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Bioengineering

इन विट्रो में प्राथमिक ब्लास्ट प्रभाव का मूल्यांकन

Published: September 18, 2017 doi: 10.3791/55618
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Imperial College London

Summary

समझ कैसे कोशिकाओं सदमे तरंगों को जोखिम से संग्राहक रहे है विस्फोट की घटनाओं से ट्रिगर चोटों के पीछे तंत्र की पहचान करने में मदद कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल सेल monolayers करने के लिए दबाव की एक सीमा पर सदमे तरंगों को लागू करने के लिए और सेल व्यवहार्यता पर बाद में प्रभाव की पहचान करने के लिए कस्टम निर्मित सदमे ट्यूब उपकरण का उपयोग करता है ।

Abstract

विस्फोट की घटनाओं के लिए जोखिम ऐसे फेफड़ों, कान के रूप में महत्वपूर्ण अंगों को गंभीर आघात का कारण बन सकता है, और मस्तिष्क । इस तरह के विस्फोट प्रेरित चोटों के पीछे तंत्र को समझना बहुत आधुनिक युद्ध और आतंकवादी से संबंधित घटनाओं में विस्फोटकों के उपयोग की दिशा में हाल की प्रवृत्ति पर विचार महत्व का है । विस्फोट प्रेरित चोट पूरी तरह से समझने के लिए, हम पहली बार एक प्रतिलिपि विधि का उपयोग कर एक नियंत्रित वातावरण में इस तरह के विस्फोट की घटनाओं को दोहराने में सक्षम होना चाहिए । सदमे ट्यूब उपकरण का उपयोग कर इस तकनीक में, दबाव की एक सीमा पर सदमे तरंगों लाइव 2d में हो कोशिकाओं पर प्रचारित किया जा सकता है, और सेल व्यवहार्यता के मार्करों तुरंत एक redox संकेतक परख और जीना और मृत कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । इस विधि का प्रदर्शन किया है कि पीक विस्फोट अधिक दबाव बढ़ाने के लिए १२७ केपीए कोशिका व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण गिरावट को उत्तेजित कर सकते है जब अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में । परीक्षण के नमूने अनुयाई कोशिकाओं तक सीमित नहीं हैं, लेकिन शॉक ट्यूब सेटअप करने के लिए छोटे संशोधनों के माध्यम से सेल सस्पेंशन, पूरे शरीर और ऊतक के नमूनों, शामिल कर सकते हैं । सटीक शर्तों कि ऊतकों और कोशिकाओं को जब एक वास्तविक विस्फोट घटना के संपर्क में अनुभव नकल मुश्किल है । ऐसी तकनीक इस आलेख में प्रस्तुत एक के रूप में क्षति थ्रेसहोल्ड को परिभाषित करने और कोशिकाओं है कि सदमे लहर जोखिम से उठता है के भीतर transcriptional और epigenetic परिवर्तन की पहचान करने में मदद कर सकते हैं ।

Introduction

आधुनिक युद्ध और नागरिकों पर आतंकवादी कार्रवाई में तात्कालिक विस्फोटक उपकरणों के उपयोग की दिशा में हाल ही में रुझान के साथ, मानव शरीर पर विस्फोटक घटनाओं के प्रभाव को समझना बहुत महत्व का है । विस्फोट की घटनाओं के लिए जोखिम के माध्यम से प्राप्त चोटों घातक और घातक हो सकता है, चोट की शारीरिक प्रक्रियाओं के साथ चार श्रेणियों में विभाजित किया जा रहा है । प्राथमिक चोटों विस्फोट लहर है, जो एक संपीड़न और बाद में विशाल तरीके से शरीर के साथ स्थानीय स्तर पर बातचीत करने के लिए प्रत्यक्ष जोखिम से परिणाम, झिल्ली और कोमल ऊतकों के विघटन के कारण1. माध्यमिक चोटों कुंद आघात या कम द्रव्यमान विस्फोट लहर से उच्च वेग में चालित वस्तुओं के साथ प्रभाव की वजह से घावों को शामिल । तृतीयक चोट तब होती है जब विस्फोट की लहर के लिए पर्याप्त उच्च मास या वस्तुओं के खिलाफ व्यक्तियों की वस्तुओं फेंक ऊर्जा है । अन्त में, चतुर्धातुक विस्फोट चोटों अन्य विविध चोटों है कि अन्य श्रेणियों के लायक नहीं है द्वारा परिभाषित कर रहे हैं, जैसे फ्लैश जलता है2. इस तरह के विस्फोट की घटनाओं के लिए जोखिम के बाद, प्राथमिक चोटों दर्दनाक मस्तिष्क चोट3,4,5, heterotopic हड्डी6,7, विस्फोट फेफड़ों की चोट8, सुनवाई के नुकसान शामिल 9, और अंय10।

