Summary
Forstå, hvordan celler er moduleret af eksponering for chokbølger kan hjælpe med at identificere mekanismerne bag skader udløst fra blast begivenheder. Denne protokol bruger specialbyggede chok tube udstyr til at gælde chokbølger på en række pres for celle monolag og identificere de efterfølgende virkninger på cellernes levedygtighed.
Abstract
Udsættelse for blast begivenheder kan forårsage alvorlige traumer til vitale organer såsom lunger, ører og hjerne. Forstå mekanismerne bag sådanne blast-induceret skader er af stor betydning i betragtning af den seneste tendens til brugen af sprængstoffer i moderne krigsførelse og terrorisme-relaterede hændelser. Fuldt ud at forstå blast-induceret skade, skal vi først kunne replikere sådanne blast begivenheder i et kontrolleret miljø ved hjælp af en reproducerbar metode. I denne teknik bruger chok tube udstyr, chokbølger på en vifte af pres kan overføres over levende celler dyrkes i 2D, og markører for cellernes levedygtighed straks kan analyseres ved hjælp af en redox indikator analysen og den fluorescerende billeddannelse af levende og døde celler. Denne metode påvist at øge peak blast overtryk til 127 kPa kan stimulere en betydelig nedgang i cellernes levedygtighed sammenlignet med ubehandlet kontrol. Analyseprøverne er ikke begrænset til vedhængende celler, men kan omfatte celle suspensioner, hele kroppen og væv prøver, gennem mindre ændringer til chok tube setup. Gentage de nøjagtige betingelser, at væv og celler oplever når de udsættes for en reel blast begivenhed er vanskeligt. Teknikker som de præsenteres i denne artikel kan bidrage til at fastsætte tærskler, skader og identificere de transcriptional og epigenetiske ændringer inden for celler, der opstår fra trykbølge eksponering.
Introduction
Med den seneste tendens til brugen af improviserede eksplosive anordninger i moderne krigsførelse og terroristangreb på civile, forstå virkningerne af eksplosive begivenheder på den menneskelige krop er af stor betydning. Skader opnået gennem eksponering for blast begivenheder kan være dødbringende og dødbringende, med de fysiske processer af skade bliver opdelt i fire kategorier. Primære skader skyldes direkte eksponering for trykbølger, som interagerer lokalt med kroppen i en trykstyrke og efterfølgende ekspansiv måde, forårsager forstyrrelser af membraner og bløddele1. Sekundære skader omfatter stumpe traumer eller penetrerende sår forårsaget af indvirkning med lav masse objekter fremdrives ved høj hastighed ved trykbølger. Tertiære skader opstår, når trykbølger har tilstrækkelig energi til at kaste genstande af højmesse eller individer mod objekter. Endelig er kvaternær blast skader defineret af andre diverse skader, der ikke passer i andre kategorier, såsom flash forbrændinger2. Efter eksponering for sådanne blast begivenheder omfatter primære skader traumatisk hjerne skade3,4,5, heterotopisk ossifikation6,7, blast lunge skade8, tab af hørelse 9, og andre10.
Et almindeligt observerede bølgeform fra blast begivenheder er Friedlander bølge, som repræsenterer et fri-felt, i modsætning til en lukket-plads, eksplosion. Bølgeform består af en blast front, der kan defineres som en skarp og hurtig stigning i overtryk. Dette er umiddelbart efterfulgt af en blast vind luft bevæger sig med høj hastighed og en frigivelse bølge, der reducerer presset til under atmosfæriske niveauer. Et delvist vakuum er tilbage på regionen i den første eksplosion, hvilket resulterer i den langsomme tilbagestrømning af luft. De positive og negative faser af bølgen (figur 1A) resulterer i push-pull bevægelse af blast wave1. For at hjælpe med at belyse mekanismerne bag primære blast skader, er eksperimentelle modeller blevet oprettet for at producere bølgeformer, såsom Friedlander bølge, som celler og væv vil ansigt når de udsættes for en reel blast begivenhed. Nuværende systemer opført i litteraturen omfatter stød rør11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, nordvestlige bar20, avancerede blast simulatorer21, Split Hopkinson pres bar22og genskabelse af alternative blast begivenheder i et kontrolleret miljø ved hjælp af pentaerythritol støbt23. Trods den brede vifte af modeller til rådighed påvirker mange variabler den skade, der er fremstillet af blast bølger, herunder pre stress anvendes til, og de mekaniske egenskaber af den enkelte celletyper eller væv under evaluering24. Mens undersøgelsen af væv eller organer kan kaste lys over væv deformation og grov morfologiske forandringer påført som følge af blast begivenheder, kan analyse på cellulært niveau afdække transcriptional og epigenetiske ændringer påvirket af chok bølge.
