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Biochemistry

सह-अवसादन द्वारा एफ-एक्टिन के लिए प्रोटीन बाध्यकारी मापना

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55613
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

इस प्रोटोकॉल में एक प्रोटीन की क्षमता को फिलामेंटस एक्टिन (एफ-एक्टिन) के साथ सह-तलछट की जांच करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है, और यदि बाध्यकारी देखे गए हैं, तो बातचीत के संबंध को मापने के लिए।

Abstract

कोशिकाओं के भीतर फिलामेंटस एक्टिन (एफ एक्टिन) संगठन एंटिन बाध्यकारी प्रोटीन की एक बड़ी संख्या से नियंत्रित होता है जो एक्टिन न्यूक्लियेशन, विकास, क्रॉस-लिंकिंग और / या डिस्ैम्पैपर को नियंत्रित करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक तकनीक का वर्णन करता है - एक्टिन सह-अवसादन, या पेलेटिंग, परख - यह निर्धारित करने के लिए कि प्रोटीन या प्रोटीन डोमेन एफ-एक्टिन को बांधता है और इंटरैक्शन की आत्मीयता ( यानी, पृथक्करण संतुलन स्थिर) को मापने के लिए। इस तकनीक में, समाधान में प्रो-एक्टिन के साथ पहले ब्याज की एक प्रोटीन लगाया गया है। इसके बाद, अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग एक्टिन फिलामेंट्स के तलछट के लिए किया जाता है और पीडीटेड सामग्री का विश्लेषण एसडीएस पेज द्वारा किया जाता है। यदि ब्याज की प्रोटीन एफ-एक्टिन बांधती है, तो एक्टिन फिलामेंट्स के साथ सह-तलछट होगी। बाध्यकारी प्रतिक्रिया ( यानी, एफ-एक्टिन और ब्याज की प्रोटीन) के उत्पादों को बातचीत के संबंध को पहचानने के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। एक्टिन पेलेटिंग परख निर्धारित करने के लिए एक सरल तकनीक हैअगर ब्याज की एक प्रोटीन एफ-एक्टिन को बांधता है और यह मूल्यांकन करने के लिए कि प्रोटीन जैसे कि लेगंड बाइंडिंग में परिवर्तन एफ-एक्टिन के साथ अपनी बातचीत को प्रभावित करता है।

Introduction

एक्टिन एक अनिवार्य साइटोस्केलेटल प्रोटीन है जो गतिशीलता, संकुचन, आसंजन और आकारिकी 1 सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एक्टिन दो रूपों में मौजूद है: मोनोमेरिक ग्लोबुलर एक्टिन (जी-एक्टिन) और पोलीमराइज्ड फिलामेंटस एक्टिन (एफ-एक्टिन)। कोशिकाओं के भीतर, एफ-एक्टिन संगठन को प्रोटीन का एक बड़ा संग्रह द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो न्यूक्लियेशन, विकास, क्रॉस-लिंकिंग और एक्टिन filaments 2 , 3 , 4 के disassembly को विनियमित करते हैं। हालांकि, एक्टिन नेटवर्क संगठन को विनियमित करने के लिए कॉन्सर्ट में कई एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन कैसे काम करते हैं, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है।

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की माप, यह समझने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है कि प्रोटीन जैव रासायनिक स्तर पर सेलुलर व्यवहार पर उनके प्रभाव कैसे लागू करते हैं। शुद्ध प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए कई अलग-अलग assays का उपयोग किया जा सकता हैघुलनशील प्रोटीन के लिए सामान्य दृष्टिकोण में पुल-डाउन, प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण, इओसमर्माल अनुमापन कैलोरीमेट्री, और सतह प्लसॉन अनुनाद शामिल हैं। महत्वपूर्ण रूप से, इन सभी assays में प्रोटीन घुलनशील होने की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार एफ-एक्टिन जैसे एक बहुलक, फिलामेंटिक प्रोटीन के साथ प्रयोग के लिए अनुकूल होना मुश्किल होता है यहाँ, हम एक तकनीक का वर्णन करते हैं - एक्टिन सह-अवसादन, या पेलेटिंग, परख - यह निर्धारित करने के लिए कि प्रोटीन या प्रोटीन डोमेन एफ-एक्टिन को बांधता है और इंटरैक्शन के संबंध को मापने के लिए।

एक्टिन पेलेटिंग परख एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक है, जिसे विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है, अलग-अलग एक अल्ट्रेंट्रफ़िफ़ से। सभी अभिकर्मकों, बुनियादी जीव रसायन के ज्ञान को संभालने, या खरीदा जा सकता है। एफ-एक्टिन के लिए बाध्य होने के बाद, परख को स्पष्ट संबंध ( यानी, पृथक्करण संतुलन स्थिर) को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इसके अलावा, एक बार एक संबंध स्थापित हो जाता है, पेलेटिंग परखयह मापने के लिए एक उपयोगी उपकरण है कि कैसे ब्याज की प्रोटीन में परिवर्तन ( यानी , बाद के अनुवादक संशोधनों, म्यूटेशन, या लिगंड बाध्यकारी) एफ-एक्टिन 6 के साथ अपने संपर्क को प्रभावित करता है। तकनीक में सीमाएं हैं (चर्चा देखें) कि शोधकर्ता को परख के प्रयास से पहले अवगत होना चाहिए।

