Summary
Begrijpen hoe cellen gemoduleerd worden door blootstelling aan schokgolven kunt achterhalen de mechanismen achter verwondingen uit blast gebeurtenissen geactiveerd. Dit protocol maakt gebruik van op maat gemaakte schok buis apparatuur te passen schokgolven op allerlei druk op monolayers van de cel en de latere effecten op de levensvatbaarheid van de cellen te kunnen identificeren.
Abstract
Blootstelling aan blast gebeurtenissen kan veroorzaken ernstige trauma aan vitale organen zoals de longen, oren en hersenen. Inzicht in de mechanismen achter dergelijke verwondingen blast-geïnduceerde is van groot belang gezien de recente trend naar het gebruik van explosieven in de moderne oorlogvoering en terrorist-gerelateerde incidenten. Om explosie veroorzaakte schade volledig te begrijpen, moeten we eerst kunnen om te repliceren van dergelijke evenementen van de ontploffing in een gecontroleerde omgeving met behulp van een reproduceerbare methode. In deze techniek met behulp van schok buis apparatuur, schokgolven op allerlei druk kan worden doorgegeven over levende cellen gekweekt in 2D en markeringen van de levensvatbaarheid van de cellen kunnen onmiddellijk worden geanalyseerd met behulp van een redox indicator assay en de fluorescerende beeldvorming van levende en dode cellen. Deze methode aangetoond dat de verhoging van de piek blast overdruk tot 127 kPa een aanzienlijke daling in de levensvatbaarheid van de cellen in vergelijking met onbehandelde controles kan stimuleren. Monsters zijn niet beperkt tot Adherente cellen, maar kunnen cel schorsingen, hele lichaam en weefsel monsters, door middel van kleine aanpassingen aan de schok buis setup. De exacte voorwaarden die weefsels en cellen voordoen wanneer blootgesteld aan een echte blast gebeurtenis repliceren is moeilijk. Technieken zoals gepresenteerd in dit artikel kunnen helpen schade drempels definiëren en identificeren van de transcriptionele en epigenetische veranderingen in cellen die uit blootstelling van de schokgolf voortvloeien.
Introduction
Met de recente tendens tot het gebruik van geïmproviseerde explosiemiddelen zijn in moderne oorlogvoering en terroristische acties op burgers, inzicht in de effecten van explosieve gebeurtenissen op het menselijk lichaam is van groot belang. Verwondingen die zijn verkregen door middel van blootstelling aan blast gebeurtenissen kunnen dodelijke en dodelijk, met de lichamelijke processen van letsel wordt onderverdeeld in vier categorieën. Primaire Blessures gevolg van directe blootstelling aan de Golf van de explosie, die lokaal met het lichaam in een druksterkte en vervolgens expansieve manier interageert, waardoor de verstoring van membranen en zachte weefsels1. Secundaire letsels zijn stomp trauma of penetrerend wonden veroorzaakt door effect met low-mass objecten met hoge snelheid door de ontploffing Golf afgevuurd. Tertiaire letsels ontstaan wanneer de ontploffing Golf heeft voldoende energie om te gooien van voorwerpen van hoogmis of personen tegen objecten. Tot slot, quaternaire blast verwondingen worden gedefinieerd door andere diverse blessures die niet bij de andere categorieën, zoals flash burns2 passen. Na blootstelling aan dergelijke gebeurtenissen blast omvatten primaire verwondingen traumatische hersenen letsel3,4,5, heterotopic ossificatie6,7, blast long letsel8, gehoorverlies 9, en anderen10.