Denne metoder artikel beskriver en teknik til at udbrede chokbølger på en række pres over levende celler i en éncellelag. Dette giver mulighed for øjeblikkelig karakterisering af cellernes levedygtighed, belyse potentielle skader tærskler fra chokbølger. Derudover levedygtige celler kan returneres til standard dyrkningsbetingelser, og biologiske langtidseffekter fra hændelsen blast kan vurderes. Protokollen nedenfor beskriver to celle levedygtighed teknikker, der kan anvendes på celler i kultur.
Figur 1: Tilnærmelse af en Friedlander bølge. (A) en tilnærmelse af en Friedlander bølge observeret på sensor 3 på stødrørs stødbølgehastighed. (B) repræsentative data viser forskellige pres profiler observeret på sensorer 1, 2 og 3 på stødrørs stødbølgehastighed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
1. cellekultur og prøveforberedelse
- få en passende cellelinje (fx dermal papilla celler).
Bemærk: Den nuværende protokol er blevet designet for vedhængende celler, med rotte dermal papilla fibroblaster isoleret fra vibrissae anvendes som model. - Kultur celler i en T-75 kolbe indeholdende minimum afgørende medium (MEM) α suppleret med 10% føtal bovint serum og 1% penicillin streptomycin. Holde cellerne på standard dyrkningsbetingelser 37 ° C og 5% CO 2 i en fugtig miljø, indtil de når 80% sammenløbet.
- Opsug mediet og vaske cellerne to gange i Dulbecco ' s fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Adskille celler fra kolben ved at inkubere dem i 2 mL trypsin/EDTA på standard kultur betingelser for 5 min. kort kontrollere for at sikre, at celler med succes har taget afstand fra kolben ved hjælp af en lys/fase kontrast mikroskop (med en 10 X mål linse ).
- Tilsættes 4 mL af næringssubstratet at neutralisere trypsinization reaktionen. Overføre cellesuspension til en 15 mL centrifugeglas.
- Centrifuge på 200 x g i 4 min. at sammenpresse cellerne. Langsomt Aspirér supernatanten, pas på ikke for at løsne pelleten. Genopslæmmes pellet i 5 mL medium.
- Overføre en 20 µL alikvot af cellesuspension til en ren hemocytometer og tælle de celler ved hjælp af et mikroskop udstyret med en 10 X mål linse.
- Forberede cellerne for eksplosionen ved at placere tre 35 mm retter inde i en 90 mm parabol. Mærke dem korrekt. Der tilsættes 2 mL af medium til hver 35 mm parabol og frø ialt 5 x 10 4 celler pr. parabol, distribuere celler jævnt rundt om fadet. Inkuber de eksperimentelle prøver overnatning i standard kultur betingelser at tillade passende celle vedhæftet fil før trykbølge eksponering.
Bemærk: For fluorescerende imaging, celler skal være seedet på sterilt glas coverslips.
2. Chok Tube forsamling
figur 2 : EVOC Rig og chok Tube forsamling. (A) billede af EVOC riggen. (B) skematisk af chok tube apparater. Stød rør dimensioner omfatter en indre diameter på 59 mm og en samlet længde, herunder EVOC riggen 4.13 m. Længden af den drevne tube og EVOC rig totaler 2,71 m. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Bære steel toe arbejde støvler og en laboratoriekittel under forsamling procedurer.