विस्फोट की घटनाओं से एक आमतौर पर मनाया तरंग Friedlander लहर है, एक मुक्त क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करने के रूप में एक संलग्न-अंतरिक्ष, विस्फोट का विरोध किया । तरंग एक विस्फोट सामने है कि सकारात्मक दबाव में एक तेज और तेजी से वृद्धि के रूप में परिभाषित किया जा सकता है के होते हैं । यह तुरंत हवा के एक विस्फोट हवा के बाद उच्च गति और एक रिलीज की लहर है कि वायुमंडलीय स्तर से नीचे करने के लिए दबाव कम कर देता है पर चलती है । एक आंशिक शूंय प्रारंभिक विस्फोट के क्षेत्र में छोड़ दिया है, जो हवा की धीमी backflow में परिणाम है । लहर के सकारात्मक और नकारात्मक चरणों (आंकड़ा 1a) विस्फोट लहर1के धक्का-पुल आंदोलन में परिणाम. प्राथमिक विस्फोट चोटों के पीछे तंत्र स्पष्ट मदद करने के लिए, प्रयोगात्मक मॉडल ऐसी Friedlander लहर है, जो कोशिकाओं और ऊतकों जब एक वास्तविक विस्फोट घटना के संपर्क में सामना करेंगे के रूप में waveforms का उत्पादन करने के लिए बनाया गया है । वर्तमान में साहित्य में सूचीबद्ध सिस्टम सदमे ट्यूबों11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, Kolsky बार20, उंनत ब्लास्ट सिमुलेटर21, विभाजन Hopkinson दबाव बार22, और एक नियंत्रित वातावरण में वैकल्पिक विस्फोट की घटनाओं के मनोरंजन का उपयोग कर pentaerythritol tetranitrate23. उपलब्ध मॉडलों की एक विस्तृत श्रृंखला के बावजूद, कई चर विस्फोट तरंगों से प्राप्त की चोट को प्रभावित, पूर्व सहित तनाव को लागू किया, और यांत्रिक गुणों के, व्यक्तिगत कोशिका प्रकार या24मूल्यांकन के तहत ऊतकों । जबकि ऊतक या अंगों के अध्ययन ऊतक विरूपण और सकल रूपात्मक विस्फोट घटनाओं का एक परिणाम के रूप में निरंतर परिवर्तन पर प्रकाश डाला जा सकता है, सेलुलर स्तर पर विश्लेषण transcriptional और epigenetic परिवर्तन सदमे की लहर से प्रभावित उजागर कर सकते हैं ।

इस विधि लेख एक monolayer में जीवित कोशिकाओं पर दबाव की एक सीमा पर सदमे तरंगों का प्रचार करने के लिए एक तकनीक का वर्णन है । यह कोशिका व्यवहार्यता के तत्काल लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, सदमे तरंगों से elucidating संभावित नुकसान थ्रेसहोल्ड । इसके अलावा, व्यवहार्य कोशिकाओं मानक संस्कृति शर्तों को वापस किया जा सकता है, और विस्फोट घटना से दीर्घकालिक जैविक प्रभाव का आकलन किया जा सकता है । नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है दो कोशिका व्यवहार्यता तकनीक है कि संस्कृति में कोशिकाओं पर इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: एक Friedlander लहर के सन्निकटन । (क) एक Friedlander लहर के एक सन्निकटन सदमे ट्यूब पर सेंसर 3 पर मनाया. (B) विभिंन दबाव प्रोफ़ाइल दिखाने वाले प्रतिनिधि डेटा 1, 2, और शॉक ट्यूब पर 3 सेंसर पर मनाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. सेल कल्चर और सैंपल वडा

  1. एक उपयुक्त सेल लाइन (जैसे, अधययन papilla कोशिकाओं) प्राप्त करें ।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल अनुयाई कोशिकाओं के लिए डिजाइन किया गया है, चूहे के साथ चमड़े का papilla एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया vibrissae से अलग fibroblasts ।
  2. संस्कृति एक टी में कोशिकाओं ७५ ंयूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) युक्त कुप्पी & #945; 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन streptomycin के साथ पूरक । कोशिकाओं के मानक संस्कृति शर्तों पर रखें ३७ & #176; ग और 5% कं 2 एक humidified वातावरण में जब तक वे ८०% संगम तक पहुंचने ।
  3. महाप्राण और Dulbecco & #39; एस फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) में दो बार कोशिकाओं को धो लें । अलग के लिए मानक संस्कृति की स्थिति में उंहें trypsin/EDTA के 2 मिलीलीटर में मशीन द्वारा कुप्पी से कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए । संक्षेप में यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को सफलतापूर्वक एक प्रकाश का उपयोग कर कुप्पी से असंबद्ध है की जांच करें/चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (एक 10x उद्देश्य लेंस के साथ ).
  4. trypsinization प्रतिक्रिया बेअसर करने के लिए संस्कृति माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें । एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
  5. 4 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक कोशिकाओं गोली । धीरे महाप्राण supernatant, देखभाल करने के लिए गोली नहीं उखाड़ लेना । मध्यम के 5 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित.
  6. अंतरण a 20 & #181; L aliquot एक साफ hemocytometer करने के लिए सेल निलंबन के और एक 10x उद्देश्य लेंस के साथ सज्जित एक खुर्दबीन का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
  7. एक ९० mm डिश के अंदर ३ ३५ mm व्यंजन रखकर ब्लास्ट के लिए सेल तैयार करते हैं । उंहें उचित लेबल । प्रत्येक ३५ mm डिश के लिए मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और बीज 5 x 10 4 पकवान प्रति कोशिकाओं की कुल, पकवान के आसपास समान रूप से कोशिकाओं का वितरण । मानक संस्कृति की स्थिति में रातोंरात प्रयोगात्मक नमूने गर्मी सदमे लहर जोखिम से पहले पर्याप्त सेल लगाव के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं बाँझ ग्लास coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए.
< p class = "jove_title" > 2. सदमे ट्यूब विधानसभा