Een vaak waargenomen golfvorm uit blast gebeurtenissen is de Friedlander Golf, vertegenwoordigen een vrije-veld, in tegenstelling tot een ingesloten-space, explosie. De golfvorm bestaat uit een blast front dat kan worden gedefinieerd als een scherp en snelle stijging van de positieve druk. Dit wordt onmiddellijk gevolgd door een ontploffing wind van rijdt met hoge snelheid en een release-golf die de druk onder het niveau van de atmosferische vermindert lucht. Een gedeeltelijke vacuüm wordt overgelaten aan de regio van de eerste explosie, die tot de langzame terugvoer van lucht leidt. De positieve en negatieve fasen van de Golf (figuur 1A) resulteren in de push-pull beweging van de hoogoven Golf1. Om te helpen ophelderen van de mechanismen achter primaire blast verwondingen, zijn experimentele modellen gemaakt om te produceren golfvormen, zoals de wave Friedlander, die cellen en weefsels zal worden geconfronteerd wanneer blootgesteld aan een echte blast-gebeurtenis. Huidige systemen in de literatuur genoemde omvatten schok buizen11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, de Kolsky bar20geavanceerde blast simulatoren21, de Split Hopkinson druk bar22en de recreatie van alternatieve blast gebeurtenissen in een gecontroleerde omgeving met behulp van pentaerytritol tetranitraat23. Ondanks de brede waaier van modellen beschikbaar beïnvloeden vele variabelen de schade ontploffing golven, met inbegrip van de pre stress toegepast, en de mechanische eigenschappen van de soorten individuele cellen of weefsels onder evaluatie24verkregen. Terwijl de studie van weefsel of organen licht op weefsel vervorming en bruto morfologische veranderingen opgelopen als gevolg van de gebeurtenissen van de ontploffing werpen kan, kunt analyse op cellulair niveau ontdekken transcriptionele en epigenetische veranderingen beïnvloed door de schokgolf.
Deze methoden beschreven een techniek voor het doorgeven van schokgolven op allerlei druk over levende cellen in een enkelgelaagde. Dit zorgt voor de onmiddellijke karakterisering van de levensvatbaarheid van de cellen, ophelderen van potentiële schade drempels van schokgolven. Bovendien, levensvatbare cellen kunnen worden teruggebracht naar standaard kweekomstandigheden en biologische effecten op lange termijn van de blast-gebeurtenis kunnen worden beoordeeld. Het protocol hieronder beschrijft twee cel levensvatbaarheid technieken die kunnen worden gebruikt op de cellen in de cultuur.
Figuur 1: Aanpassing van een golf Friedlander. (A) een onderlinge aanpassing van een Friedlander golf waargenomen op sensor 3 aan de schok-buis. (B) representatieve gegevens waaruit de profielen van de verschillende druk waargenomen bij sensoren 1, 2 en 3 op de buis van de schok. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Protocol
1. celkweek en bereiding van de monsters
- verkrijgen een geschikte cellijn (bijvoorbeeld dermale papilla cellen).
Opmerking: Het huidige protocol is ontworpen voor Adherente cellen, met rat dermale papilla fibroblasten van snorharen gebruikt als een model dat werd geïsoleerd. - Cultuur de cellen in een T-75 kolf met minimale essentiële middellange (MEM) α aangevuld met foetale runderserum van 10% en 1% penicilline streptomycine. De cellen op standaard kweekomstandigheden van 37 ° C en 5% CO 2 in een bevochtigde omgeving houden totdat ze 80% samenvloeiing.
- Het medium gecombineerd en wassen van de cellen tweemaal in Dulbecco ' s-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Distantiëren van de cellen van de kolf door ze aan het broeden in 2 mL trypsine/EDTA op standaard cultuur voorwaarden voor 5 min. kort controleren om ervoor te zorgen dat de cellen met succes hebben losgekoppeld van de kolf met behulp van een licht/fasecontrastmicroscoop (met een 10 X-objectief ).
- Voeg 4 mL gestolde voedingsbodem te neutraliseren de trypsinebehandeling reactie. De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis 15 mL.
- Centrifuge op 200 x g voor 4 min aan de pellet van de cellen. Langzaam gecombineerd de bovendrijvende substantie, niet te verjagen van de pellet verzorgen. Resuspendeer de pellet in medium 5 mL.