- Indsæt to justeringsstregerne gennem to bolt huller fundet i det vandrette plan af outlet flange. Placer en nitril-gummi pakning ark over ende af justeringsstregerne, så den sidder mellem outlet flange og ex vivo orgel kultur (EVOC) rig.
Bemærk: EVOC riggen er en custom-designet armatur beregnet til brug med 35 mm petriskåle ( figur 2A). - Tillægger outlet flange stødrørs stødbølgehastighed EVOC rig ved at skubbe armaturet over justeringsstregerne, sikre, at det er orienteret korrekt således at den del, der holder petriskålen er placeret på sin base.
- Indsætte fire M24 bolte og skiver i de tilbageværende huller. Placer nødder, så de rører flange.
- Stramt Fastgør møtrikker og bolte sekventielt i en diagonalt symmetrisk mode mens visuelt kontrollere at EVOC rig og chok røret har med succes justeret.
- Tillægger EVOC rig en tryktransduceren og slutte den til den aktuelle datakilde ved hjælp af et sensorkabel. Derefter, ved hjælp af et BNC kabel, Tilslut den aktuelle kilde til oscilloskopet.
- Sikre at alle Udløsningsventiler og flow kontrol på chok røret er lukket. Åbne den indbyggede eksterne Trykluftforsynede og manuelt vende trykregulator med uret for at oplade magnetventil til 2,5 bar
- Åbne sikkerhedsventil på komprimeret gasflaske ved at dreje det mod uret 180°.
- Langsomt vende trykregulator, beliggende på toppen af gasflasken, med uret for at øge trykket til cirka 15 bar
Bemærk: Indstillingen pointen med denne regulator skal være lidt over den højeste sprængfyldt pres den tykkeste membran, der skal anvendes i forsøget. - Forbereder membraner ved at skære en 0,125 mm tyk plastfolie i 10 cm x 10 cm tern.
Bemærk: Tykkelsen af mellemgulvet vil korrelerer med det bristende pres, at ændre peak tryk af chok bølge (dvs. en tykkere membran vil resultere i en trykbølge med et større peak tryk; Tabel 1).
tabel 1: brast pres tilsvarende membran tykkelse og Peak tryk.
- Opret håndtag ud af tape, lave dem til toppen og bunden af mellemgulvet, og bruge dem omhyggeligt placere membran ved siden af den forreste lille flange ved underkroppræsentation kammer. Sikre, at mellemgulvet er lige og korrekt placeret før du lukker underkroppræsentation.
- Sikre dette ved hjælp af fire M24 bolte og møtrikker. Stramt Fastgør møtrikker og bolte sekventielt i en diagonalt symmetrisk mode.
3. Forberedelse af celler bare forud for trykbølge eksponering
- Forbered en væv laminar flow hood ved at udføre UV-sterilisering. Rengøres med en desinficerende løsning og 70% ethanol. Saml alle elementer er nødvendige for håndtering celler forudgående til/post-shock wave eksponering og Placer dem inden for de sterile hood.
Bemærk: Dette omfatter frisk medium, selvklæbende gas-gennemtrængelige membraner, steril saks, pipetter og pipette tips. - Overføre en 90 mm petriskål indeholdende tre eksperimentelle prøver fra rugemaskinen til sterile kølerhjelmen.
- Skæres en selvklæbende gas-gennemtrængelige membran ark (Se Tabel af materialer) i seks pladser, således at hver er store nok til at dække toppen af en 35 mm petriskål.
- Opsug medium fra 35 mm petriskål, låget lægges til den ene side og dække med to selvklæbende gas-gennemtrængelige membraner sektioner, sikre, at der er en tæt forsegling mellem membranen og kanten af fadet.
- Overføre prøven til EVOC riggen og fastgøre den til bunden af armaturet, således at toppen af fadet er justeret med den indre base stødrørs stødbølgehastighed.
4. Chok Tube Operation
- bære øre forsvarere, øjet briller, sikkerhedsstøvler og en laboratoriekittel når presse chok tube system.