< p class = "jove_content" > < img alt = "figure 2" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg"/>
< मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 : EVOC रिग और शॉक ट्यूब असेंबली. ( एक ) EVOC रिग की छवि । ( बी ) सदमे ट्यूब उपकरण की योजनाबद्ध । शॉक ट्यूब आयाम ५९ mm के एक आंतरिक व्यास और EVOC रिग, ४.१३ मीटर की कुल लंबाई सहित, शामिल हैं । संचालित ट्यूब की लंबाई और EVOC रिग योग २.७१ मी. < a href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target = "blank" > इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. पहनने इस्पात-पैर की अंगुली काम जूते और विधानसभा प्रक्रियाओं के दौरान एक प्रयोगशाला कोट ।
  2. दो बोल्ट आउटलेट निकला हुआ किनारा के क्षैतिज विमान में पाया छेद के माध्यम से दो संरेखण सलाखों डालें । जगह एक नाइट्राइल-रबर गैसकेट शीट संरेखण सलाखों के अंत में इतना है कि यह आउटलेट निकला हुआ किनारा और पूर्व vivo अंग संस्कृति (EVOC) रिग के बीच बैठता है ।
    नोट: EVOC रिग ३५ mm पेट्री व्यंजन के साथ उपयोग के लिए इरादा एक कस्टम डिजाइन स्थिरता है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ).
  3. संरेखण सलाखों पर स्थिरता फिसलने से सदमे ट्यूब के आउटलेट निकला हुआ किनारा करने के लिए EVOC रिग देते हैं, यह सुनिश्चित करना है कि यह सही ढंग से केंद्रित ताकि खंड है कि पेट्री पकवान रखती है अपने बेस पर स्थित है ।
  4. शेष छेद में चार M24 बोल्ट और वाशर डालें । नट की स्थिति इतनी है कि वे निकला हुआ किनारा स्पर्श ।
  5. कसकर EVOC रिग और सदमे ट्यूब सफलतापूर्वक गठबंधन किया है कि नेत्रहीन जाँच whilst एक तिरछे सममित फैशन में पागल और बोल्ट अनुक्रमिक जकड़ना.
  6. EVOC रिग के लिए एक दबाव transducer देते हैं और यह एक संवेदक केबल का उपयोग कर वर्तमान स्रोत से कनेक्ट. फिर, एक BNC केबल का उपयोग कर, वर्तमान स्रोत आस्टसीलस्कप.
    7. करने के लिए कनेक्ट करें
  7. सुनिश्चित करें कि सभी रिलीज वाल्व और सदमे ट्यूब पर प्रवाह नियंत्रण बंद हो रहे हैं । अंतर्निहित बाहरी संपीड़ित एयर लाइन खोलें और मैन्युअल रूप से २.५ बार solenoid को चार्ज करने के लिए दबाव नियामक दक्षिणावर्त चालू करें.
  8. ने संपीडित गैस की बोतल पर सेफ्टी वॉल्व खोलकर उसे बंद कर anticlockwise १८० & #176;.
  9. धीरे दबाव नियामक, गैस की बोतल के शीर्ष पर स्थित बारी, लगभग 15 बार करने के लिए दबाव बढ़ाने के लिए दक्षिणावर्त.
    नोट: इस नियामक की सेटिंग बिंदु मोटे डायाफ्राम के सबसे अधिक फट दबाव है कि प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा है ऊपर थोड़ा होना चाहिए ।
  10. 10 सेमी x 10 सेमी चौकों में एक ०.१२५ mm-मोटी प्लास्टिक शीट काटने से डायाफ्राम तैयार करते हैं ।
    नोट: डायाफ्राम की मोटाई फट दबाव के साथ सहसंबंधी बनाना होगा, सदमे की लहर की चोटी के दबाव में फेरबदल ( यानी, एक मोटा डायाफ्राम एक बड़ा शिखर दबाव के साथ एक सदमे की लहर में परिणाम होगा; टेबल १ ).
< टेबल फो: रख-जुलकर रहें । भीतर-पृष्ठ = "1" > Mylar डायाफ्राम आयाम (सेमी) फट दाब (bar) संवेदक 3 दाब रेंज (केपीए) 10 x 10 x ०.०२३ 2 & #177; ०.२ ४७ & #177; ७.५ 10 x 10 x ०.०५० 4 & #177; ०.२ ७२ & #177; ७.५ 10 x 10 x ०.१२५ ९.५ & #177; ०.५ १२७ & #177; १२.५ < p class = "jove_content" > तालिका 1: फट दबाव इसी डायाफ्राम मोटाई और पीक दबाव के लिए ।

