of-interest (ellips) meetUrement van de gemiddelde fluorescentie om de hoeveelheid GFP photobleaching te monitoren; Zie film 1. Het rechthoekige vak geeft het scanvenster aan. ( B ) Een voorbeeld van een feitelijke gemiddelde belangstelling voor de GFP-intensiteit van de belangeninterval voor, tijdens en na 405 nm laserblootstelling. Gemiddelde GFP intensiteiten op vier opeenvolgende metingen (getoond in groene dozen) worden voor (Y) en na (X) de fotoablation getoond. De verhouding X / Y wordt gebruikt als een maat voor de totale lichtbelichting en is getekend op de X-as in Figuur 3 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Epitheliale celdood na 405 nm laserblootstelling. Voorbeeld sequentiële frames die het verdwijnen van GFP an tonenD het verschijnen van propidiumjodide kleuring na photoablation (40% initial photobleaching). De frames zijn op 0, 130, 170 en 220 minuten na het licht van de violetlicht (405 nm). Het verdwijnen van GFP valt samen met de verschijning van rode fluorescerende PI nucleaire positiviteit. Let op dat PrI fluorescentie wordt gedetecteerd door gebruik te maken van het rode kanaal. De rode fluorescentie die buiten de nier wordt gezien, is te wijten aan chromoforen en de aanwezigheid van PI in de darmlumen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dosisrespons van epitheliale schade aan het aantal fotoablatie. ( A ) Photoablation wordt gemeten door het percentage initiële reductie in GFP fluorescentie in de exposEd segment. Dit wordt vergeleken met de afname van de gemiddelde GFP fluorescentie in het gewond segment bij 5 uur na het letsel. Deze meting wordt genormaliseerd aan de gemiddelde hoeveelheid fluorescentie stroomopwaarts en stroomafwaarts van het gewond segment. Doeldoseringen waren 10, 20, 30, 40, 50 en 60% van de initiële photobleaching. De werkelijke hoeveelheden zijn iets groter, wat 14,8, 24,4, 33,8, 45,4, 56,5 en 62,1% bedraagt, waardoor 85,2, 75,6, 66,2, 54,6, 43,5 en 37,9% resterende fluorescentie, n = 2 - 6 / doelwit groep. De foutbalken vertegenwoordigen de standaardafwijking langs de X (procent van de resterende fluorescentie onmiddellijk na photoablation) en Y (procent van de resterende fluorescentie 5 uur na fotoablation) assen. ( BE ) PI-kleuring komt overeen met de totale verdwijning van GFP-positiviteit. Vrijwel geen PI-kleuring wordt waargenomen bij 20% (80% resterende fluorescentie) fotolakering bij 100 minuten post-laser blootstelling ( B , rechter paneel). ( C en
| transgene | Expressiepatroon | Referenties |
| Tg (wt1b: GFP) | Glomerulus, wat PT | [11] |
| Tg (atp1a1a.4: GFP) | Distaal voor glomerulus | [12] |
| Tg (cdh17: GFP) | Distaal voor glomerulus | [9,10] |
| Tg (ret1: GFP) | Laat DT, PD | [13] |
| Tg (enpep: GFP) | Distaal voor glomerulus | [14] |
| Tg (CD41: GFP) | Multicilieerde cellen | [15] |
| ET (krt8: EGFP) sqet11-9 | Rechte PT, vroege DT | [16,17] |
| ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 | Convolute PT | [16,17] |
| PT = Proximale Tubule | ||
| DT = Distale Tubule | ||
| PD - Pronephric Duct |
Film 1: Animatie Samenvatting van de Photoablation Procedure. In het eerste deel van de film wordt de juiste embryo / larve oriëntatie aangetoond. De twee niertakken worden groen weergegeven. Een glazen sonde wordt gebruikt om de vis in agarose te oriënteren. Dit gebeurt als een controle, niet-gewonde tak gewenst is. Hengelen van de vis maakt het mogelijk om blootstelling aan laser op slechts één tak van de pronephrische nier bloot te leggen. In het tweede deel van de film wordt de laser ablation procedure beschreven. De ellips geeft aan dat het gebied van belang is in het segment dat ablatie ondergaat, die gebruikt wordt om de hoeveelheid initiële photobleac te controlerenhing. Het rechthoekige venster zorgt voor een nauwkeurige aanpassing van de grootte en positie van het geablateerde segment. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Opgemerkt moet worden dat de totale laservermogen varieert tussen systemen. Door gebruik te maken van procent GFP fotobleaching kan echter een uitlezing van de totale energie afgegeven aan de fluorescerende nier, onafhankelijk van de variatie in laservermogen en gecompenseerd worden door de lengte van de blootstelling. Houd er rekening mee dat de reactie van verschillende weefsels op deze methode van fotoablation varieert. Zelfs tijdens de rijping van de nieren is het aanzienlijk moeilijker om een GFP-fluorescentie van 50% te krijgen bij jongere embryo's dan bij volwassen larven. Deze verschillen in weefselresponsiviteit voor fotoablation dienen in aanmerking te worden genomen bij het wijzigen en aanpassen van dit protocol voor verschillende toepassingen. Zo is het van cruciaal belang om de procentuele reductie in GFP fluorescentie te controleren om de hoeveelheid letsel en de voorspelde respons van het gewonde nierepitheel goed te beoordelen.