- Drej kontrolknappen flow på regulator uret, så gas til at flyde ind i de fleksible slange tilsluttet stødrørs stødbølgehastighed trykluft cylinder.
- i bunden af kontrolpanelet, vælge enten den " dobbelt underkroppræsentation " inlet for en kortvarige chok wave eller den " Driver Tube " inlet øget bølge varighed.
- Kontakten på DC power source og oscilloskop at erhverve bølgeform data. Sat oscilloskop samplingfrekvens til 50,0 MS/s, med en rekord længde 1 m point. Angiv en række 50 mV for fyres på 2 bar og 100 mV for over 4 bar
- Tænder på de sikkerhed lyser ved hjælp af parameteren på væggen overfor kontrolpanelet.
Bemærk: Dette fortæller andre forskere ikke at komme ind i stuen når stødrørs stødbølgehastighed oplades. - Tænder på kontakten på solenoide kontrolboks lukke magnetventilen.
Bemærk: Denne sikkerhedsfunktion lukker en ventil, placeret på dobbelt underkroppræsentation kammer, gør det muligt for systemet at blive opkrævet. - På Kontrolpanel, åbne langsomt flow-styring ved at dreje knappen mod uret til gradvist at øge trykket i kompression kammer. Overvåge trykket ved hjælp af kontrolpanelets display.
- Når mellemgulvet brast pres er nået, mellemgulvet vil briste og en " bang " vil blive hørt. Hurtigt lukker flow-styring ved at dreje på drejeknappen.
Bemærk: Chok bølge vil rejse ned røret over celle prøven og ud i enden af røret. - Åbnes magnetventilen ved at deaktivere parameteren på solenoide kontrolboks og slukke sikkerhed lys (ved hjælp af parameteren på væggen overfor kontrolpanelet).
- Overføre cell sample den steril hætte, fjerne de klæbende gas-gennemtrængelige membraner og fyld skålen med 2 mL frisk vækstmedium. Cellerne kan anvendes straks for vurdering, som beskrevet i trin 5, eller returneres til rugemaskine for langsigtede undersøgelser.
5. Cellernes levedygtighed
- vurdere cellernes levedygtighed efter trykbølge eksponering ved hjælp af en kombination af en redox indikator analysen og den fluorescerende billeddannelse af levende og døde celler.
Bemærk: For fluorescerende imaging, celler skal være seedet på sterilt glas coverslips under afsnit 1: celle kultur og prøve forberedelse. Disse kan lægges i petriskåle 35-mm. - Overføre 200 µL af redox indikatoren reagens (Se Tabel af materialer) til hver eksperimentelle parabol direkte efter genopfyldning dem med 2 mL medium efter chokket bølge eksponering. Der inkuberes ved standard dyrkningsbetingelserne for 4 h.
- For hvert fad, overføre (i en mørk sterile hood) 2 x 100 µL delprøver til enten sort eller fjern 96-brønd plade, afhængigt af om fluorescens eller absorbans vil blive brugt til at vurdere rentabilitet.
- Overføre 96-brønd pladen til en passende Pladelæser monteret med de korrekte filtre og læses ved hjælp af excitation bands 530ex/590em for fluorescens eller 570 nm kombineret med en 600-nm reference for absorbans. Eksportere og gemme data.
- Analysere dataene for at identificere eventuelle forskelle trykbølge-eksponerede prøver og ikke-eksponerede kontrol, som dette kan indikere en dråbe i cellernes levedygtighed.
Bemærk: En negativ kontrol bør også indgå i det eksperimentelle design. Derudover interpolation af en standardkurve kan bruges til at beregne celle tal. - Opsug medium indeholdende redox indikator reagens. Erstatte det med 2 mL frisk medium og inkuberes celler på standard dyrkningsbetingelserne for 24 h.
- Gentage ovenstående trin efter behov for at få en anden levedygtighed tidspunkt.
- For de fluorescerende billeddannelse af levende og døde celler, Aspirér medium og vaske cellerne to gange i 1 mL PBS. Overføre 100 µL af den komplette reagens fundet i imaging kit (Se Tabel af materialer) til hver prøve og inkuberes ved stuetemperatur beskyttet mod lys for 15 min.