< राजभाषा प्रारंभ = "11" >
  • टेप से बाहर संभालती बनाने के लिए, उन्हें डायाफ्राम के ऊपर और नीचे करने के लिए ठीक है, और उन्हें ध्यान से ब्रीच चैंबर द्वारा सामने छोटे निकला हुआ किनारा डायाफ्राम के बगल में स्थिति के लिए उपयोग. सुनिश्चित करें कि डायाफ्राम सीधे और सही ढंग से ब्रीच बंद करने से पहले तैनात है ।
  • यह चार M24 बोल्ट और पागल का उपयोग कर सुरक्षित । कसकर नट और बोल्ट क्रमिक रूप से एक तिरछे सममित फैशन में जकड़ना ।
    • < p class = "jove_title" > 3. बस सदमे लहर जोखिम से पहले कोशिकाओं की तैयारी

    1. पराबैंगनी नसबंदी के प्रदर्शन से एक ऊतक लामिना प्रवाह हूड तैयार करते हैं । यह एक संक्रामक समाधान और ७०% इथेनॉल के साथ साफ । सभी वस्तुओं को संभालने के लिए की जरूरत से पहले कोशिकाओं को इकट्ठा/बाद शॉक वेव जोखिम और उंहें बाँझ डाकू के भीतर जगह है ।
      नोट: यह ताजा मध्यम, चिपकने वाला गैस-पारगंय झिल्ली, बाँझ कैंची, पिपेट, और पिपेट सुझाव भी शामिल है.
    2. १ ९० mm पेट्री डिश से बाँझ डाकू के लिए तीन प्रयोगात्मक नमूनों युक्त पकवान हस्तांतरण ।
    3. एक चिपकने वाला गैस-पारगंय झिल्ली शीट में कटौती (सामग्री के तालिका देखें) छह चौकों में, इस तरह कि प्रत्येक काफी बड़ा है १ ३५ mm पेट्री डिश के शीर्ष को कवर ।
    4. महाप्राण ३५ mm पेट्री डिश से मध्यम, ढक्कन जगह एक तरफ, और दो चिपकने वाला गैस पारगंय झिल्ली वर्गों के साथ कवर, यह सुनिश्चित करना है कि वहां झिल्ली और पकवान के किनारे के बीच एक तंग सील है ।
    5. EVOC रिग के लिए नमूना हस्तांतरण और स्थिरता के आधार के लिए इतना सुरक्षित है कि पकवान के शीर्ष सदमे ट्यूब के भीतरी आधार के साथ गठबंधन है ।
    < p class = "jove_title" > 4. शॉक ट्यूब ऑपरेशन