- Een hoeveelheid van 20 µL van de celsuspensie overbrengen in een schoon hemocytometer en met behulp van een microscoop voorzien van een 10 X-objectief cellen tellen.
- Bereiden de cellen voor de ontploffing door het plaatsen van drie 35 mm gerechten binnen een 90 mm schotel. Label hen op de juiste manier. Voeg 2 mL medium aan elk gerecht 35 mm en zaad van een totaal van 5 x 10 4 cellen per schotel, verspreiden de cellen gelijkmatig rond de schotel. Incubeer de experimentele monsters overnachting in standaard kweekomstandigheden te voorzien in adequate cel bijlage vóór de blootstelling van de schokgolf.
Opmerking: Voor fluorescerende imaging, cellen moeten worden overgeënt op steriele glazen coverslips.
2. Schok binnenband
Figuur 2 : EVOC Rig en Shock Tube vergadering. (A) afbeelding van de EVOC tuig. (B) Schematische voorstelling van de schok buis apparatuur. Schok buis dimensies bevatten een inwendige diameter van 59 mm en een totale lengte, met inbegrip van de EVOC tuig, 4.13 m. De lengte van de gedreven buis en de EVOC tuig totalen 2.71 m. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Staal-teen werk laarzen en een laboratorium jas dragen tijdens de vergadering procedures.
- Invoegen de bars van de twee uitlijning door middel van de twee bout gaten gevonden in het horizontale vlak van de uitlaat flens. Plaats een nitril-rubber pakking vel op het eind van de balken uitlijning zodat het zit tussen de uitlaat flens en de ex vivo-rig van het orgel-cultuur (EVOC).
Opmerking: De EVOC rig is een douane-ontworpen meubilair bedoeld voor gebruik met 35 mm petrischalen ( figuur 2A). - De EVOC rig hechten aan de uitlaat flens van de schok-buis door te schuiven van het armatuur over de uitlijning balken, ervoor te zorgen dat het georiënteerde correct zodat de sectie die in het bezit van de petrischaal gelegen aan de voet is.
- Vier M24 bouten en sluitringen invoegen in de resterende gaten. Plaats de noten zodat ze de flens raken.
- Strak Fast de moeren en bouten opeenvolgend in een diagonaal symmetrische mode terwijl visueel controleren dat de EVOC rig en schok-buis met succes hebt uitgelijnd.
- Een drukopnemer hechten aan de EVOC tuig en sluit deze aan op de stroombron met behulp van een sensor kabel. Via een BNC-kabel, sluit vervolgens de huidige bron aan de oscilloscoop.
- Zorg ervoor dat alle kleppen vrijlaat en controles op de schok buis stromen zijn gesloten. Open de ingebouwde externe persluchtleiding en handmatig Draai de drukregelaar met de klok mee in rekening te brengen van de spoel aan 2,5 bar.
- Openen van de klep van de veiligheid op de fles met samengeperst gas door tegenwijzerzin 180° draaien.
- Draaien langzaam de drukregelaar, gelegen op de top van de gasfles, met de klok mee te verhogen de druk ongeveer 15 bar.
Opmerking: Het punt van de instelling van deze regulator moet worden iets boven de hoogste barstdruk van de dikste middenrif die moet worden gebruikt in de experiment. - Bereiden het pessarium door het snijden van een 0,125 mm dik plastic vel in vierkanten van 10 x 10 cm.
Opmerking: De dikte van het membraan zal correleren met de barst druk, verandering van de druk van de piek van de schokgolf (dat wil zeggen, een dikkere diafragma in een schokgolf met een grotere druk van de piek resulteren zal; Tabel 1).
tabel 1: Burst druk die overeenkomt met diafragma dikte en piek druk.
- grepen uit tape maken, corrigeren naar de boven- en onderkant van het middenrif, en ze gebruiken om het middenrif naast de voorste kleine flens plaats door de stuitligging kamer. Zorgen dat het middenrif rechte en correct gepositioneerd is vóór het sluiten van de stuitligging.