- Opsug reagenset og vaske når ved hjælp af 1 mL PBS. Bruger fin spids pincet, omhyggeligt fjerner coverslip fra 35 mm fad og læg den ansigt-ned på et glas mikroskopi dias.
- Erhverve billeder for hver prøve ved hjælp af en fluorescerende mikroskop (10 X mål linse, 0,50 numerisk blænde) udstyret med de korrekte excitations- og filtre (ex / em 488 nm/515 nm og 570 nm/602 nm).
Bemærk: Levende celler vil udsende intens, ensartet, grønne fluorescens. Døde eller døende celler med en kompromitteret cellulære membran vil optagelsen komponenten døde kit, som følge af udledningen af røde fluorescens, fundet overvejende i den nukleare område af cellen. - Bruge billedanalyse software til enten manuelt eller automatisk tælle antallet af levende og døde celler fra hvert billede.
Representative Results
Benytter den ovenfor beskrevne metode, blev celler dyrkes i en éncellelag udsat i tre eksemplarer til chokbølger genereret ved hjælp af et stød rør (figur 2B). Markører for cellernes levedygtighed er blevet vurderet. Bruger en redox indikator assay, konstateredes det, at anvendelsen af en 127 kPa chok bølge var i stand til at reducere levedygtigheden af dermal papilla celler i forhold til kontrol efter 24 h i kultur (figur 3). Anvendelsen af en trykbølge ≤72 kPa ikke reducere levedygtighed. For at støtte disse observationer, blev en fluorescerende billedet assay i stand til at fluorescently mærkning levende eller døde celler med grønne eller røde fluorophores, henholdsvis, brugt. Kvantificering af levende og døde celler fra 13 fluorescerende billeder pr. biologiske replikat demonstreret en reduktion i cellernes levedygtighed i de udsat for 127 kPa trykbølge sammenlignet med kontrol (figur 4). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukeys flere sammenligning test, med p < 0,05 anset for statistisk signifikant. Prøvestørrelse pr. gruppe udgjorde 9 for redox indikator assay og 39 for kvantitative fluorescens imaging analyse.
Figur 3 : Redox indikator Assay Data viser tidsforløb af cellernes levedygtighed efter trykbølge eksponering. Væsentligt blev færre celler observeret efter 24 h i 127-kPa trykbølge-eksponerede gruppe sammenlignet med ubehandlet kontrol. Den negative kontrol, som bestod af en 30-s behandling med 2% desinfektionsmiddel (se tabel materialer) viste signifikant færre celler både T0 og 24 timer i forhold til alle andre grupper. Hver søjle repræsenterer gennemsnit ± 1 standardafvigelse (SD); biologiske replikater, N = 3; tekniske replikater, n = 3. = p < 0,0001. * = p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Fluorescens Imaging. (A) kvantitative data indsamlet fra fluorescerende billeder af levende og døde celler fanget ved hjælp af et fluorescens mikroskop på 24 h efter trykbølge eksponering. Betydeligt færre levedygtige celler blev observeret i de 127 kPa (betyde = 93.42) chok bølge-eksponerede stikprøven sammenlignet med de 47 kPa (betyde = 98.18), 72 kPa (betyde = 98.87), og kontrollere grupper (betyde = 99.10). Ingen levedygtige celler blev observeret på gruppen negativ kontrol efter 24 timer (betyde = 0). (B) repræsentative fluorescens billeder. Grøn viser levende celler, mens røde viser døde celler. Hver box plot viser de øvre og nedre kvartiler med Tukey whiskers; biologiske replikater, N = 3; tekniske replikater, n = 13. = p < 0,0001. Skalalinjen = 300 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Primære skader fra eksponering til blast events er endnu ikke fuldt forstået. At identificere og forstå de mekanismer, der udløser blast-induceret skader, såsom traumatisk hjerne skade3,er4 og heterotopisk ossifikation6,7, vigtige første skridt til at udvikle effektive metoder til sygdomsforebyggelse. For at bidrage til at nå dette mål, er en række eksperimentelle systemer blevet udviklet for at replikere blast begivenhed eksponering11,12,13,14,18,19 . Den teknik beskrevet bruger her chok tube udstyr (figur 2) i stand til at affyre chokbølger på en vifte af pres på hele kroppen (dvs. gnaver), væv eller celler prøver. Evnen til at indlæse enkelte celletyper i stedet for hele væv giver mulighed for at analysere ud forskellige cellulære svar, som skader kan forekomme samtidigt via en række mekanismer1,2. For eksempel, for at modellere traumatisk kan hjerneskade, vurdering af enkelte celletyper såsom neuroner og astrocytter, tillade til identifikation af celle-specifikke skade. Også, det hele-orgel svar kan vurderes ved hjælp af hjernevæv. Både de enkelte celletyper og væv modellerne har værdi og kan give forskellige oplysninger. Det er også muligt at ændre mængden af luft, der er tryk til at generere chokket ved at vælge dobbelt-underkroppræsentation eller driver-tube indløbet. Dette styrer varigheden af chok bølge. En anden mulighed er at ændre mellemgulvet materiale og tykkelse til at ændre peak pres25.