    1. शॉक ट्यूब सिस्टम ज़ोर जब कान रक्षकों, आंख चश्मे, सुरक्षा जूते, और एक प्रयोगशाला कोट पहनते हैं ।
    2. झटका ट्यूब करने के लिए संकुचित हवा सिलेंडर को जोड़ने लचीला नली में प्रवाह करने के लिए गैस की अनुमति, नियामक दक्षिणावर्त पर प्रवाह नियंत्रण घुंडी बारी.
    3. नियंत्रण कक्ष के नीचे, या तो का चयन करें & #34;D ouble ब्रीच & #34; एक छोटी अवधि के झटके wav के लिए प्रवेशई या द & #34;D नदी ट्यूब & #34; एक वृद्धि की लहर अवधि के लिए प्रवेश.
    4. डीसी शक्ति स्रोत पर स्विच और तरंग डेटा प्राप्त करने के लिए आस्टसीलस्कप. आस्टसीलस्कप नमूना दर सेट करने के लिए ५०.० MS/s, एक रिकॉर्ड की लंबाई के साथ 1 M अंक. 2 बार और ऊपर 4 बार के लिए १०० एमवी पर गोलीबारी के लिए ५० एमवी की एक सीमा निर्धारित करें ।
    5. नियंत्रण कक्ष के विपरीत दीवार पर स्विच का उपयोग कर सुरक्षा रोशनी पर बारी ।
      नोट: यह अंय शोधकर्ताओं को कमरे में प्रवेश नहीं जब सदमे ट्यूब चार्ज है बताता है ।
    6. चालू solenoid नियंत्रण बॉक्स को बंद करने के लिए solenoid.
      नोट: यह सुरक्षा सुविधा डबल ब्रीच चैंबर पर स्थित एक वाल्व बंद कर देता है, सिस्टम के लिए अनुमति देने के लिए चार्ज किया जाएगा ।
      7. नियंत्रण कक्ष पर
    7. धीरे धीरे संपीड़न चैंबर के भीतर दबाव बढ़ाने के लिए घुंडी सुइयों मोड़ द्वारा प्रवाह नियंत्रण खुला. नियंत्रण कक्ष प्रदर्शन का उपयोग कर दबाव मॉनिटर.
    8. एक बार डायाफ्राम फट दबाव तक पहुंच गया है, डायाफ्राम टूटना होगा और एक & #34; बंग & #34; सुना जाएगा । जल्दी घुंडी मोड़ से प्रवाह नियंत्रण बंद करो.
      नोट: झटका लहर नीचे सेल नमूना पर ट्यूब और ट्यूब के अंत से बाहर यात्रा करेंगे ।
    9. solenoid नियंत्रण बॉक्स पर स्विच बंद करके solenoid खोलने के लिए और सुरक्षा प्रकाश स्विच (नियंत्रण कक्ष के सामने दीवार पर स्विच का उपयोग कर).
    10. बाँझ डाकू के लिए सेल नमूना हस्तांतरण, चिपकने वाला गैस-पारगंय झिल्ली को हटाने, और ताजा विकास माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ पकवान भरें । कोशिकाओं को मूल्यांकन के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में 5 चरण में वर्णित है, या अब के लिए मशीन को लौट अवधि के अध्ययन ।
    < p class = "jove_title" > 5. सेल व्यवहार्यता

    1. एक redox संकेतक परख और जीने और मृत कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट इमेजिंग के संयोजन का उपयोग कर सदमे वेव जोखिम निंनलिखित सेल व्यवहार्यता का आकलन ।
      नोट: फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं 1 खंड के दौरान बाँझ ग्लास coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए: सेल संस्कृति और नमूना तैयारी । ये ३५ मिमी पेट्री व्यंजन के भीतर रखा जा सकता है ।
    2. अंतरण २०० & #181; redox के अभियोगी रिएजेंट के एल (सामग्री की तालिका देखें) सीधे उन्हें मध्यम पद के झटके लहर जोखिम के 2 मिलीलीटर के साथ फिर से भरने के बाद प्रत्येक प्रयोगात्मक डिश के लिए । 4 एच
      3. के लिए मानक संस्कृति की स्थिति में मशीन प्रत्येक डिश के लिए
    3. , स्थानांतरण (एक अंधेरे बाँझ डाकू में) 2 x १०० & #181; L aliquots या तो एक काला या स्पष्ट ९६-अच्छी तरह से प्लेट, पर निर्भर करता है कि क्या प्रतिदीप्ति या अवशोषक व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    4. हस्तांतरण ९६-अच्छी तरह से प्लेट सही फिल्टर के साथ सज्जित एक उपयुक्त प्लेट रीडर करने के लिए और प्रतिदीप्ति या ५७० एनएम के लिए एक ६०० एनएम संदर्भ के साथ संयुक्त के लिए उत्तेजना बैंड 530ex/590em का उपयोग कर पढ़ें । निर्यात करें और डेटा को सहेजें.
    5. सदमे वेव-उजागर नमूनों और गैर उजागर नियंत्रण के बीच किसी भी अंतर की पहचान करने के लिए डेटा का विश्लेषण, के रूप में यह सेल व्यवहार्यता में एक बूंद का संकेत कर सकते हैं.
      नोट: एक नकारात्मक नियंत्रण भी प्रयोगात्मक डिजाइन में शामिल किया जाना चाहिए । इसके अलावा, एक मानक वक्र के प्रक्षेप सेल संख्या की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    6. महाप्राण redox संकेतक रिएजेंट युक्त माध्यम है । यह ताजा माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें और 24 घंटे के लिए मानक संस्कृति की स्थिति में कोशिकाओं मशीन
    7. एक दूसरी व्यवहार्यता समय बिंदु प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में उपरोक्त चरणों को दोहराएँ ।
      8. जियो और मृत कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए
    8. , मध्यम महाप्राण और पंजाब के 1 मिलीलीटर में दो बार कोशिकाओं को धो लें । स्थानान्तरण १०० & #181; L को इमेजिंग किट में पाया गया पूरा रिएजेंट (सामग्री के तालिका देखें) प्रत्येक नमूना और कमरे के तापमान पर गर्मी के लिए प्रकाश से संरक्षित 15 min.
    9. महाप्राण रिएजेंट और पंजाब के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर एक बार धो लें । ठीक बात संदंश का प्रयोग, ध्यान से ३५ mm पकवान से coverslip हटाने और यह जगह एक गिलास माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर चेहरा नीचे ।
    10. प्रत्येक नमूने के लिए छवियों का अधिग्रहण एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (10x उद्देश्य लेंस, ०.५० संख्यात्मक एपर्चर) सही उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर (पूर्व/em ४८८ एनएम/515 एनएम और ५७० एनएम/
      के साथ सज्जित नोट: लाइव कोशिकाओं तीव्र, वर्दी, हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन होगा । मृत या मर कोशिकाओं एक समझौता सेलुलर झिल्ली के साथ मृत किट घटक, लाल प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन में जिसके परिणामस्वरूप, सेल के परमाणु क्षेत्र में मुख्य रूप से पाया जाएगा ।
    11. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए या तो मैंयुअल रूप से या स्वचालित रूप से प्रत्येक छवि से जीवित और मृत कोशिकाओं की संख्या गिनती ।