- Beveiligen dit met behulp van vier M24 bouten en moeren. Strak Fast de moeren en bouten opeenvolgend in een diagonaal symmetrische mode.
3. Voorbereiding van cellen alleen voorafgaand aan de blootstelling van de schokgolf
- voorbereiden een weefsel laminaire flow hood door ultraviolet sterilisatie uit te voeren. Schoon te maken met een desinfecterende oplossing en 70% ethanol. Verzamelen van alle items die nodig zijn voor behandeling voorafgaande aan/na-shock cellen wave blootstelling en plaats ze binnen de steriele kap.
Opmerking: Dit omvat verse medium, zelfklevende gas-permeabele membranen, steriele schaar, pipetten en Pipetteer tips. - Overbrengen van een 90 mm petrischaal met drie experimentele monsters uit de incubator aan de steriele kap.
- Knippen een zelfklevende gas-permeabel membraan sheet (Zie de Tabel van materialen) in zes vierkanten, zodanig dat elk groot genoeg ter dekking van de bovenkant van een 35 mm petrischaal.
- Het medium van de 35 mm petrischaal gecombineerd, plaats het deksel aan de ene kant, en bedek met twee zelfklevende gas-permeabele membranen secties, ervoor te zorgen dat er een goede afdichting tussen het membraan en de rand van de schotel is.
- Overbrengen van het monster naar de EVOC tuig en veilig aan de basis van het armatuur zodat de bovenkant van de schotel is uitgelijnd met de innerlijke base van de schok buis.
4. Schok buis operatie
- verdedigers van oor, oog bril, Veiligheidslaarzen en een laboratorium jas dragen wanneer de schok buis systeem Drukbehandeling.
- Inschakelen de bedieningsknop van de stroom de regelgever met de klok mee, waardoor gas naar stroom in de flexibele slang de perslucht cilinder verbinden met de schok buis.
- Aan de onderkant van het control panel, selecteer het " dubbele staartstuk " inlaat voor een korte duur schok wave of de " Driver buis " inlaat voor de duur van een grotere golf.
- Zet de DC voedingsbron en oscilloscoop om de golfvorm gegevens te vergaren. De oscilloscoop samplingfrequentie ingesteld op 50.0 MS/s, met een record lengte van 1 M punten. Een reeks van 50 mV voor ontslag bij 2 bar en 100 mV voor boven de 4 bar
- Zet de lichten van de veiligheid met behulp van de schakelaar op de muur tegenover het control panel.
Opmerking: Dit vertelt andere onderzoekers niet om de kamer wanneer de buis van de schok wordt opgeladen. - Zet de schakelaar op de solenoïde control box te sluiten de solenoïde.
Opmerking: Deze veiligheidsfunctie sluit een klep bevindt zich op de dubbele stuitligging kamer, waardoor het systeem ten laste. - Op het bedieningspaneel, opent langzaam de datatransportbesturing door te draaien aan de knop tegen de klok in daarna langzaam verhoogt de druk in de zaal van de compressie. Controleren van de druk met behulp van de controle-panelbeeldscherm.
- Zodra het middenrif druk barsten is bereikt, het middenrif zal scheuren en een " bang " zal worden gehoord. Snel de datatransportbesturing door te draaien aan de knop sluiten.
Opmerking: De schokgolf zal reizen vaststelling van de buis over de cel-monster en uit het uiteinde van de buis. - De solenoïde door het uitschakelen van de schakelaar op de solenoïde control box openen en schakelen het Veiligheidslicht (met behulp van de schakelaar op de muur tegenover het control panel).
- Overbrengen van het monster van de cel naar de steriele kap, verwijderen van de lijm gas-permeabele membranen en vul de schotel met 2 mL verse groeimedium. De cellen kunnen worden onmiddellijk gebruikt voor beoordeling, zoals beschreven in stap 5, of keerde terug naar de incubator voor langere termijn studies.