En anden faktor til at overveje er interferens ende virkninger, som kan være til stede, når prøven boliger ligger i nærheden af exit stødrørs stødbølgehastighed, som den, der fandt på EVOC riggen beskrevet i det nuværende system. Chandra et al. kiggede på blast wave profiler findes på forskellige steder på en komprimering-drevet stødrørs stødbølgehastighed og fundet at Friedlander bølgeform bedst var repræsenteret på et sted dybt inde i chok tube15. Franks et al. også studerede sekundær læsning af prøven og fundet, at placeringen af en ende plade i slutningen af stødrørs stødbølgehastighed var i stand til at fjerne uønskede reflekterede bølger16. I betragtning af dataene, der findes i disse publikationer15,16, fremtidige ændringer at forbedre stød rør systemet beskrevet i denne artikel kan omfatte placering af EVOC rig på et dybere sted i drevet røret, eller Alternativt, optagelse af en ende plade på stødrørs stødbølgehastighed. Begrænsninger af den beskrevne metode kunne omfatte den relativt lave gennemløb af prøver. En enkelt bruger kan operere stødrørs stødbølgehastighed sikkert på en produktion på omkring 6-8 prøver pr. time. I øjeblikket, er systemet designet omkring brugen af enkelt 35-mm petriskåle. Større eksperimenter der indeholder flere grupper og biologiske replikater kan derfor være vanskeligt at opnå.
Denne metoder artikel viser, hvordan levedygtigheden af vedhængende dermal papilla celler var påvirket af eksponering for en enkelt trykbølge. En kortvarige chok bølge (< 10 ms) af ≤72 kPa ikke påvirkede levedygtighed i forhold til kontrol (figur 3 og figur 4). Derimod stimuleret en chokbølge på 127 kPa en betydelig nedgang i levedygtighed på 24 h efter blast, som det fremgår af både en redox indikator assay (figur 3) og fluorescerende billedanalyse (figur 4). Miller et al. rapporterede en tilsvarende reduktion i cellernes levedygtighed i rotte organotypic hippocampus skive kulturer, når celler blev udsat for et enten en 147 kPa eller 278 kPa chokbølge ved hjælp af en åben, helium-drevet stød rør14. I modsætning hertil er VandeVord et al. rapporterede, at der var ingen effekt på levedygtighed i rotte astrocytter udsat for kortvarige overtryk af > 200 kPa, selv om en barochamber blev brugt i stedet for en stød rør18. Det skal bemærkes, at det eksterne pres er afhængige af trykbølger, selvom dette skaber komplekse stress bølger inden for kroppen, derfor gør arten af lastning meget afhængige af de mekaniske egenskaber af væv eller celler. Yderligere karakterisering undersøgelser af de cellulære reaktion på blast begivenheder er påkrævet. Derudover ved at vurdere trykbølge eksponering på cellulært niveau, som vist i denne teknik, kan biologiske svar udløst af skaden, som den undertrykkelse af netbårne af signalering veje eller epigenetiske ændringer, identificeres og udforsket yderligere.