    Representative Results

    ऊपर वर्णित विधि का उपयोग करना, एक monolayer में उगाई कोशिकाओं सदमे ट्यूब (चित्रा बी) का उपयोग कर उत्पन्न आघात तरंगों को तपसिल में उजागर किया गया था । सेल व्यवहार्यता के मार्करों का मूल्यांकन किया गया । एक redox संकेतक परख का प्रयोग, यह पाया गया कि एक १२७ केपीए सदमे की लहर के आवेदन के लिए काफी papilla कोशिकाओं की व्यवहार्यता को कम करने में सक्षम था के बाद नियंत्रण की तुलना में 24 संस्कृति में एच (चित्रा 3) । एक सदमे की लहर ≤ ७२ केपीए के आवेदन व्यवहार्यता कम नहीं किया । इन टिप्पणियों का समर्थन करने के लिए, एक फ्लोरोसेंट छवि परख के लिए हरी या लाल fluorophores, क्रमशः के साथ रहते है या मृत कोशिकाओं लेबलिंग में सक्षम, इस्तेमाल किया गया था । जैविक प्रतिकृति प्रति 13 फ्लोरोसेंट छवियों से रहते है और मृत कोशिकाओं के ठहराव १२७ केपीए सदमे की लहर को उजागर उन में कोशिका व्यवहार्यता में कमी का प्रदर्शन किया जब नियंत्रण की तुलना में (चित्रा 4) । सांख्यिकीय विश्लेषण एक तरह से Tukey के कई तुलना परीक्षण द्वारा पीछा ANOVA का उपयोग किया गया था, p & #60 के साथ, ०.०५ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण समझा । समूह प्रति नमूना आकार redox संकेतक परख और ३९ मात्रात्मक प्रतिदीप्ति इमेजिंग विश्लेषण के लिए के लिए 9 totaled ।

    Figure 3
    चित्र 3 : Redox संकेतक परख सदमे लहर जोखिम के बाद सेल व्यवहार्यता के समय पाठ्यक्रम दिखा डेटा । काफी कम कोशिकाओं १२७-केपीए सदमे वेव-उजागर समूह में जब अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में 24 घंटे के बाद मनाया गया । नकारात्मक नियंत्रण है कि 2% संक्रमित के साथ एक 30-s उपचार के शामिल (सामग्री की मेज देखें) दोनों टी0 और 24 एच में काफी कम कोशिकाओं से पता चला अंय सभी समूहों की तुलना में । प्रत्येक बार मतलब ± 1 मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करता है; जैविक प्रतिकृति, N = 3; तकनीकी प्रतिकृति, n = 3 । = p & #60; ०.०००१. * = p & #60; ०.०५. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्र 4 : प्रतिदीप्ति इमेजिंग. (A) मात्रात्मक डेटा लाइव और मृत कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियों से इकट्ठा 24 एच के बाद सदमे लहर जोखिम में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कब्जा कर लिया । काफी कम व्यवहार्य कोशिकाओं १२७ केपीए में मनाया गया (मतलब = ९३.४२) शॉक वेव-४७ केपीए की तुलना में नमूना उजागर (= ९८.१८ मतलब है), ७२ केपीए (मतलब ९८.८७ =), और नियंत्रण समूह (= ९९.१० मतलब है) । कोई व्यवहार्य कोशिकाओं 24 घंटे के बाद नकारात्मक नियंत्रण समूह पर मनाया गया (= 0 मतलब) । (B) प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां । ग्रीन लाइव कोशिकाओं से पता चलता है, whilst लाल मृत कोशिकाओं से पता चलता है । प्रत्येक बॉक्स भूखंड Tukey मूंछ के साथ ऊपरी और निचले quartiles से पता चलता है; जैविक प्रतिकृति, N = 3; तकनीकी प्रतिकृति, n = 13 । = p & #60; ०.०००१. स्केल बार = ३०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Discussion