5. Levensvatbaarheid van cellen
- beoordelen de levensvatbaarheid van de cellen na de schokgolf blootstelling met behulp van de combinatie van een redox indicator assay en de fluorescerende beeldvorming van levende en dode cellen.
Opmerking: Voor fluorescerende imaging, cellen moeten worden overgeënt op steriele glazen coverslips tijdens deel 1: cel van cultuur en sample voorbereiding. Deze kunnen worden geplaatst binnen de petrischaaltjes 35-mm. - Transfer 200 µL van het reagens redox indicator (Zie de Tabel van materialen) aan iedere experimentele schotel direct na het bijvullen van hen met 2 mL middellange post schok wave blootstelling. Incubeer bij standaard kweekomstandigheden voor 4 h.
- Overbrengen (in een donkere steriele kap) 2 x 100 µL aliquots ofwel een zwarte of wissen van 96-wells-plaat, afhankelijk van of fluorescentie- of absorptie worden gebruikt voor het beoordelen van de levensvatbaarheid voor elk gerecht,.
- Overbrengen van de 96-wells-plaat naar een passende afleesapparaat uitgerust met de juiste filters en gelezen met behulp van excitatie bands 530ex/590em voor fluorescentie- of 570 nm gecombineerd met een verwijzing van de 600-nm voor absorptie. Exporteren en opslaan van de gegevens.
- Analyseren van de gegevens ter identificatie van eventuele verschillen tussen monsters schokgolf-blootgesteld en niet zichtbare besturingselementen, zoals dit op een daling in de levensvatbaarheid van de cellen duiden kan.
Opmerking: Een negatieve controle moet ook worden opgenomen in de proefopzet. Anderzijds de interpolatie van een standaard curve kan worden gebruikt voor het berekenen van de cel getallen. - Gecombineerd het medium met de redox indicator reagens. 2 mL verse voedingsbodem te vervangen en Incubeer de cellen bij standaard kweekomstandigheden voor 24 h.
- Herhaal de bovenstaande stappen als nodig is om het verkrijgen van een tweede tijdstip van levensvatbaarheid.
- Voor de fluorescerende beeldvorming van levende en dode cellen, gecombineerd het medium en wassen van de cellen tweemaal in 1 mL PBS. Breng 100 µL van het volledige reagens gevonden in de beeldvorming kit (Zie de Tabel van materialen) aan elk monster en Incubeer bij kamertemperatuur beschermd tegen licht voor 15 min.
- Gecombineerd het reagens en wassen zodra met behulp van 1 mL PBS. Met fijne punt pincet, verwijder voorzichtig het dekglaasje aan van de 35 mm-schotel en plaats deze face down op een glasplaatje microscopie.
- Ophaal beelden voor elk monster met behulp van een fluorescente microscoop (10 X objectief, 0,50 numerieke diafragma) uitgerust met de juiste filters voor excitatie en emissie (ex / em 488 nm/515 nm en 570 nm/602 nm).
Opmerking: De levende cellen zal intens, uniform, groene fluorescentie uitstoten. Dood of stervende cellen met een gecompromitteerde cellulaire membraan zal opname de dode kit component, wat resulteert in de uitstoot van rode fluorescentie, voornamelijk in de nucleaire regio van de cel gevonden. - Gebruiken beeldanalyse software om ofwel handmatig of automatisch het aantal levende en dode cellen van elke afbeelding.