Protocol

1. सामग्री तैयार करें

  1. ब्याज की प्रोटीन शुद्ध करें (खंड 2 देखें)।
  2. जी-एक्टिन तैयार या खरीद लें
    नोट: जी-एक्टिन को कई स्रोतों से पृथक किया जा सकता है 1 ; वैकल्पिक रूप से, यह खरीदा जा सकता है। पुनर्जीवित जी-एक्टिन (5 एमएम ट्रिएस पीएच 8.0, 0.2 एमएम CaCl 2 , 0.2 एमएम एटीपी (एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट), और 0.5 एमएम डेथियोथरेइटोल (डीटीटी)) में फ्लो जमे हुए, -80 डिग्री सेल्सियस और> 10 एमजी / एमएल में संग्रहीत होना चाहिए छोटे (10-20 μL) अल्कोट्स में, और उपयोग करने से पहले thawed जी-एक्टिन aliquots refrozen नहीं होना चाहिए।
  3. बीएसए (चरण 4.4 देखें) जैसे एक नियंत्रण प्रोटीन तैयार या खरीद लें।
  4. 10x पोलिमराइजेशन बफर (200 मिमी इमिडाज़ोल पीएच 7.0, 1 एम केसीएल, 20 एमएम एमजीएल 2 , 5 एमएम एटीपी, और 10 एमएम ईजीटीए (इथिलीन ग्लाइकॉल-बीआईएस (बी-एमिनोथिल ईथर) -एन, एन, एन ', एन' टेट्रैसिटिक एसिड))। एटीपी के अलावा, यदि आवश्यक हो, तो 10x स्टॉक बनाएं और पीएच समायोजित करें। विभाज्य (25 μL एक उपयोगी मात्रा है) और -80 और # पर स्टोर करें176; सी।
  5. 10x प्रतिक्रिया बफर (200 मिमी एमआईआईडीज़ोल पीएच 7.0, 1.5 एम NaCl, 20 मिमी एमजीसीएल 2 , 5 एमएम एटीपी, और 10 एमएम ईजीटीए) तैयार करें। एटीपी के अलावा, यदि आवश्यक हो, तो 10x स्टॉक बनाएं और पीएच समायोजित करें। विभाज्य (50-100 μL एक उपयोगी मात्रा है) और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
    नोट: प्रतिक्रिया बफर की संरचना लचीला है और पृष्ठभूमि अवसादन को कम करने, गैर विशिष्ट बंधन को सीमित करने और / या बाइंडिंग में सुधार (1.5.1-1.5.3 चरण) को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    1. प्रोटीन स्थिरता को अनुकूलित करने के लिए 6 और 8 के बीच प्रतिक्रिया बफर के पीएच को समायोजित करें। कम या उच्चतर पीएच पर, इमिडाज़ोल के लिए उपयुक्त बफर का स्थान ले लें।
      नोट: प्रारंभिक बिंदु के रूप में पीएच 7.0 का प्रयोग करें, जब तक कि प्रोटीन को स्थिरता के लिए कम या उच्च पीएच की आवश्यकता नहीं हो। 8.0 से नीचे पीएच के साथ बफर का उपयोग न करें या 8.0 से अधिक, क्योंकि यह एक्टिन को बाधित कर सकता है। अनुशंसित बफ़र्स (अंतिम एकाग्रता और इष्टतम पीएच सूचीबद्ध) में शामिल हैं: 20 मिमी मोप्स (3- ( एन- मॉर्फ़ोलिनो) प्रोपेनसल्फोनिक एसिड), पीएच= 6.5; 20 मिमी इमिडाज़ोल, पीएच = 7.0; 10 मिमी एचईपीईएस (4- (2-हाइड्रोक्सिथाइल) पपीरियान-1-ईटेन्सिलफोनीक एसिड), पीएच = 7.5; और 20 मिमी त्रि, पीएच = 8.0।
    2. परख की जरूरतों के आधार पर प्रतिक्रिया बफर के नमक एकाग्रता को अलग करें।
      नोट: एक्टिन एक अम्लीय प्रोटीन है, और लगभग सभी एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन एक्टिन के साथ सहयोग करने के लिए इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन पर कुछ हद तक निर्भर करते हैं। इसलिए, नमक की एकाग्रता में वृद्धि से अधिकांश मामलों में एक्टिन बाध्यकारी घट जाती है। प्रतिक्रिया बफर नमक के एक शारीरिक स्तर (150 मिमी NaCl, कार्य एकाग्रता) का उपयोग करता है, और यह अनुशंसित प्रारंभिक बिंदु है। यदि आवश्यक हो, बाध्यकारी को बढ़ावा देने के लिए नमक एकाग्रता को कम किया जा सकता है ( जैसे, 100 एमएम तक) या बाध्यकारी सीमा में वृद्धि।
    3. प्रतिक्रिया बफर में MgCl 2 , एटीपी, या ईजीटीए की सांद्रता को तब तक न बदलें जब तक ऐसा करने का एक विशिष्ट कारण न हो।

2.खाने के लिए टेस्ट प्रोटीन तैयार करें

  1. preparईए उच्च-शुद्धता प्रोटीन का सर्वोत्तम परिणामों के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करना 7
    नोट: यदि पुनः संयोजक प्रोटीन का इस्तेमाल किया जाए, तो ग्लूटाथियोन-एस-ट्रान्सफर (जीएसटी) जैसे बड़े प्रोटीन टैग को लक्ष्य प्रोटीन से प्रोटीज क्लीवेज द्वारा हटा दिया जाना चाहिए, क्योंकि वे बाध्यकारी के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। जीएसटी भी फ्यूजन प्रोटीन के होमोडिमेराइजेशन का कारण बनता है, जो कृत्रिम रूप से एक्टिन बाध्यकारी के आकर्षण को बढ़ा सकता है।
  2. 280 एनएम पर अवशोषण को मापकर प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें। विलुप्त होने के गुणांक द्वारा विभाजित; विलुप्त होने के गुणांक का अनुक्रम विश्लेषण या ऑनलाइन टूल का उपयोग करके प्रोटीन अनुक्रम से गणना की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, ब्रैडफोर्ड या बीसीए (बिकिनोकोनिनिक एसिड) तरीकों का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें।
    नोट: प्रारंभिक प्रयोगों के लिए, 20-40 सुक्ष्ममापी पर 50-100 μL प्रोटीन आमतौर पर पर्याप्त होता है इससे कम माइक्रोकोलर रेंज में बाइंडिंग के विश्लेषण की अनुमति होगी, जो कि अधिकांश एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन के लिए एक उपयोगी शुरुआती बिंदु है। एक बड़ा क्वानसंबंध, और कई बार प्रोटीन की एक उच्च एकाग्रता के लिए एक बाध्यकारी वक्र उत्पन्न करने के लिए आत्मीयता की गणना (अनुभाग 5 देखें) की आवश्यकता है।
  3. उपयोग करने से पहले, अघुलनशील प्रोटीन के समुच्चय को निकालने के लिए प्रोटीन (10 से 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 50,000-100,000 एक्सजी) स्पिन करें। यदि विलेयता एक चिंता का विषय है, तो सेंटीफ्यूजेशन के बाद प्रोटीन एकाग्रता (चरण 2.2) को फिर से मापें।

3. एफ-एक्टिन तैयार करें

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से जी-एक्टिन का एक विभाज्य निकालें और इसे जल्दी से पिघलना।
  2. 1x की अंतिम एकाग्रता में जी-एक्टिन को 10x पोलिमराइज़ेशन बफर जोड़ें। सुनिश्चित करें कि 1x पोलीमराइजेशन बफर में जी-एक्टिन एकाग्रता कम से कम 10-20 माइक्रोन है, जो महत्वपूर्ण एकाग्रता से ऊपर है। एंटिन को पोलीमराइज़ करने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. पोलीमराइजेशन के बाद, समाधान में एफ-एक्टिन 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जहां कुछ हफ्तों तक यह स्थिर होगा। भंडारण के बाद फिर से एफ-एक्टिन का उपयोग करने से पहले, धीरे से पलटनाया ट्यूब को कई बार झटका दें यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी एक्टिन भंग और समान रूप से समाधान में वितरित किया गया है।
    नोट: (वैकल्पिक) जी-एक्टिन का 1: 1 मूलर अनुपात हासिल करने के लिए फ़ालोइडिन जोड़ें: फलोइडिन। एफ-एक्टिन से जुड़ने के लिए phalloidin को आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं Phalloidin एफ actin स्थिर और दो चीजों को पूरा करता है: (i) यह एक्टिन की मात्रा कम करता है जो सेंट्रीफ्यूगेशन के दौरान तलछट नहीं करता है और (ii) यह एफ-एक्टिन को गंभीर एकाग्रता (~ 0.5 माइक्रोन) के नीचे पतला होने की अनुमति देता है, जो अक्सर होता है यदि बाध्यकारी वक्र उत्पन्न करने के लिए एफ-एक्टिन की मात्रा अलग-अलग हो, (आवश्यकता मापने पर अनुभाग 5 देखें)।