    प्राथमिक विस्फोट की घटनाओं के लिए जोखिम से प्राप्त चोटों अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं हैं । पहचान और इस तरह के दर्दनाक मस्तिष्क चोट3,4 और heterotopic हड्डी6,7के रूप में विस्फोट प्रेरित चोटों, ट्रिगर कि तंत्र को समझने, विकसित करने के लिए पहले कदम महत्वपूर्ण हैं प्रोफिलैक्सिस के प्रभावी तरीके । इस लक्ष्य को प्राप्त करने में मदद करने के लिए, प्रयोगात्मक प्रणालियों के एक नंबर विस्फोट घटना जोखिम को दोहराने के लिए विकसित किया गया है11,12,13,14,18,19 . तकनीक यहां वर्णित सदमे ट्यूब उपकरण (चित्रा 2) पूरे शरीर (यानी, कुतर), ऊतक, या सेल के नमूने पर दबाव की एक सीमा पर सदमे तरंगों फायरिंग में सक्षम का उपयोग करता है । व्यक्तिगत कोशिका प्रकार लोड करने की क्षमता के बजाय पूरे ऊतकों अलग सेलुलर प्रतिक्रियाओं को पार्स करने की क्षमता देता है, के रूप में क्षति समवर्ती तंत्र की एक श्रृंखला के माध्यम से हो सकता है,2. उदाहरण के लिए, दर्दनाक मस्तिष्क चोट मॉडल करने के लिए, कोशिका-विशिष्ट चोट की पहचान के लिए अनुमति दे सकते हैं, जैसे न्यूरॉन्स और astrocytes के रूप में व्यक्तिगत कोशिका प्रकार के आकलन. इसके अलावा, पूरे अंग प्रतिक्रिया मस्तिष्क ऊतक का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । दोनों व्यक्तिगत कोशिका प्रकार और ऊतक नमूनों मूल्य है और विभिंन जानकारी दे सकते हैं । यह भी हवा की राशि है कि डबल ब्रीच या चालक-ट्यूब प्रवेश का चयन करके सदमे उत्पंन दबाव है बदलने के लिए संभव है । यह सदमे की लहर की अवधि को नियंत्रित करता है । एक और संभावना के लिए डायाफ्राम सामग्री और मोटाई बदलने के लिए पीक दबाव25बदल रहा है ।

    एक और पहलू पर विचार करने के लिए हस्तक्षेप अंत प्रभाव है कि उपस्थित किया जा सकता है जब नमूना आवास इस तरह के रूप में है कि वर्तमान प्रणाली में वर्णित EVOC रिग पर पाया सदमे ट्यूब, के निकास के पास स्थित है । चंद्र एट अल. एक संपीड़न चालित झटके ट्यूब पर विभिन्न स्थानों पर पाया विस्फोट वेव प्रोफाइल पर देखा और पाया कि Friedlander तरंग सबसे अच्छा सदमे ट्यूब के भीतर गहरी एक स्थान पर प्रतिनिधित्व किया गया था15. Kuriakose एट अल. इसके अलावा नमूना के माध्यमिक लदान का अध्ययन किया और पाया कि सदमे ट्यूब के अंत में एक अंत थाली के स्थान अवांछित परिलक्षित तरंगों को खत्म करने में सक्षम था16. इन प्रकाशनों में पाया डेटा15,16, भविष्य के संशोधनों को ध्यान में रखते हुए सदमे ट्यूब इस अनुच्छेद में वर्णित प्रणाली में सुधार के लिए प्रेरित ट्यूब के भीतर एक गहरे स्थान पर EVOC रिग के स्थान शामिल हो सकता है या, वैकल्पिक रूप से, सदमे ट्यूब पर एक अंत थाली के शामिल किए जाने । वर्णित विधि की सीमाएं नमूनों के अपेक्षाकृत कम प्रवाह को शामिल कर सकती हैं । एक एकल उपयोगकर्ता प्रति घंटे 6-8 नमूनों के एक उत्पादन में सुरक्षित रूप से सदमे ट्यूब संचालित कर सकते हैं । वर्तमान में, प्रणाली एकल ३५ मिमी पेट्री व्यंजन के उपयोग के आसपास बनाया गया है । इसलिए, एकाधिक समूहों और जैविक प्रतिकृति युक्त बड़े प्रयोगों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है ।