Representative Results
Met behulp van de hierboven beschreven methode, werden cellen gekweekt in een enkelgelaagde blootgesteld in drievoud naar schokgolven gegenereerd met behulp van een schok-buis (figuur 2B). Markers van de levensvatbaarheid van de cellen werden beoordeeld. Met behulp van een redox indicator assay, bleek dat de toepassing van een schokgolf van 127 kPa kunnen aanzienlijk verminderen de levensvatbaarheid van dermale papilla cellen ten opzichte van besturingselementen na 24 uur in cultuur (Figuur 3). De toepassing van een schokgolf ≤72 kPa deed levensvatbaarheid niet verminderen. Ter ondersteuning van deze opmerkingen, werd een fluorescerende afbeelding assay kunnen fluorescently etikettering levende of dode cellen met groene of rode fluorophores, respectievelijk gebruikt. De kwantificering van levende en dode cellen uit 13 fluorescerende beelden per biologische repliceren aangetoond een vermindering in de levensvatbaarheid van de cellen in die blootgesteld aan de schokgolf 127 kPa in vergelijking met het besturingselement (Figuur 4). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een one-way ANOVA gevolgd door Tukey van meerdere vergelijkingstest, met p < 0.05 geacht statistisch significant. De grootte van de steekproef per groep bedroeg 9 voor de redox indicator assay en 39 voor de beeldvorming analyse van kwantitatieve fluorescentie.
Figuur 3 : Levensvatbaarheid van de cellen van de redox Indicator Assay gegevens waaruit tijdsverloop van na blootstelling van de schokgolf. Aanzienlijk werden minder cellen waargenomen na 24 h in de 127-kPa schokgolf-blootgesteld groep in vergelijking met de onbehandeld controlegewas. De negatieve controle dat bestond uit een 30-s behandeling met 2% ontsmettingsmiddel (Zie de tabel van materialen) bleek aanzienlijk minder cellen op zowel T0 en 24 h ten opzichte van alle andere groepen. Elke staaf vertegenwoordigt de gemiddelde ± 1 standaarddeviatie (SD); biologische replicaten, N = 3; technisch wordt gerepliceerd, n = 3. p = < 0,0001. * = p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Fluorescentie Imaging. (A) kwantitatieve gegevens verzameld van fluorescerende beelden van levende en dode cellen gevangen met behulp van een fluorescentie Microscoop op 24u na schokgolf blootstelling. Aanzienlijk minder levensvatbare cellen werden waargenomen in de 127 kPa (betekenen = 93.42) schokgolf-blootgesteld monster ten opzichte van de 47 kPa (betekenen = 98.18), 72 kPa (betekenen = 98.87), en controlegroepen (betekenen = 99.10). Geen levensvatbare cellen werden waargenomen op de negatieve controlegroep na 24 h (betekenen = 0). (B) vertegenwoordiger fluorescentie beelden. Groen toont levende cellen, terwijl rood dode cellen toont. Elke Boxplot toont de bovenste en onderste kwartielen met Tukey snorharen; biologische replicaten, N = 3; technisch wordt gerepliceerd, n = 13. p = < 0,0001. Schaal bar = 300 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Primaire verwondingen verkregen blootstelling aan blast gebeurtenissen zijn nog niet volledig begrepen. Identificeren en inzicht in de mechanismen die leiden tot de explosie veroorzaakte verwondingen, zoals traumatische hersenen letsel3,zijn4 en heterotopic ossificatie6,7, belangrijke eerste stappen voor de ontwikkeling van effectieve methoden van profylaxe. Om te helpen dit doel bereiken, zijn een aantal experimentele systemen ontwikkeld om te repliceren blast gebeurtenis blootstelling11,12,13,14,18,19 . De techniek beschreven hier gebruikt schok buis apparatuur (Figuur 2) kan afvuren schokgolven op een aantal van de druk op het hele lichaam (dat wil zeggen, knaagdier), weefsel of celsteekproeven. De mogelijkheid om individuele celtypen in plaats van hele weefsels geeft de mogelijkheid om het parseren uit verschillende cellulaire reacties, zoals schade gelijktijdig via een aantal mechanismen1,2 plaatsvinden kan. Bijvoorbeeld, om het model traumatische kunnen hersenletsel, de beoordeling van individuele celtypen, zoals neuronen en astrocyten, zorgen voor de identificatie van cel-specifieke schade. Ook, kan het antwoord geheel-orgel worden beoordeeld met behulp van hersenweefsel. Zowel de individuele celtypes en de weefsel specimens waarde hebben en verschillende informatie kunnen geven. Het is ook mogelijk om te veranderen de hoeveelheid lucht die voor het genereren van de schok door het selecteren van de inlaat van de dubbel-stuitligging of stuurprogramma-buis is drukkend. Hiermee wordt de duur van de schokgolf. Een andere mogelijkheid is om de middenrif materiaal en dikte te wijzigen van de piek druk25te wijzigen.