4. पेलेटिंग परख - मूल प्रोटोकॉल

नोट: अनुभाग 4 में वर्णित मूल प्रोटोकॉल का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि क्या एफ-एक्टिन के साथ ब्याज सह-तलछट का प्रोटीन एफ-एक्टिन के लिए बाध्य होने के बाद, इस बातचीत के संबंध को 5 अनुभाग में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद मापा जा सकता है।

  1. 10x स्टॉक को 1x से कम करके और 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता में डीटीटी जोड़कर प्रतिक्रिया के बफर को तैयार करें।
    नोट: (वैकल्पिक) प्रतिक्रिया बफर में 0.02% की अंतिम कार्य एकाग्रता में पोलीडोकानॉल जोड़ें। Polidocanol एक surfactant है जो गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि बंधन को कम कर देता है और हाइड्रोफोबिक प्रोटीन को अल्ट्रासिट्रिव ट्यूब से चिपकाने से रोकने में मदद करता है।
  2. अतिसंवेदनशील ट्यूबों में 1x प्रतिक्रिया बफर में वांछित सांद्रता के लिए ब्याज की प्रोटीन पतला। छोटे न्यूनतम संस्करणों ( जैसे , 7 x 20 मिमी ट्यूबों, जो कि 0.2 एमएल प्रत्येक को धारण करते हैं) के साथ ultracentrifuge ट्यूबों का उपयोग करके बड़ी मात्रा में प्रोटीन का उपयोग करने से बचने के लिए नमूना मात्रा कम (40-60 μL) रखें।
    नोट: चूंकि कई एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन को माइक्रो-रॉलर रेंज में एफ-एक्टिन के लिए एक संबंध है, इसलिए 2 और 10 माइक्रोन में ब्याज की प्रोटीन का परीक्षण करना है। यदि बाध्यकारी 10 सुक्ष्ममापी पर नहीं देखा गया है, तो यह संभव नहीं है कि बाध्यकारी उच्च सांद्रता पर मनाया जाएगा। अगरजोड़ा प्रोटीन अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के 10-20% से अधिक बनाता है, प्रयोग करने से पहले प्रतिक्रिया बफर में प्रोटीन को डायल करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  3. वांछित अंतिम एकाग्रता में एफ-एक्टिन जोड़ें।
    नोट: 2 सुक्ष्ममापी प्रारंभिक प्रयोगों के लिए एक उपयोगी एकाग्रता है क्योंकि यह महत्वपूर्ण एकाग्रता से ऊपर है, इस प्रकार filamentous राज्य में एक्टिन बनाए रखने से यह एसडीएस पृष्ठ (चरण 4.10) द्वारा विश्लेषण किया गया एक दृश्य गोली उत्पन्न करेगा।
  4. परख सूचनात्मक बनाने के लिए ultracentrifuge ट्यूबों में निम्नलिखित नियंत्रणों को तैयार करें।
    1. एफ-एक्टिन के बिना ब्याज की प्रोटीन वाले नमूने तैयार करें सुनिश्चित करें कि इन नमूनों में प्रोटीन की एकाग्रता "प्लस एफ-एक्टिन" नमूनों में एकाग्रता से मेल खाती है।
      नोट: एफएक्टिन की अनुपस्थिति में इन नमूनों में प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की जाएगी जो अल्ट्रेंट्रिव्यूज ट्यूब के पक्ष में एकत्रित या जुड़ी हुई है।
    2. नकारात्मक नियंत्रण नमूने तैयार करेंब्याज की प्रोटीन के लिए इस्तेमाल समान या समान एकाग्रता (एस) पर। एक नियंत्रण प्रोटीन का प्रयोग करें जो एफ-एक्टिन के साथ और एफ-एक्टिन के बिना बाँध नहीं करता।
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है क्योंकि प्रोटीन एफ-एक्टिन के साथ एक्टिन फिलामेंट्स और गोली में "फंस" हो सकते हैं, हालांकि वे एफ-एक्टिन बाँध नहीं करते हैं। फँसाने की मात्रा एफ-एक्टिन स्रोत, बफर स्थितियों आदि के आधार पर भिन्न हो सकती है । इस प्रकार, यह नियंत्रण सभी प्रयोगों में शामिल किया जाना चाहिए। आदर्श रूप से, नियंत्रण प्रोटीन में ब्याज की प्रोटीन ( जैसे , αE-catenin (~ 100 केडीए) के लिए, बीएसए (66 केडीए) एक उचित नियंत्रण है) के समान एक आणविक वजन होना चाहिए। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जेल निस्पंदन मानकों ने उत्कृष्ट नियंत्रण प्रोटीन बनाते हैं, क्योंकि वे आकारों की एक सीमा को कवर करते हैं और इसमें समुच्चय नहीं होते हैं
    3. वैकल्पिक रूप से, एफ-एक्टिन के साथ और बिना एफ-एक्टिन को बांधने वाले प्रोटीन युक्त सकारात्मक नियंत्रण नमूने तैयार करें। सुनिश्चित करें कि एकाग्रता (वां) वें के समान होती हैब्याज की ई प्रोटीन
      नोट: यह नियंत्रण सहायक होता है क्योंकि यह दर्शाता है कि प्रायोगिक परिस्थितियों ( जैसे, तैयार एफ-एक्टिन, प्रतिक्रिया बफर, और सेंट्रीफ्यूजेशन) एफ-एक्टिन बाइंडिंग की अनुमति देते हैं। चूंकि छिद्रण परख कमजोर एफ-एक्टिन इंटरैक्शन (चर्चा देखें) का पता लगाने में असफल हो सकती है, इसलिए यह सिफारिश की जाती है कि एफ-एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन में एफ-एक्टिन ( यानी, कम माइक्रोलोवर रेंज में) )। शुद्ध एफ-एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।
  5. आरटी पर 30 मिनट के लिए सभी नमूने सेते हैं
    नोट: लंबे समय तक ऊष्मायन समय ठीक है, यह मानते हुए कि ब्याज की प्रोटीन स्थिर है, हालांकि संभावना अनावश्यक है। यदि आरटी पर ब्याज की प्रोटीन स्थिर नहीं है, तो नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर सेवन किया जा सकता है इस मामले में, लंबे समय तक ऊष्मायन समय आवश्यक हो सकता है।
  6. नमूनों को अपकेंद्रित्र रोटर में लोड करें। रोटर के भीतर ट्यूबों को स्थानांतरित करने के लिए केन्द्रोत्तर के बाद गोली resuspending में सहायता।इसके लिए, सभी अपकेंद्रित्र ट्यूबों को चिह्नित करें ( जैसे, एक नमूना संख्या के साथ) और रोटर में सभी ट्यूबों को उसी स्थिति में रखें ( जैसे, बाहर की संख्या)।
  7. एक अतिसंवेदनशीलता में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 100,000 xg पर अपकेंद्रित्र।
  8. सेंटीफ्यूगेशन के बाद, प्रत्येक ट्यूब से 3/4 सतह पर तैरने वाले ( जैसे , 45 μL अगर शुरूआती मात्रा 60 μL) को हटा दें और 4x नमूना बफर (इस मामले में 15 μL) के 1/3 वॉल्यूम के साथ एक अलग माइक्रोप्रतिग्यूप ट्यूब में मिश्रण करें।
    1. एक जेल लोडिंग टिप के साथ शेष सतह पर तैरने वाले को निकालें, गोली को परेशान न करने के लिए ख्याल रखना (जो एक गन्दा जगह के रूप में दिखाई दे सकता है)।
      नोट: प्रोटीन विघटन पोस्ट-अलगाव को सीमित करने के लिए अपकेंद्रित्र को पूरा करने के तुरंत बाद ट्यूबों से सतह पर तैरने वाले को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एक ही कारण से प्रतिक्रिया बफर के साथ गोली न धोएं।
  9. प्रत्येक पेले में 1x नमूना बफर के 4/3 संस्करण जोड़ेंटी ( जैसे , 80 μL यदि प्रारंभिक मात्रा 60 μL थी)
    नोट: यह सतह पर तैरनेवाला (चरण 4.8, 4x नमूना बफर के 1/3 वॉल्यूम जोड़े गए थे) के लिए कमजोर पड़ने के समान बनाते हैं, गोली और सतह पर तैरने वाले नमूनों के बीच प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति और प्रोटीन के प्रतिशत का निर्धारण जो पेलेट किया गया था।
    1. सभी ट्यूबों में नमूना बफर जोड़ें और आरटी पर कम से कम 5 मिनट के लिए लें। नमूना रिकवरी में सुधार करने के लिए नमूना बफर में बैठने के लिए गोली की अनुमति दें
    2. नमूने को 8-10 बार पीजीपी विंदुक टिप के साथ ट्रिटूरेट करें ताकि ट्यूब के गोली क्षेत्र को लगातार धोकर गोली को फिर से शुरू किया जा सके। पुन: resuspension के साथ मदद करने के लिए ट्रिटिशन के दौरान गोली पर धीरे से पिपेट टिप पेपर करें।
      नोट: ट्रिप्रेशन के दौरान नमूना में हवा को शुरू करने से बचने के लिए सावधानी बरतें, क्योंकि यह नमूना बफर को बुलबुले का कारण देगा और नमूना रिकवरी को कम करेगा।
    3. ट्रिटिशन के बाद माइक्रोबॉज ट्यूबों के लिए रिज़्यूस्ड नमूनों को स्थानांतरित करें
      4. </ Ol>
    4. लेनदेन प्रति 10-15 μL नमूनों को लोड करके एसडीएस पृष्ठ और कॉमासी स्टैंगिंग 8 द्वारा सतह पर तैरने वाले और गोली नमूने का विश्लेषण करें; यह प्रोटीन कल्पना करने के लिए पर्याप्त है
      नोट: " ए एफ एक्टिन" गोली नमूनों ( चित्रा 1 ए ) पर "प्लस एफ-एक्टिन" गोली नमूनों में एफ-एक्टिन युक्त सह-तलछटी को समृद्ध किया जाएगा। प्रोटीन सांद्रता 0.1-10 माइक्रोन की रेंज में होती है, तो मानक कूमैसी नीले रंग की धुंधली पता लगाने के लिए पर्याप्त है। कोलाइडयन कूमेसी 9 या पश्चिमी ब्लोटिंग का इस्तेमाल संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है, अगर कम प्रोटीन सांद्रता उच्च-आत्मीयता के संबंधों को मापने के लिए उपयोग की जाती है।
    5. स्कैनर या इमेजिंग सिस्टम (चरण 5.12) का इस्तेमाल करते हुए क्राउमेसी-सना हुआ जैल।