    इस तरीके लेख से पता चलता है कैसे अनुयाई चमड़े का papilla कोशिकाओं की व्यवहार्यता एक एकल सदमे की लहर को जोखिम से प्रभावित था । एक छोटी अवधि के सदमे की लहर (& #60; 10 ms) की ≤ ७२ केपीए व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं किया जब नियंत्रण की तुलना में (चित्रा 3 और चित्रा 4) । इसके विपरीत, १२७ केपीए में एक सदमे की लहर 24 एच के बाद में व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण गिरावट के बाद विस्फोट, दोनों एक redox संकेतक परख (चित्रा 3) और फ्लोरोसेंट छवि विश्लेषण (चित्रा 4) द्वारा दिखाए गए उत्तेजित । मिलर एट अल । चूहे organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृतियों में सेल व्यवहार्यता में एक समान कमी की सूचना दी जब कोशिकाओं को एक या तो एक १४७ केपीए या २७८ केपीए सदमे की लहर के लिए एक खुला समाप्त, हीलियम संचालित शॉक ट्यूब का उपयोग कर14को उजागर किया गया । इसके विपरीत, VandeVord एट अल. ने बताया कि वहां चूहे astrocytes में व्यवहार्यता पर कोई असर नहीं & #62 की एक छोटी अवधि के दबाव से अवगत कराया; २०० केपीए, हालांकि एक barochamber एक सदमे ट्यूब के बजाय18इस्तेमाल किया गया था । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बाहरी दबाव विस्फोट लहर पर निर्भर है, हालांकि इस शरीर के भीतर जटिल तनाव तरंगों बनाता है, इसलिए लोड हो रहा है अत्यधिक ऊतक या कोशिका के यांत्रिक गुणों पर निर्भर करने की प्रकृति । विस्फोट की घटनाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया के अतिरिक्त लक्षणात्मक अध्ययन की आवश्यकता है । इसके अलावा, सेलुलर स्तर पर सदमे लहर जोखिम का आकलन करके, के रूप में इस तकनीक में दिखाया गया है, जैविक प्रतिक्रियाओं के संकेत मार्ग या epigenetic परिवर्तन के गड़बड़ी के रूप में, चोट से ट्रिगर, पहचाना जा सकता है और आगे का पता लगाया ।

    अंत में, यह काम एक स्टेनलेस स्टील शॉक ट्यूब और एक संशोधित EVOC रिग प्राथमिक सेल संस्कृतियों को शामिल करने के उपयोग का वर्णन करता है । दबाव की एक सीमा पर सदमे तरंगों उत्पन्न किया जा सकता है और एक विस्फोट लहर के लिए जोखिम से होते हैं कि प्रभाव को दोहराने के लिए जीवित कोशिकाओं पर प्रचारित. यह प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है कि कोशिका व्यवहार्यता का मूल्यांकन कैसे करें, लेकिन व्यक्तिगत सेल प्रकारों में अब दीर्घकालिक परिवर्तन भी किए जा सकते हैं । आगे जा रहे हैं, हम अंतर प्रभाव है कि जटिल सदमे तरंगों अलग सेल प्रकार में, विस्फोट प्रेरित प्राथमिक चोटों के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के उद्देश्य के साथ, में लाना कर सकते है का आकलन करने की योजना है ।

    Disclosures

    लेखकों की कोई होड़ वित्तीय हितों की नहीं है ।

    Acknowledgments

    हम विस्फोट के लिए रॉयल ब्रिटिश सेना केंद्र के वित्तीय सहायता को स्वीकार करना चाहते है और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (M01858X/1) से चः करने के लिए हा और वित्त पोषण के लिए ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    MEM α, nucleosides ThermoFisher 22571020
    Fetal Bovine Serum, certified, US origin ThermoFisher 16000044 Supplement to create complete growth media.
    Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
    Penicillin-Streptomycin  ThermoFisher 15070-063 Supplement to create complete growth media.
    Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red ThermoFisher 15400-054 Dilute 1 in 10 before use.
    CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented Starlab CC7682-4875
    TC Dish (PS) 35 mm, 8.5 cm2 Triple Red TCD010035
    Petri dish (PS) 90 x 14.2 mm no vent VWR UK 391-0453 
    Gas Permeable Adhesive Plate Seals ThermoFisher AB-0718
    LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) ThermoFisher R37601
    Alamarblue cell viability reagent Fisher Scientific 13494309
    Virkon tablets VWR UK 115-0020 Use to create 2% solution as viability control reagent.
    Dumont forceps SurgicalTools 11295-10 Use to remove coverslips from petri dish.
    Cover glass, square VWR UK 631-0125
    Microscope slides VWR UK 631-1553
    96 Well plate, solid black AppletonWoods CC760 Plate to be used for fluorescence measurements.
    96 Well plate, clear, (PS) VWR UK 734-1799 Plate to be used for absorbance measurments.
    Leica DMi1 Camera stand outfit Leica Microsystems Optical microscope used for cell culture.
    Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton Zeiss Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.
    EnVision Multilabel Reader PerkinElmer 2104-0010A Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.
    Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm  RS Components 785-0782 Use to create shock tube diaphragm.
    Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.05 mm  RS Components 785-0786 Use to creatw shock tube diaphragm.
    Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.125 mm  RS Components 785-0798 Use to create shock tube diaphragm.
    Current source power unit Dytran Intruments Inc. 4103C Power source for 2300V1 sensor.
    IEPE Pressure Sensor Dytran Intruments Inc. 2300V1 Pressure sensor located on shock tube.
    Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO 4104B Use to gather and save sensor 2300V1 data.

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    References

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    Logan, N. J., Arora, H., Higgins, C. … More

    Logan, N. J., Arora, H., Higgins, C. A. Evaluating Primary Blast Effects In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e55618, doi:10.3791/55618 (2017).

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