Een andere factor die meespeelt zijn storende einde effecten die kunnen aanwezig zijn wanneer de steekproef behuizing bevindt zich dicht bij de afslag van de schok-buis, zoals die gevonden op het tuig van de EVOC beschreven in het huidige stelsel. Chandra et al. blast Golf profielen gevonden op verschillende locaties op een buis van de compressie-gedreven schok en vond dat de golfvorm Friedlander best was vertegenwoordigd op een locatie die diep binnen de schok buis15gekeken. Kuriakose et al. ook studeerde secundaire laden van het monster en vond dat de plaatsing van een eind-plaat aan het einde van de buis van de schok was in staat om het elimineren van ongewenste teruggekaatste golven16. Gezien de gegevens gevonden in deze publicaties15,16, toekomstige wijzigingen ter verbetering van de schok buis systeem zoals beschreven in dit artikel kunnen betrekking hebben op de plaatsing van de EVOC tuig op een diepere plek binnen de gedreven buis of, u kunt ook de opneming van een eind-plaat op de buis van de schok. Beperkingen van de beschreven methode kunnen onder meer de relatief lage doorvoersnelheid van monsters. Een enkele gebruiker kan werken de schok buis veilig op een output van rond 6-8 monsters per uur. Op dit moment is het systeem ontworpen rond het gebruik van één 35-mm petrischalen. Grotere experimenten met meerdere groepen en biologische replicaten kunnen dus moeilijk te bereiken.
Deze methoden artikel toont aan hoe de levensvatbaarheid van aanhangend dermale papilla cellen werd beïnvloed door blootstelling aan een enkele schokgolf. Een schokgolf van korte duur (< 10 ms) ≤72 kPa deed geen afbreuk doen aan de levensvatbaarheid in vergelijking met het besturingselement (Figuur 3 en Figuur 4). Een schokgolf bij 127 kPa gestimuleerd daarentegen een aanzienlijke daling in de levensvatbaarheid op 24u na blast, zoals blijkt uit zowel een redox indicator assay (Figuur 3) en fluorescerende beeldanalyse (Figuur 4). Miller et al. rapporteerde een vergelijkbare vermindering in de levensvatbaarheid van de cellen in rat organotypic hippocampal segment culturen wanneer cellen werden blootgesteld aan een of een 147 kPa of 278 kPa schokgolf met behulp van een open, helium-gedreven schok buis14. In tegenstelling, VandeVord et al. gemeld dat er geen effect op leefbaarheid in rat astrocyten blootgesteld aan een overdruk van de korte duur van was > 200 kPa, hoewel een barochamber werd gebruikt in plaats van een schok buis18. Opgemerkt moet worden dat de druk van buitenaf afhankelijk van de hoogoven Golf, is hoewel dit golven van de complexe stress in het lichaam maakt, waardoor de aard van de lading sterk afhankelijk van de mechanische eigenschappen van de weefsels of cellen. Karakterisering van de aanvullende studies van de cellulaire reactie op gebeurtenissen van de ontploffing is vereist. Bovendien, door beoordeling schokgolf blootstelling op cellulair niveau, zoals in deze techniek, biologische reacties teweeggebracht van de schade, zoals de verstoring van de signalering trajecten of epigenetische veranderingen, kunnen worden geïdentificeerd en verder onderzocht.