    5. पेलेटिंग परख - मात्रा

    नोट: यदि एफ-एक्टिन के लिए विशिष्ट बंधन मनाया जाता है, तो यह टी के संबंध को मापने के लिए उपयोगी हो सकता हैवह बातचीत यह खंड 4 में उल्लिखित प्रोटोकॉल में कुछ बदलाव और परिवर्धन करके पूरा किया गया है। बाध्यकारी assays के डिजाइन और व्याख्या के लिए एक उत्कृष्ट गाइड के लिए, पोलार्ड 10 देखें। एक प्रवाह चार्ट ( चित्रा 2 ) विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के साथ सहायता के लिए प्रदान किया गया है।

    1. परीक्षण करने के लिए एकाग्रता सीमा निर्धारित करें
      नोट: एकाग्रता सीमा प्रोटीन पर निर्भर करती है और स्पष्ट कश्मीर ( उदाहरण के लिए, 1 सुक्ष्ममापी) के नीचे एकाग्रता से बाध्य होने के लिए पर्याप्त मात्रा में सांद्रता का होना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि बाध्यकारी सटीक बाध्यकारी वक्र ( चित्रा -1 सी ) उत्पन्न करने के लिए एकाग्रता सीमा के उच्च अंत में कई नमूनों में संतृप्ति तक पहुंचता है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, कई एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन को एफ माइक्रोनोलर रेंज (1-5 सुक्ष्ममापी) में एफ-एक्टिन के लिए एक आकर्षण है। 0.5-1 माइक्रोन के एक के डी के साथ प्रोटीन के लिए, एक उपयोगी प्रारंभिक एकाग्रता सीमा 0.1-1 होगी0 माइक्रोन
    2. कठोर स्पिन (चरण 2.3), समुच्चय निकालने के लिए ब्याज की प्रोटीन परीक्षण के लिए अंतिम एकाग्रता 2x पर 7-8 नमूने वाले एक एकाग्रता श्रृंखला बनाने के लिए प्रोटीन को धीरे-धीरे पतला। उदाहरण के लिए, यदि परीक्षण की सीमा 0.1-8 माइक्रोन है, तो निम्न द्रुण 1 एक्स प्रतिक्रिया बफर में तैयार करें: 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, और 0.2 सुक्ष्ममापी।
      नोट: जैसा कि चरण 4.2 में बताया गया है, यदि जोड़ा प्रोटीन पहले कमजोर पड़ने (ऊपर दिए गए उदाहरण में 16 माइक्रोन नमूना) के 10% -20% से अधिक है, तो यह प्रोटीन को आगे ध्यान देने या डायल करने के लिए आवश्यक हो सकता है 1x प्रतिक्रिया बफर में प्रोटीन "प्लस एफ-एक्टिन" और "नो एफ-एक्टिन" नमूनों के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए पर्याप्त तैयार करना सुनिश्चित करें।
    3. नमूनों को तैयार करें (खंड 4 में), अल्ट्रा कैंसर ट्यूबों में 1x प्रतिक्रिया बफर में वांछित सांद्रता के लिए ब्याज की प्रोटीन को कम करके। अल्ट्रेंट का उपयोग करके बड़ी मात्रा में प्रोटीन का उपयोग करने से बचने के लिए नमूना मात्रा कम (40-60 μL) रखेंछोटे न्यूनतम संस्करणों के साथ रिफाज ट्यूब ( जैसे , 7 x 20-एमएम ट्यूब जिनमें 0.2 एमएल प्रत्येक होते हैं)
      1. उपयुक्त नमूने के लिए वांछित अंतिम एकाग्रता में एफ-एक्टिन जोड़ें और 1x प्रतिक्रिया बफर का उपयोग करके मात्रा बढ़ाएं। उदाहरण के लिए, 2 माइक्रोग्राम एफ-एक्टिन का उपयोग करते हुए 50-μL प्रतिक्रियाओं के लिए, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना में 25 μL 2x प्रोटीन, 10 μL 10 माइक्रोन एफ-एक्टिन, और 15 μL 1x प्रतिक्रिया बफर है। नियंत्रण नमूने शामिल करें (चरण 4.4.2 और 4.4.3)।
        नोट: नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के लिए, श्रेणी के उच्च अंत ( जैसे, 4 सुक्ष्ममापी अगर एकाग्रता सीमा 0.1-10 माइक्रोन है) के लिए आदर्श रूप से मध्यम के पास (चरण 5.1) परीक्षण करने वाली सीमा के भीतर एक एकाग्रता का उपयोग करें।
    4. आरटी पर 30 मिनट के लिए सभी नमूने सेते हैं
    5. 30 मिनट के बाद, प्रत्येक नमूना का 1/5 निकालें ( जैसे, 50 μL प्रतिक्रिया के 10 μL) और 20 μL पानी और 10 μL के 4x नमूना बफर के साथ मिश्रण करें।
      नोट: ये "कुल" हैंअमोन और एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    6. नमूनों को ultracentrifuge रोटर में लोड करें। 20 मिनट के लिए 100,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र
    7. वैकल्पिक रूप से, सेंटीफ्यूगेशन के बाद, प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरने वाले की 3/4 ( उदाहरण के लिए, 30 μL अगर सेंटीफ्यूज वॉल्यूम 40 μL) को हटा दें और 4x नमूना बफर (इस मामले में 10 μL) के साथ एक अलग माइक्रोफ्यूज ट्यूब में मिश्रण करें। एक जेल लोडिंग टिप के साथ शेष सतह पर तैरने वाले को निकालें, गोली को परेशान न करें।
      नोट: बाध्यकारी संबंध को मापते समय, सतह पर तैरनेवाला चलाने के लिए आवश्यक नहीं है। बहरहाल, यह सतह पर तैरनेवाला को बचाने के लिए उपयोगी हो सकता है, खासकर जब एक नई प्रोटीन का परीक्षण कर सकता है
    8. सतह पर तैरनेवाला निकालें तो विश्लेषण न करें (चरण 5.7)।
    9. 1x नमूना बफर के 1 मात्रा में गोली resuspend ( जैसे, 40 μL अगर centrifuged मात्रा 40 μL था)
      1. सभी ट्यूबों में नमूना बफर जोड़ें और आरटी पर कम से कम 5 मिनट के लिए लें।
      2. trनमूना 8-10 बार पीजीपी विंदुक टिप के साथ, ट्यूब के गोली क्षेत्र को लगातार धुलाई। पुन: resuspension के साथ मदद करने के लिए ट्रिटिशन के दौरान गोली पर धीरे से पिपेट टिप पेपर करें।
    10. एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए रिसाव की गई प्रोटीन को ट्रांसफर कर दें।