De belangrijkste voordelen van deze methode bij het vergelijken van andere methoden van nierbeschadiging inZebravis is dat staat voor de nauwkeurige controle van de spatiotemporale plaats van het letsel. Ook, het laat onderzoekers toe om het niveau van verwonding op en neer te zetten. Deze mogelijkheid om de hoeveelheid letsel te beheersen zou het mogelijk maken het onderzoek van epitheliale cellen te onderzoeken en zou moeten helpen bij besluitvorming in termen van herstel versus apoptose versus necrose. Het is bijvoorbeeld mogelijk om te tonen dat celmigratie een eerste reactie is van het overleven epithelium naar segmentale ablatie en dat cel proliferatie een secundair proces is, waarschijnlijk aangedreven door mechanische krachten die door celmigratie 14 worden gegenereerd.
Naast de mogelijkheid om het reparatieproces op mobiel niveau te bestuderen, zijn er andere voordelen voor deze methodiek. Eerst hadden de vorige fotoablationstechnieken beperkte controle over de hoeveelheid fotodamage 9 . Dit model zorgt echter voor een gecontroleerde controle over de hoeveelheid letsel, waardoor het makkelijker wordtToekomstige studies uitvoeren. Bovendien is in deze aanpak het mogelijk om arbitrêre groepen GFP fluorescerende cellen te richten, waardoor het makkelijk ablatie van hele segmenten mogelijk is. Terwijl dit met de gepulste lasertechniek kan worden bereikt, is het meer moeizaam, waardoor het potentieel voor experimenteel ontwerp beperkt wordt. Het gebruik van GFP om epitheliale schade te targeten en te versterken is een verder voordeel, omdat er zoveel GFP transgene zebravis beschikbaar zijn ( Tabel 1 is slechts een gedeeltelijke lijst). Andere fluorescerende eiwitten die uit transgene soorten zijn uitgedrukt, zijn ook onderzocht, zoals het Killer rood eiwit, maar deze transgenica zijn niet algemeen beschikbaar 16 . Een bijkomend voordeel van het gebruik van GFP is dat GFP-expressie met verschillende laserlengten kan worden gebruikt voor fotoablation (405 nm) of beeldvorming (488 nm). Er dient echter op te worden gewezen dat de methode gepubliceerd door Johnson et al. 9 kan worden toegepast op niet-fluorescerendeZebravis en kan dus ruimer worden gebruikt dan deze aanpak.
Een andere beperking van dit laser ablatiemodel is dat het geen rekening kan houden met alle verschillende factoren die kunnen leiden tot menselijk AKI. Er kan een ketting van gebeurtenissen zijn die leiden tot celnekrose in het menselijk lichaam, evenals celapoptose die wordt geïnduceerd tijdens nierbeschadiging. Het is onduidelijk of de verschillende omgeving die geproduceerd wordt tijdens laserablation alle aspecten van de pathofysiologie van AKI in mensen 10 kan imiteren. Niettemin heeft dit laser ablatiemodel veel voordelen ten opzichte van de alternatieve modellen. Door de mogelijkheid te geven om de niercel dood te herstellen en in real time met een hoge resolutie te repareren, moet deze methode leiden tot een beter inzicht in nierherstelmechanismen en een basis leggen voor nieuwe benaderingen voor AKI-behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken Dr Iain Drummond en Dr. Vladimir Korzh voor het delen van transgene GFP-transacties. We willen ook NYITCOM bedanken voor het verstrekken van benodigde middelen om dit werk uit te voeren. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) en de HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11 (0), 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