Afslutningsvis, beskriver dette arbejde brugen af et rustfrit stål stød rør og en modificeret EVOC rig at indarbejde primære cellekulturer. Chokbølger på en vifte af pres kan genereres og formeres over levende celler replikere de virkninger, der opstår fra udsættelse for en trykbølger. Denne protokol demonstrerer hvordan man kan evaluere cellernes levedygtighed, men mere langsigtede ændringer til individuelle celletyper kan også studeres. Gå fremad, planlægger vi at vurdere differential virkninger, at komplekse chokbølger kan fremkalde i forskellige celletyper, med formålet at fremme vores forståelse af blast-induceret primære skader.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende den finansielle støtte af Royal British Legion centrum for Blast skade undersøgelser til HA og finansiering fra den medicinske Forskningsråd (M01858X/1) til CAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM α, nucleosides | ThermoFisher | 22571020 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | ThermoFisher | 16000044 | Supplement to create complete growth media. |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15070-063 | Supplement to create complete growth media. |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher | 15400-054 | Dilute 1 in 10 before use. |
| CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented | Starlab | CC7682-4875 | |
| TC Dish (PS) 35 mm, 8.5 cm2 | Triple Red | TCD010035 | |
| Petri dish (PS) 90 x 14.2 mm no vent | VWR UK | 391-0453 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seals | ThermoFisher | AB-0718 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | ThermoFisher | R37601 | |
| Alamarblue cell viability reagent | Fisher Scientific | 13494309 | |
| Virkon tablets | VWR UK | 115-0020 | Use to create 2% solution as viability control reagent. |
| Dumont forceps | SurgicalTools | 11295-10 | Use to remove coverslips from petri dish. |
| Cover glass, square | VWR UK | 631-0125 | |
| Microscope slides | VWR UK | 631-1553 | |
| 96 Well plate, solid black | AppletonWoods | CC760 | Plate to be used for fluorescence measurements. |
| 96 Well plate, clear, (PS) | VWR UK | 734-1799 | Plate to be used for absorbance measurments. |
| Leica DMi1 Camera stand outfit | Leica Microsystems | Optical microscope used for cell culture. | |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton | Zeiss | Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging. | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer | 2104-0010A | Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings. |
| Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components | 785-0782 | Use to create shock tube diaphragm. |
| Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.05 mm | RS Components | 785-0786 | Use to creatw shock tube diaphragm. |
| Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.125 mm | RS Components | 785-0798 | Use to create shock tube diaphragm. |
| Current source power unit | Dytran Intruments Inc. | 4103C | Power source for 2300V1 sensor. |
| IEPE Pressure Sensor | Dytran Intruments Inc. | 2300V1 | Pressure sensor located on shock tube. |
| Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO 4104B | Use to gather and save sensor 2300V1 data. |
References
- Proud, W. G. The physical basis of explosion and blast injury processes. J R Army Med Corps. 159, Suppl 1 4-9 (2013).
- Born, C. T. Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction. Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).
- Kocsis, J. D., Tessler, A.
- Bass, C. R., et al. Brain Injuries from Blast. Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).
- Cernak, I. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. Kobeissy, F. H. , (2015).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).
- Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision. J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).
- Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J.
- Cho, S. -I., et al. Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear. PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).
- Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , Springer. (2016).
- Arun, P., et al. Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube. Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).
- Ahlers, S. T., et al. Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast. Front Neurol. 3, 32 (2012).
- Polfer, E. M., et al. The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification. Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).
- Miller, A. P., et al. Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Front Neurol. 6, 20 (2015).
- Chandra, N., et al. Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling. Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).
- Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).
- Reneer, D. V., et al. A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).
- VandeVord, P. J., et al. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).
- Kane, M. J., et al. Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration. Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).
- Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study. J Vis Exp. (56), (2011).
- Zhang, J., et al. Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury. PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).
- Bo, C., et al. Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples. AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
- Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications. JPCS. 500 (14), 142025 (2014).