      नोट: ये "गोली" नमूने हैं
    11. एसडीएस-पृष्ठ 8 द्वारा कुल और गोली नमूने का विश्लेषण करें यदि संभव हो तो एक जेल पर सभी नमूने चलाएं; यदि नहीं, तो एक जेल पर गोली नमूने और एक दूसरे पर कुल नमूनों को चलाएं।
      नोट: नमूने की संख्या को देखते हुए, विश्लेषण के लिए एक बड़े जेल सिस्टम की सिफारिश की जाती है। यदि दो या दो से अधिक जैल पर चल रहे नमूने हैं, तो यह महत्वपूर्ण है कि सभी जैल समान रूप से दाग़े जाएंगे ( यानी, एक ही कॉमॉसिली समाधान और दाग में एक समान समय)।
    12. इमेजिंग सिस्टम का इस्तेमाल करते हुए क्राउमेसी-सना हुआ जैल छवि जो प्रोटीन बैंड की तीव्रता को विस्तृत ( यानी, दो से तीन लॉग) और रैखिक रेंज के उपायों को मापता है। यह सुनिश्चित करें कि चित्र एककोई संतृप्त पिक्सेल के साथ एकत्र नहीं किया गया
      नोट: लेजर आधारित इमेजिंग सिस्टम सर्वोत्तम संवेदनशीलता और संकेत-टू-शोर अनुपात की पेशकश करते हैं
    13. ImageJ या एक समान विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करना, प्रोटीन बैंड तीव्रता को मापने और बाध्य प्रोटीन की मात्रा की गणना करना।
      नोट: सभी नमूना मापों के लिए, प्रत्येक बैंड के आस-पास ब्याज क्षेत्र (आरओआई) को आकर्षित करने के लिए चयन उपकरण का उपयोग करें और उपाय (विश्लेषण> उपाय) क्षेत्र और मतलब ग्रे वैल्यू। नमूने के बिना किसी क्षेत्र से औसत भूरे रंग के मूल्य को मापकर प्रत्येक जेल के लिए पृष्ठभूमि की गणना करें। पृष्ठभूमि को घटाएं इसका अर्थ है कि प्रत्येक आरओआई से भूरे रंग का मान भूरे रंग का मान है और फिर प्रत्येक बैंड के लिए एकीकृत घनत्व मूल्य प्राप्त करने के लिए क्षेत्र के अनुसार गुणा करें।
      1. कुल नमूनों ( चित्रा 2 ए ) से ब्याज बैंड की तीव्रता के प्रोटीन को मापें।
      2. बैंड की तीव्रता ( यानी, एकीकृत घनत्व माप) बनाम प्रोटीन द्रव्यमान ( चित्रा ) की साजिश रचने से एक मानक वक्र उत्पन्न करें2 बी)
      3. ब्याज की प्रोटीन की मात्रा को मापें जो एफ-एक्टिन (सह-सब्जीकृत प्रोटीन, चित्रा 2 सी ) के साथ सह-सड़नयुक्त होता है।
      4. एफ-एक्टिन (पृष्ठभूमि अवसादन, चित्रा 2 डी ) के अभाव में अवशोषित ब्याज की प्रोटीन की मात्रा को मापें।
      5. एफ-एक्टिन से जुड़ी प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए, सह-सब्जीकृत प्रोटीन से पृष्ठभूमि अवसादन घटाएं ( यानी, चरण 5.13.3 से चरण 5.13.4 से मानों को घटाना)।
      6. प्रत्येक गोली में एफ-एक्टिन की मात्रा को मापें ( चित्रा 2 ई )। प्रति नमूना एफ-एक्टिन की औसत राशि का निर्धारण करें और फिर प्रत्येक नमूने को औसतन प्रत्येक नमूने में एफ-एक्टिन के अनुपात को निर्धारित करने के लिए प्रत्येक नमूना को औसत से विभाजित करें ( अर्थात, बैंड के नीचे की संख्या)।
      7. प्रत्येक नमूने के लिए, गोली में मतभेदों को समायोजित करने के लिए एफ-एक्टिन एक्टिन गोली अनुपात (चरण 5.13.6) द्वारा बाध्य प्रोटीन की मात्रा (5.13.5 चरण में गणना) विभाजित करें।
        एनओटीई: यह मान सामान्यीकृत बाध्य प्रोटीन है
      8. प्रत्येक नमूने में सामान्यीकृत बाध्य प्रोटीन (चरण 5.13.7) की मात्रा (द्रव्यमान) की गणना करने के लिए मानक वक्र (चरण 5.13.2) का उपयोग करें।
        नोट: शुरू में प्रोटीन ("कुल" नमूना), और साथ ही लोड की गयी राशि (जो, जब तक कि संपूर्ण गोली लोड नहीं की गई, गोली का कुछ अंश होगा), को कुल मात्रा की प्रोटीन कि pelleted
      9. गोली में प्रोटीन के कुल द्रव्यमान (चरण 5.13.8 में गणना) और नमूने की मात्रा से प्रत्येक नमूने में बाध्य प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करें। नि: शुल्क प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक एकाग्रता से इस मूल्य को घटाना एक्टिन (माइक्रोग्राम / एक्टिन के सुक्ष्ममापी) की एकाग्रता द्वारा बाध्य प्रोटीन की एकाग्रता को विभाजित करें और बाध्यकारी वक्र ( चित्रा -1 सी ) उत्पन्न करने के लिए मुक्त प्रोटीन की एकाग्रता बनाम प्लॉट करें।
        नोट: चूंकि एफ-एक्टिन एकल नहीं है, एक समान प्रजाति यह अंतर हैपंथ जी-एक्टिन एकाग्रता से एफ-एक्टिन के दाढ़ एकाग्रता को एक्सट्रपोल करने के लिए बाध्य प्रोटीन (एक्टिन के सुक्ष्ममापी / माइक्रोन) की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक जी-एक्टिन एकाग्रता का उपयोग करें और प्रतिक्रिया में बाध्यकारी साइटों की स्पष्ट एकाग्रता का अनुमान लगाएं। बाध्यकारी साइटों की एकाग्रता प्रतिक्रिया में एक्टिन मोनोमर्स की एकाग्रता से आम तौर पर कम होती है, क्योंकि सभी एक्टिन पॉलिमरीज़ नहीं होते हैं और क्योंकि एकल एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन अणु एक्टिन फिलामेंट पर कई मोनोमर के साथ संपर्क कर सकता है।
    14. सांख्यिकीय प्रोग्राम का उपयोग करना, गैरकानूनी कम-वर्ग प्रतिगमन का उपयोग करके बाध्यकारी वक्र से आत्मीयता (के डी ) और बी मैक्स को निर्धारित करें।
      नोट: बाध्यकारी डेटा का विश्लेषण करने के लिए स्कैचर्ड भूखंडों को हतोत्साहित किया जाता है, क्योंकि आंशिक रूप से वे अस्पष्ट कर सकते हैं कि बाइंडिंग संतृप्त है या नहीं क्योंकि वे प्रायोगिक त्रुटि 10 को बिगाड़ सकते हैं।