Kortom, beschrijft dit werk het gebruik van een schok van de roestvrij stalen buis en een gemodificeerde EVOC tuig te nemen primaire celculturen. Schokgolven op allerlei druk kan worden gegenereerd en doorgegeven over levende cellen om te repliceren de effecten die zich voordoen door blootstelling aan een blast Golf. Dit protocol laat zien hoe om te evalueren van de levensvatbaarheid van de cellen, maar op langere termijn wijzigingen in afzonderlijke celtypes kunnen ook worden bestudeerd. Doorgaand, we zijn van plan de differentiële effecten die complexe schokgolven in verschillende celtypen, met als doel het bevorderen van ons begrip van blast-geïnduceerde primaire verwondingen kunnen uitlokken.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij willen erkennen van de financiële steun van het Royal British Legion centrum voor Blast letsel Studies naar HA en financiering van de Medical Research Council (M01858X/1) van CAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM α, nucleosides | ThermoFisher | 22571020 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | ThermoFisher | 16000044 | Supplement to create complete growth media. |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15070-063 | Supplement to create complete growth media. |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher | 15400-054 | Dilute 1 in 10 before use. |
| CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented | Starlab | CC7682-4875 | |
| TC Dish (PS) 35 mm, 8.5 cm2 | Triple Red | TCD010035 | |
| Petri dish (PS) 90 x 14.2 mm no vent | VWR UK | 391-0453 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seals | ThermoFisher | AB-0718 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | ThermoFisher | R37601 | |
| Alamarblue cell viability reagent | Fisher Scientific | 13494309 | |
| Virkon tablets | VWR UK | 115-0020 | Use to create 2% solution as viability control reagent. |
| Dumont forceps | SurgicalTools | 11295-10 | Use to remove coverslips from petri dish. |
| Cover glass, square | VWR UK | 631-0125 | |
| Microscope slides | VWR UK | 631-1553 | |
| 96 Well plate, solid black | AppletonWoods | CC760 | Plate to be used for fluorescence measurements. |
| 96 Well plate, clear, (PS) | VWR UK | 734-1799 | Plate to be used for absorbance measurments. |
| Leica DMi1 Camera stand outfit | Leica Microsystems | Optical microscope used for cell culture. | |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton | Zeiss | Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging. | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer | 2104-0010A | Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings. |
| Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components | 785-0782 | Use to create shock tube diaphragm. |
| Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.05 mm | RS Components | 785-0786 | Use to creatw shock tube diaphragm. |
| Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.125 mm | RS Components | 785-0798 | Use to create shock tube diaphragm. |
| Current source power unit | Dytran Intruments Inc. | 4103C | Power source for 2300V1 sensor. |
| IEPE Pressure Sensor | Dytran Intruments Inc. | 2300V1 | Pressure sensor located on shock tube. |
| Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO 4104B | Use to gather and save sensor 2300V1 data. |
References
- Proud, W. G. The physical basis of explosion and blast injury processes. J R Army Med Corps. 159, Suppl 1 4-9 (2013).
- Born, C. T. Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction. Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).
- Kocsis, J. D., Tessler, A.
- Bass, C. R., et al. Brain Injuries from Blast. Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).
- Cernak, I. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. Kobeissy, F. H. , (2015).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).
- Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision. J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).
- Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J.
- Cho, S. -I., et al. Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear. PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).
- Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , Springer. (2016).
- Arun, P., et al. Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube. Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).
- Ahlers, S. T., et al. Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast. Front Neurol. 3, 32 (2012).
- Polfer, E. M., et al. The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification. Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).
- Miller, A. P., et al. Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Front Neurol. 6, 20 (2015).
- Chandra, N., et al. Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling. Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).
- Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).
- Reneer, D. V., et al. A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).
- VandeVord, P. J., et al. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).
- Kane, M. J., et al. Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration. Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).
- Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study. J Vis Exp. (56), (2011).
- Zhang, J., et al. Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury. PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).
- Bo, C., et al. Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples. AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
- Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications. JPCS. 500 (14), 142025 (2014).