Representative Results

हमने सह-अवसादन परख में एफ-एक्टिन के लिए बंधन αE-catenin homodimer की जांच की। चूंकि पिछले प्रयोगों ने दिखाया है कि एफ-एक्टिन के लिए एएएई-कैटेिनिन होमोडीमर का आकर्षण लगभग 1 माइक्रोन है और बी मैक्स 1 के करीब है, हमने एफ-एक्टिन (2 माइक्रोन की बजाय 0.2 माइक्रोन की कम एकाग्रता के साथ परख किया; देखें चर्चा)। चूंकि 0.2 माइक्रोन महत्वपूर्ण एकाग्रता से नीचे है, खरगोश कंकाल की मांसपेशियों जी-एक्टिन (चरण 3.3) से बहुलक एफ-एक्टिन को स्थिर करने के लिए फिलाइडिन को जोड़ा गया था। ΑE-catenin homodimer (0.125-12.0 सुक्ष्ममापी) की बढ़ती सांद्रता 0.2 माइक्रोन एफ-एक्टिन की मौजूदगी या अनुपस्थिति में होती थी। नमूनों को केन्द्रित किया गया था, और परिणामस्वरूप छर्रों का विश्लेषण किया गया ( चित्रा 1 ए )। जैसा अपेक्षित था, αE-catenin homodimer पृष्ठभूमि के ऊपर एफ-एक्टिन के साथ सह-अवशोषित ( चित्रा 1 ए , ए -एक्टिन गोली नमूनों की तुलना में नो-एफ-एसीटिन गोली नमूने) बीएसए को नकारात्मक नियंत्रण ( चित्रा 1 बी ) के रूप में चलाया गया था। बन्धे प्रोटीन की मात्रा को मापने और बातचीत के आत्मीयता की गणना करने के लिए मुक्त प्रोटीन पर प्लॉट किया गया था ( चित्रा -1 सी )। प्लॉट किए गए आंकड़े सबसे अच्छा एक हिल समीकरण में फिट हैं गणना की डी 2.9 माइक्रोन था, बी मैक्स 0.2 था, और हिल गुणांक (एच) 4.8 था। इस प्रकार, αE-catenin homodimer एफ-एक्टिन को एक कम माइक्रोलोल्लो आत्मीयता के साथ बांधे रखता है, जो पिछले काम (2.9 माइक्रोन बनाम ~ 1.0 माइक्रोन के के डी) के अनुरूप है।

आकृति 1
चित्रा 1: उच्च गति एफ-एक्टिन सह-अवसादन परख। ( ए ) αE-catenin homodimer की बढ़ती सांद्रता (0.125-12.0 माइक्रोग्राम) के साथ (बाएं पैनल) या बिना (सही पैनल) incubated थे 0.2 माइक्रोन एफ-एक्टिन phalloidi के साथ स्थिरएन। वे आरटी पर 30 मिनट और सेंटीफ्यूज किए गए थे। कुल (प्रारंभिक सामग्री का 7.5%) और पेलेटेड सामग्री (पेलेटेड सामग्री का 50%) एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे और कॉमेसी डाई के साथ दाग रहे थे। ( बी ) 4 माइक्रोन बीएसए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में चलाया गया था। कुल और गोली के नमूनों, (+) या बिना (-) एफ-एक्टिन, एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे और कॉमेसी डाई के साथ दाग रहे थे। ( सी ) बाँध αE-catenin (सुक्ष्ममापी / सुक्ष्ममापी actin) एक मुक्त αE-catenin (माइक्रोन) के खिलाफ प्लॉट किया गया था, और पहाड़ी समीकरण (लाल रेखा) के लिए फिट डेटा। के डी , बी मैक्स , और हिल गुणांक (एच) सूचीबद्ध हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2: Actin pelleting मात्रा का ठहराव - प्रवाह चार्ट यह योजनाबद्ध अनुभाग 5 में प्रमुख कदमों की रूपरेखा, कुल और गोली नमूनों ( ए , सीई ) और मात्रात्मकता के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक वक्र ( बी ) के उदाहरणों के साथ। 5.13 कदम: 1 ) कुल नमूनों (ए) में ब्याज की प्रोटीन की मात्रा का आकलन करें। 2 ) बैंड की तीव्रता बनाम प्रोटीन मास (बी) की साजिश रचने से एक मानक वक्र उत्पन्न करें। 3 ) एफ-एक्टिन ( सी ) के साथ सह-सब्जी के ब्याज की प्रोटीन की मात्रा का आकलन करें। 4 ) एफ-एक्टिन ( डी ) के अभाव में पीलेट किए गए ब्याज की प्रोटीन की मात्रा का आकलन करें। 5 ) प्रोटीन की मात्रा एफ-एक्टिन से जुड़ी निर्धारित करने के लिए डी से घटाएं। 6 ) प्रत्येक गोली (ई) में एफ-एक्टिन की मात्रा का आकलन करें, प्रति नमूना एफ-एक्टिन की औसत मात्रा की गणना करें, और प्रत्येक नमूने को औसतन औसत (नीचे दी गई संख्या अनुपात दिखाएं) से विभाजित करें। 7 )प्रत्येक नमूने के लिए, गोली में अंतर के लिए समायोजित करने के लिए एफ-एक्टिन गोली अनुपात (चरण 6 में गणना) द्वारा बाध्य प्रोटीन की मात्रा (चरण 5 में गणना) विभाजित करें। 8 ) प्रत्येक नमूने में सामान्यीकृत बाध्य प्रोटीन की मात्रा (द्रव्यमान) की गणना करने के लिए मानक वक्र ( बी ) का उपयोग करें (चरण 7)। 9 ) एक बंधनकारी वक्र बनाने के लिए मुक्त प्रोटीन और बाध्य प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

एक्टिन सह-अवसादन परख एक सीधा तकनीक है जो जल्दी से निर्धारित कर सकता है कि प्रोटीन एफ-एक्टिन को बांधता है या नहीं। कुछ संशोधनों के साथ, इस तकनीक का इस्तेमाल बातचीत के संबंध को मापने के लिए भी किया जा सकता है। उपर्युक्त प्रोटोकॉल में उठाए गए अंकों के अलावा, परख की डिजाइनिंग, संचालन और व्याख्या करते समय निम्नलिखित मुद्दों पर विचार किया जाना चाहिए।

ब्याज की प्रोटीन

ताजा तैयार या जमी प्रोटीन परख में इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि जमी प्रोटीन का इस्तेमाल किया जाता है, तो यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि परिणाम ताजा (कभी जमी) प्रोटीन के साथ तुलना न करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि फ्रीजिंग एफ-एक्टिन बंधन को प्रभावित नहीं करती है।

जी-एटिन स्रोत

कई पेलेटिंग प्रयोगों में जी-एक्टिन का उपयोग मांसपेशियों से अलग होता है क्योंकि इसकी रिश्तेदार बहुतायत। स्तनपायों - अल्फा, बीटा और गामा में तीन मुख्य एक्टिन आइसोटाइप हैं - जो असाधारण समान हैं (> 90% अनुक्रम पहचानTy)। बहरहाल, आइोटाइपों 12 , 13 के बीच कार्यात्मक अंतर हैं। यदि संभव हो तो, बाध्यकारी परख में जी-एक्टिन आइसोटाइप का इस्तेमाल विवो आइसोटाइप में होना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि कंकाल की मांसपेशी में व्यक्त प्रोटीन का परीक्षण किया जाता है, तो अल्फा-एक्टिन सबसे अच्छा विकल्प है; अगर फाइब्रोब्लास्टों में व्यक्त प्रोटीन की जांच हो रही है, बीटा एक्टिन की सिफारिश की जाती है।

Phalloidin का प्रयोग करें

चूंकि phalloidin एफ-एक्टिन बांधता है, यह कुछ एफ-एक्टिन बाइंडिंग प्रोटीन ( जैसे, एफ़िनिन तंतुओं के लिए बाध्यकारी से cofilin phalloidin ब्लॉक) की बाध्यता को बाधित या अवरुद्ध कर सकता है 14 । इस प्रकार, जब संभव हो तो बिना phalloidin- इलाज के नमूने की तुलना में सावधानी के साथ phalloidin और परिणामों का उपयोग किया जाना चाहिए।

उच्च पृष्ठभूमि

एफ-एक्टिन ( चित्रा 1 ए , कोई एफ-एक्टिन गोली नमूना) के अभाव में प्रोटीन के तलछट के लिए असामान्य नहीं हैरों)। हालांकि, पृष्ठभूमि अवसादन के उच्च स्तर से सच एक्टिन सह-अवसादन को ढंकना पड़ सकता है और असंभव नहीं है, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या प्रोटीन एफ-एक्टिन बांधता है या बातचीत के संबंध को मापने के लिए मुश्किल है। प्रतिक्रिया बफर (चरण 4.1) को पॉलीडेकिनोल जोड़ना पृष्ठभूमि को काफी कम कर सकता है और यह आसान समाधान है यदि यह पृष्ठभूमि को कम नहीं करता है, प्रतिक्रिया बफर, नमक एकाग्रता, और / या ऊष्मायन तापमान समायोजित करने में मदद कर सकता है।

बाइंडिंग वक्र

बाध्यकारी वक्र उत्पन्न करने के लिए, प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला पर या तो ब्याज की प्रोटीन या एफ-एक्टिन की एकाग्रता को बदलना आवश्यक है व्यवहार में, एक स्थिर एकाग्रता में एफ-एक्टिन को बनाए रखने और ब्याज की प्रोटीन की एकाग्रता को अलग रखने के लिए यह आसान और बेहतर है। पेलेटिंग परख में एक निश्चित एकाग्रता ( उदाहरण के लिए, 2 माइक्रोग्राम) पर एफ-एक्टिन बनाए रखना एफ-एक्टिन की अधिक मात्रा में गैर-विशिष्ट फँसाने की रोकथाम करता है और रोकता हैएफ-एक्टिन के निचले (<0.5 माइक्रोन) सांद्रता पर डिपोमिराइज़ेशन Depolymerization phalloidin का उपयोग कर रोका जा सकता है, हालांकि इस प्रणाली में एक संभावित जटिलता फैक्टर का परिचय (देखें कदम 3.3 और ऊपर)। एक निश्चित एकाग्रता में एफ-एक्टिन को बनाए रखने से भी एक ने एफ-एक्टिन गोली को नमूनों में (और सामान्य) बनाने और असफल प्रयोगों की पहचान करने के लिए अनुमति दी है ( यानी, एफ-एक्टिन गोली अत्यधिक चर वाली है, सांद्रता में विश्लेषण को रोकना)। अंत में, एक निश्चित एकाग्रता पर एफ-एक्टिन को बनाए रखने से यह पता चलता है कि एक्टिन फिलामेंट के लिए बाध्यकारी सहकारी है ( चित्रा -1 सी )।

संतृप्त बाध्यकारी

सभी बंधन प्रयोगों के अनुसार, यह महत्वपूर्ण है कि एफ-एक्टिन को बाध्य किया जाता है और प्रोटीन प्लस एफ-एक्टिन पठारों ( चित्रा 1 सी ) की एकाग्रता होती है। एक पठार के बिना, एक सटीक विस्थापन संतुलन निरंतर की गणना करना संभव नहीं है। इस प्रकार, यहमहत्वपूर्ण है कि सावधानीपूर्वक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला की जांच करनी चाहिए और हमेशा प्रोटीन की उच्च सांद्रता ( यानी, अपेक्षित के डी से कम से कम 5 से 10 गुना अधिक) में शामिल होना चाहिए।

बाध्यकारी विश्लेषण

मापा विस्थापन स्थिरांक के लिए निर्णायक होने के लिए, एफएटीन एकाग्रता का उपयोग करके परख किया जाना चाहिए जो एफ-एक्टिन पर ब्याज की प्रोटीन के संबंध में बाध्यकारी साइटों की एकाग्रता को समानता से बहुत कम होने की अनुमति देता है। यह मानदंड पूरा हो गया है या नहीं, यह जांचने के लिए, बी मैक्स से बाध्यकारी साइटों की एकाग्रता का अनुमान है। उदाहरण के लिए, यदि [एफ-एक्टिन] 2 माइक्रोन और बी मैक्स = 0.5 था, फिर [बाइंडिंग साइट्स] ≈ 1 सुक्ष्ममापी के डी को [बंधन स्थल] से कम से कम 5 से 10 गुना अधिक होना चाहिए। अगर मापा के डी [बाध्यकारी साइट्स] के रूप में एक ही क्रम के समान है, तो यह संभव है कि मनाया बाध्यकारी वक्र उच्च आत्मीयता बाध्यकारी सी का एक अनुमापन का प्रतिनिधित्व करता हैएक सच्चे बाध्यकारी isotherm के बजाय टीईएस यदि यह देखा जाता है, तो सटीक संबंध को मापने के लिए 10-गुना कम एफ-एक्टिन एकाग्रता का उपयोग करके परख को दोहराएं। उच्च आत्मीय संबंधों के लिए, एफ़-एक्टिन एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है जो उचित रूप से आत्मीयता को मापने के लिए पर्याप्त है।

अंत में, सह-अवसादन परख के साथ मौलिक सीमाएं हैं, जो शोधकर्ताओं को परख के प्रदर्शन और मूल्यांकन के बारे में पता होना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण बात, सह-अवसादन परख एक सच्चे संतुलन स्थिरता उत्पन्न नहीं करता है। बाध्यकारी ( यानी, प्रोटीन प्लस एफ-एक्टिन) के उत्पादों को सेंट्रीफ्यूगेशन के दौरान रिएक्टेंट से अलग किया जाता है, जिससे उत्पादों को एक नया संतुलन बनाने के लिए अलग-थलग हो सकता है। नतीजतन, सह-अवसादन परख कम-आत्मीयता बातचीत का पता लगाने में विफल या विफल हो सकता है। चूंकि कई एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन के पास एफ-एक्टिन के लिए कम ( यानी, माइक्रोमोलोलर) समानता है, एक नकारात्मक परिणाम ( 15,16 देखें) के निर्धारण के लिए अधिक सटीक हैं। इन सीमाओं के बावजूद, पेलेटिंग परख ज्यादातर शोधकर्ताओं के माध्यम से है और यह निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है कि क्या प्रोटीन एफ-एक्टिन को बांधता है और इंटरैक्शन के संबंध को मापने के लिए।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट एचएल 127711 एवीके द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher Scientific 46960
S100-AT3 rotor ThermoFisher Scientific 45585
Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL ThermoFisher Scientific 45233
Actin, rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99
Bovine Serum Albumin Sigma A8531
Polidicanol (Thesit)  Sigma 88315
Phalloidin ThermoFisher Scientific P3457
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific R0862
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma A2383
Imidazole Fisher Scientific O3196
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358
Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific M33
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific P217
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma 3779
Odyssey CLx Imaging System LI-COR
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Colloidal Blue Staining Kit ThermoFisher Scientific LC6025

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References

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सह-अवसादन द्वारा एफ-एक्टिन के लिए प्रोटीन बाध्यकारी मापना
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Heier, J. A., Dickinson, D. J.,… More

Heier, J. A., Dickinson, D. J., Kwiatkowski, A. V. Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation. J. Vis. Exp. (123), e55613, doi:10.3791/55613 (2017).

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